总RNA提取

组织细胞总RNA提取步骤及方法

细胞总RNA提取是一种常用的实验技术，用于分离和提取细胞内的总RNA。以下是一种常用的细胞总RNA提取方法的步骤：

1.收集细胞样品：根据实验需要，收集适量的细胞样品。可以选择培养细胞、悬浮细胞或组织细胞等。

2. 细胞溶解：将细胞样品转移到离心管中，并使用适当的缓冲液（如TRIzol）进行细胞溶解。缓冲液中的离子和表面活性剂能够破坏细胞膜，使RNA释放到溶液中。

3.加入氯仿：向细胞溶解液中加入等体积的氯仿，并轻轻倒置离心管混匀。氯仿会与缓冲液中的酚类结合，形成有机相和水相。

4.离心分离：将混合液在高速离心下离心10-15分钟，使其分成有机相（上层）、界面层（中间层）和水相（下层）。RNA主要分布在界面层和水相之间。

5.收集上清液：使用滴管、移液器等工具小心收集上层的有机相液体，并转移到新的离心管中。这一步的目的是尽可能减少界面层和下层的干扰物。

6. 沉淀RNA：将等体积的异丙醇（isopropanol）加入上清液中，并轻轻倒置离心管混匀。异丙醇能够沉淀RNA，将其从溶液中去除。

7.离心分离：将混合液在高速离心下离心10-15分钟，使RNA沉淀在离心管底部形成一个白色沉淀。

8.去除上清液：小心将上清液倒掉，避免损失RNA沉淀。

9.RNA洗涤：使用70%乙醇洗涤RNA沉淀，将沉淀中的杂质去除。 10. 重新溶解：将洗涤后的RNA沉淀用RNase-free水或缓冲液中重新溶解，以便后续实验使用。注意要避免酶的污染。

以上是一种常见的细胞总RNA提取方法的步骤。这个方法简单、操作方便，并且能够高效地提取细胞内的总RNA。根据实验需要，也可以根据具体步骤来进行微调和改进。

总RNA提取的原理、步骤

1.原理及方法（异硫氰酸胍-酚-氯仿 一步法）

TRIZOL试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层（无色）主要为RNA，有机层（黄色）主要为DNA和蛋白质。

2.简易步骤

细胞或组织，加入0.4ml TRIZOL试剂后匀浆

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室温静置5分钟

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加入1/5 TRIZOL试剂体积量的氯仿，剧烈震荡混匀

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室温静置5分钟，12000g 4℃离心l5分钟

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将上清液转移至新的离心管中，加入与上清液等体积的异丙醇，颠倒混匀

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室温静置10分钟，12000g 4℃离心l0分钟，弃上清

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向沉淀中加入1ml的75%乙醇清洗沉淀，12000g 4℃离心5分钟

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弃上清保留沉淀，干燥

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沉淀物溶解于11μl的DEPC处理水中

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注意：以上操作应在生物安全柜内完成，以防止污染。

注意事项

①全程配戴一次性手套。皮肤经常带有细菌和霉菌，可能污染RNA的抽提并成为RNA酶的来源。培养良好的微生物实验操作习惯预防微生物污染。

②使用灭菌的，一次性的塑料器皿和自动吸管抽提RNA，避免使用公共仪器所导致的RNA酶交叉污染。 ③在TRIZOL中，RNA是隔离在RNA酶污染之外的。而对样品的后续操作会要求用无RNA酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿可以在150°C的烘箱中烘烤4小时。塑料器皿可以在0.5 M NaOH中浸泡10分钟，用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用。

④用TRIZOL抽提RNA时要戴手套和护眼罩。避免接触皮肤和衣服。在化学通风橱完成操作。避免呼吸道吸入。如无例外，所有的操作应该在15 -30°C的条件下完成，试剂亦在15 -30°C的条件下。

准备工作：（严格的去RNA酶条件）

器材：去RNA酶的15ml离心管、1.5mlEP管、PCR的EP管、蓝黄白枪头，专用移液枪，500ml试剂瓶*4，高压灭菌锅，4°离心机，振荡器。

试剂：苯酚，氯仿，异丙醇，无水乙醇，去RNA酶水、，DEPC, Trizol裂解液，双氧水， 50*TAE，RNA酶抑制剂，DNA酶，３mol/L乙酸钠（pＨ5.2），10*纯化buffer，终止buffer，琼脂糖凝胶粉末，Loading buffer（+EB的预染buffer）。

