贴壁细胞的脂质体转染protocol

siRNA细胞转染实验步骤
下面以Entranster-R4000试剂为例，说一下siRNA转染步骤（24孔板）
1.提前1天细胞种植
贴壁细胞：提前一天将细胞种植在24孔板中，以转染时细胞汇合度（Confluence）在30％左右为宜，转染前全培养基总量为0.45ml。

悬浮细胞：采用对数生长期的细胞，数量为常规培养细胞数的1/3进行转染实验。

如某细胞常规培养的细胞数是6×105，那么就用2×105的细胞进行转染。

2.转染过程
⑴取0.67ug(50pmol)的siRNA，加入一定量无血清稀释液，充分混匀，制成RNA稀释液，终体积为25μl。

注意：无血清稀释液建议采用OPTI-MEM、无血清DMEM或1640。

⑵取1ul的EntransterTM-R4000，然后加入24ul无血清稀释液体，充分混匀，制成EntransterTM-R4000稀释液，终体积为25μl。

室温静置5分钟。

⑶将EntransterTM-R4000稀释液和RNA稀释液充分混合（可用振荡器振荡或用加样器吹吸10次以上）混合，室温静置15分钟。

转染复合物制备完成。

⑷将50μl转染复合物滴加到有0.45ml全培养基（可含10%血清和抗生素）的细胞上，前后移动培养皿，混合均匀。

注意：对本试剂，采用含血清的全培养基有助于提升转染效率。

⑸转染后6小时观察细胞状态，如状态良好可不必更换培养基，继续培养24-96小时得到结果。

2022版 CTM694原英文技术手册TM694中 文 说 明 书适用产品目录号：E5911和E5912FuGENE ®4K TransfectionReagent普洛麦格(北京)生物技术有限公司Promega (Beijing) Biotech Co., Ltd 地址：北京市东城区北三环东路36号环球贸易中心B座907-909电话：************网址：技术支持电话：400 810 8133技术支持邮箱：*************************CTM 6942022制作1所有技术文献的英文原版均可在/ protocols 获得。

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电子邮箱：*************************1. 描述 (2)2. 产品组分和储存条件 (2)3. 一般注意事项 (2)3. A. 转染试剂与DNA的比例 (3)3. B. DNA (3)3. C. 时间 (3)3. D. 血清 (3)3. E. 细胞培养条件 (3)3. F. 稳定转染 (3)4. 推荐操作步骤 (4)4. A. 细胞铺板 (5)4. B. FuGENE® 4K Transfection Reagent准备 (5)4. C. 一般转染操作步骤 (6)4. D. 稳定转染操作步骤 (8)4. E. 转染优化 (9)4. F. 报告基因活性和细胞健康的多重检测方案 (11)5. 疑难解答 (12)FuGENE® 4K Transfection Reagent普洛麦格(北京)生物技术有限公司Promega (Beijing) Biotech Co., Ltd 地址：北京市东城区北三环东路36号环球贸易中心B座907-909电话：************网址：技术支持电话：400 810 8133技术支持邮箱：*************************CTM 6942022制作21. 描述FuGENE® 4K Transfection Reagent是一个多组分，非脂质体试剂，用于将DNA高效、低毒地转染至多种哺乳动物细胞系中，无需在加入试剂-DNA复合物后更换培养基。

脂质介导的短暂表达
实验材料
哺乳动物细胞
试剂、试剂
质粒DNA完全培养基氯化铯DMEM
盒
仪器、耗材
培养皿培养箱聚苯乙烯管
实验步骤
1. 按5×105细胞/孔的量在六孔板中接种指数期生长的细胞，在37℃ 5%CO2培养箱中
培养过夜，直至细胞80%汇片。

（如果用100 mm 培养皿代替六孔扳，则培养细胞至80%
汇片，将所有数量扩大8倍）
2. 在聚苯乙烯管中配制DNA/脂质体复合物如下：稀释质粒DNA至1 ml DMEM-SF中，
在旋涡混合器上振荡1 s 然后加入脂质体悬液、再次旋起混匀。

在室温下温育5~ 10 min，
使DNA与阳离子脂质体结合。

3. 吸去DMEM-SF培养液，用1 ml 的完全DMEM-SF洗1次，吸去DMEM-SF。

对毎
个35 mm 孔中，直接在细胞上加1 ml DNA/脂质体复合物。

在37℃培养箱中温育3~5 h。

4. 往每孔细抱中加入1 ml 的DMEM-20完全培养液，在37℃培养箱中继续温育24~48
h。

5. 吸去完全DMEM/DNA/脂质体复合物，毎孔加入2 ml 新的DMEM-10完全培养液，
继续搵育24~48 h。

6. 收集细胞：用细胞刮于刮下细胞，或胰蛋白酶消化或冻融裂解细胞。

进行适当的表
达分析。

脂质体进行稳定表达。

脂质体转染mrna细胞原理
脂质体转染mRNA细胞的原理是利用脂质体作为载体，将目的mRNA包裹在其内部，然后通过与细胞膜融合让mRNA进入细胞质，最终达到将目的mRNA表达出来的目的。

脂质体是由磷脂和胆固醇等组成的微小囊泡结构，与细胞膜结构相似。

其内部的疏水层可以容纳水溶性的物质，包括mRNA分子。

脂质体转染mRNA的步骤如下：
1. 准备目的mRNA：目的mRNA是指需要转染到细胞内进行表达的mRNA，可以是外源的mRNA，也可以是经过In vitro 转录合成的人工合成mRNA。

这些mRNA一般会在实验室中事先准备好。

2. 制备脂质体：将脂质体粉末或液体悬浮液溶解在适当的缓冲液中，形成脂质体溶液。

脂质体通过磷脂的双层结构来包裹mRNA，形成稳定的脂质体-mRNA复合物。

3. 混合脂质体与mRNA：将目的mRNA与脂质体溶液混合，并进行充分的混合和搅拌。

这样就可以使mRNA和脂质体发生相互作用，形成脂质体-mRNA复合物。

4. 转染细胞：将脂质体-mRNA复合物加入到需要转染的细胞培养液中，使其与细胞接触。

脂质体复合物会与细胞膜融合，从而使脂质体内的mRNA进入细胞质。

5. mRAN转录和表达：在细胞质中，脂质体释放的mRNA会
被细胞的核糖体识别，进而进行mRNA转录和翻译，最终使
该mRNA编码的蛋白质在细胞内得到表达。

脂质体作为转染载体具有一定的优势，如制备简单、生物相容性好等。

但是，脂质体转染也存在一些问题，如转染效率较低、引起细胞毒性等。

因此，在实际应用中需对转染条件进行优化，以提高转染效率和减少毒性。

Lipo2000 瞬时转染细胞步骤Stealth? RNAi or siRNA Transfection以24孔板为例，其余规格的转染见表11 中板，细胞密度为30-50%适宜。

注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。

C 将A B两管混合，放置20min。

转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。

将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。

Table 1. Culture Shared reagents DNA transfection RNAi transfection像293T细胞，因为半贴壁，换液容易导致细胞飘起来，所以中间不换液。

转染步骤及经验（精华）一、基础理论转染是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。

分类：物理介导方法：电穿孔法、显微注射和基因枪；化学介导方法：如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法：有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。

理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。

病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。

生素可以进入细胞。

这降低了细胞的活性，导致转染效率低。

所以，在转染培养基中不能使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。

这样，在转染前也不必润洗细胞。

对于稳定转染，不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是GENETICIN选择性抗生素的竞争性抑制剂。

另外，为了保证无血清培养基中细胞的健康生长，使用比含血清培养基更少的抗生素量。

3.细胞状态这点非常重要，不要急于求成，一定要让细胞处于最佳的生长状态再做。

有文献说传代不要超过17代。

细胞复苏后的3代左右时细胞状态最好，不要用传了很多代的细胞去做，细胞的形态都会发生变化。

脂质体转染原理
脂质体转染是一种常用的基因传递工具，可以将外源DNA有效地引导进入目标细胞。

其原理基于脂质体的特殊结构和细胞膜的特性。

脂质体是由疏水性和亲水性分子组成的结构，可以形成类似细胞膜的双层结构。

在细胞培养条件下，脂质体会与目标DNA 结合，形成脂质体/DNA复合物。

当脂质体/DNA复合物与目标细胞接触时，由于脂质体与细胞膜的亲和性，复合物可以通过与细胞膜融合的方式进入细胞。

一旦脂质体/DNA复合物进入细胞，复合物会被内吞作用包裹成内吞体，内吞体随后与溶酶体融合形成溶酶体内嘌呤体。

在溶酶体内，复合物会被酸性环境和溶酶体内含的酶分解，释放出DNA分子。

最后，释放出的DNA会进入到细胞核中，并与细胞核中的染色体相结合，启动目标基因的表达。

脂质体转染的原理可以归纳为三个步骤：脂质体与DNA结合形成复合物，复合物与细胞膜融合进入细胞，复合物在细胞内释放DNA并进入细胞核。

这个过程提供了一种可靠的手段，用于将外源DNA引导进入目标细胞，实现基因传递和表达。

Stealth™ RNAi or siRNA Transfection以24孔板为例，其余规格的转染见表11 中板，细胞密度为30-50%适宜。

注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。

2 第二天（24-36小时后）每个孔转染方式如下：A 将20pmol siRNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。