1、15ml离心管分装10ml的氯仿，异丙醇，无水乙醇，用去RNA酶水配制75%乙醇。分装1ml去RNA酶水。

2、500ml试剂瓶加500ml去离子水， 500ml试剂瓶加50*TAE10ml用去离子水定容到500ml，每瓶加DEPC（终浓度为0.01%,有毒，未高压灭菌前要小心），剧烈振荡混匀放置24小时后高压灭菌（降解DEPC）。

3、用DEPC处理过的水配制终浓度为3%的双氧水500ml（泡电泳槽，配胶板，锥心瓶用）。

RNA提取：

1、 准备去RNA酶的ep管，写好标签。

2、 洗净6孔板中的液体，用移液枪每孔加1mlPBS洗涤一次。

3、 用枪吸尽PBS，每孔加入1ml Trizol （有毒，最好通风橱里面加）裂解液（根据培养细胞孔的面积加入裂解液，6孔板加1ml即可），轻轻摇晃5min左右。

4、 用1ml的枪吹打细胞，使其充分脱离6孔板，将液体吸入准备好的ep管中（如果打算以后再做可放入-80°冰箱保存）。

5、 每管加入200ul氯仿（1ml加200ul），振荡使其充分混匀，冰上静置10min，这时可以预冷4°离心机。（如果是从-80°冰箱拿出的样品需待样品溶解后振荡混匀，室温平衡5min再进行该步骤）

6、 4°离心机14000g离心15min。此时准备新的ep管，每管加500ul异丙醇。

7、 将上清转移至准备的ep管中（不要吸到下层液体），混匀后放入-20°冰箱30min。

实验内容：鲫总RNA的提取与热休克蛋白基因的克隆

热休克蛋白( heat shock protein , HSP) 又称为应激蛋白,是生物细胞（包括原核细胞及真核细胞）在受热、生物应激、理化因素等应激原刺激后，发生热休克反应时所产生的一类在生物进化中最保守并由热休克基因所编码的伴随细胞蛋白。

热休克蛋白 是细胞在生理状态下必需而在应激状态时表达增多的一类保护性蛋白质，热休克蛋白对生体的意义是，可提高机体对不良环境的耐受性，保护机体或细胞在随后的致死性应激中不受或少受伤害，同时还具有保护、修复蛋白质，参与机体免疫、交叉保护等特性。。热休克蛋白根据其同源性及分子质量大小可分为3 个主要家族: HSP90 (85-90 ku) 、HSP70 (68-73 ku) 和小分子质量热休克蛋白。其中以HSP70 最为保守,研究的也最广泛，常被作为应激反应的分子指标。

一. 主要酶和试剂

Trizol Reagent、禽源反转录酶（AMV）、DEPC、Taq DNA聚合酶、RNA酶抑制剂、DNA Marker（DL2000）。

二．所需试剂的配制：

DEPC处理水（0.1‰）：1000 mL双蒸水中加入0.1 mL DEPC，过夜温育后高压灭菌。

1.5％琼脂糖：向100 mL的1×TAE中加入1.5g的琼脂糖。

50×TAE：750 mL双蒸水中溶解242 g Tris碱，加入57.1 mL乙酸，100 mL的0.5 mol/L 的EDTA（pH8.0），用双蒸水定容至1000 mL。使用时用双蒸水稀释为1×TAE。

三. 仪器与设备

PCR扩增仪；微量核酸蛋白检测仪；紫外凝胶成像仪；电热恒温水浴锅；制冰机；稳压稳流电泳仪；微型水平电泳槽

四. 实验方法

实验开始前，要将枪头、匀浆器等用0.1％DEPC水浸泡12h以上，然后高压灭菌、烘干机烘干（需提前准备）

1． 总RNA的提取

用TRIzoL Reagent试剂盒并按其说明书提取总RNA，其具体操作步骤如下：