B 将1ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。

C 将A B两管混合，放置20min。

3 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。

将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。

Plasmid DNA TransfectionDNA(ug):lipo 2000(ul)=1:2-3转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。

1 中板。

贴壁细胞：0.5-2X105 cells/well，第二天待细胞密度达到90%以上时转染悬浮细胞：4-8X105 cells/well，中板后随即转染。

2 转染。

A 将0.8ug DNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。

B 将2ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。

C 将A B两管混合，放置20min。

转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。

将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。

Table 1. Culture Shared reagents DNA transfection RNAi transfection*：中板密度根据不同细胞不同实验有所不同，这里仅提的数据仅供参考**：6孔板细胞质粒转染量1-2ug足以。

***：6cm dish细胞质粒转染量4-6ug足以。

细胞转染准备：1．无抗生素培养基2．Opti－MEM ⅠReduced Serum Medium3．全培养基1、转染前细胞的处理（以35mm 培养皿为例）：贴壁细胞：在转染前一天，在35mm 培养皿中加入2 ml 无抗生素培养基培养一天，到转染时使细胞达到80％～90％的汇合率。

悬浮细胞:在制备混合物前，将4—8×105细胞用无抗生素培养基培养铺35mm 培养皿2、转染方法（以质粒DNA转染为例）2.1、制备质粒脂质体混合物，OPTI-MEM！1．将质粒溶于50 ul opti-mem 中，混匀室温静置5分钟；2．将脂质体溶于50 ul opti-mem 中，混匀室温静置5分钟；3．将两者混匀，室温静置5分钟（可能出现雾状沉淀，复合物在室温下六小时内稳定）。

2.2、加入培养皿中，温柔混匀；可在6小时后更换全培养基。

2.5、培养18－48个小时后，测量转染效率。

注：如有必要，转染前可用无抗生素无血清培养基。

细胞转染1、转染前细胞的处理（以35mm 培养皿为例）：贴壁细胞：在转染前一天，在35mm 培养皿中加入2 ml 无抗生素培养基培养一天，到转染时使细胞达到80％～90％的汇合率。

悬浮细胞:在制备混合物前，将4—8×105细胞用无抗生素培养基培养铺35mm 培养皿2、转染方法（以质粒DNA转染为例）A. 转染贴壁细胞（35 mm培养皿或6孔培养板）1. 对于每一个转染样本，按如下比例配制转染混合液：2.5 μg 质粒DNA7.5 μL GeneTranx μL 无血清DMEM（或其他无血清培养基, PBS,PBS）总体积100 μL2.用枪头吹打混匀，放置于室温20-40min。

3. 将混合液加入细胞培养皿中，晃动培养皿混匀培养液。

放入CO2培养箱。

注：血清浓度对于转染效果无影响，经测试高达20%的胎牛血清浓度也不会对转染效果产生影响。

4. 在转染后的18-48小时之间，对细胞进行换液。

细胞实验的基本操作【细胞培养】一、细胞的复苏：非原代培养的细胞一般冻存于液氮之中，需要培养时要先从液氮中取出使之复苏。

细胞复苏的原则——快速融化：必须将冻存在－196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。

具体操作如下：1、实验前准备：1.1、将水浴锅预热至37℃，并将含10%FBS的培养液置于其中预热；。

1.2、用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。

1.3、在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。

2、取出冻存管及迅速解冻：2.1、根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。

2.2、从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。

2.3、迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化，约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。

3、平衡离心将细胞悬液吸到离心管中，1000～1500rpm离心3分钟；4、制备细胞悬液吸去上清液，加入10 ml培养液，用吸管轻轻吹打均匀，使细胞悬浮；5、细胞计数细胞浓度以5×105/ml为宜。

6、培养细胞将复合细胞计数要求的细胞悬液吸到培养瓶中，将培养瓶放入37℃和5％CO2的培养箱内培养（略微拧松培养瓶盖），换液的时间由细胞情况而定。

通常，除少数特别注明对DMSO 敏感的细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，可直接放入含有10-15ml（5－10倍）新鲜培养基的培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附的问题。

二、细胞的传代：培养的细胞生长至一定密度之后，由于培养液中营养逐渐消耗、代谢物逐步积累（可见到培养液变黄），而且细胞的生长空间也受到限制，就会影响到细胞的继续生存。

这时就需要分离出一部分细胞和更新培养液，这一过程就叫做传代。