ZSCI肿瘤干细胞培养技术

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中盛溯源推出hiPSC-Luc-GFP细胞株

中盛溯源推出hiPSC-Luc-GFP细胞株hiPSC-Luc-GFP细胞株Rosa26位点是常⽤的基因敲⼊位点；敲⼊该位点的基因表达活性⾼，对旁侧基因影响较⼩。

利⽤CRISPR基因编辑技术，可将外源的基因⽚段定点插⼊到Rosa26位点，实现外源基因的稳定⾼表达。

Nuwacell™ hiPSC-Luc-GFP细胞株是由中盛溯源商品化hiPSC细胞株（RC01001-A）制得，利⽤CRISPR基因编辑技术，将Luc和GFP等基因⽚段定点插⼊到Rosa26位点，细胞可以⾼效的表达Luciferase和GFP，可在Nuwacell™ 科研级hPSC培养体系中可以长期稳定快速增殖，具有与⼈类胚胎⼲细胞（hESC）⾼度类似的克隆形态和基因表达，长期维持正常核型，并在体外（in vitro）和体内（in vivo）都具有完备的三胚层分化潜能。

适合科研⽤途的⼲细胞研究和应⽤。

Nuwacell™ hiPSC-Luc-GFP的优势稳定性⾼，后代表达⼀致能实现A基因在Rosa26位点及B基因在H11位点同时过表达外源基因表达不受旁侧基因影响，最⼤程度减少了对内源性基因的影响结合Cre-loxp系统，还可以构建条件（诱导）性过表达的⼩⿏模型细胞敲⼊基因信息▲Nuwacell™ 科研级hiPSC-Luc-GFP细胞株Rosa 26 位点敲⼊基因信息⽰意图。

细胞形态与⽣长情况▲连续培养的Nuwacell™ hiPSC-Luc-GFP细胞株（P30）细胞形态图⽰。

荧光倒置显微镜图⽰。

图A、B为正常传代DAY 2细胞图⽰，C、D为正常传代▲连续培养的Nuwacell™ hiPSC-Luc-GFP细胞株（P30）细胞形态图⽰。

荧光倒置显微镜图⽰。

图A、B为正常传代DAY 2细胞图⽰，C、D为正常传代DAY 3细胞图⽰。

标尺：100µm。

细胞GFP阳性率检测▲连续培养的Nuwacell™ hiPSC-Luc-GFP细胞株（P30）GFP阳性率检测，GFP表达阳性。

人结直肠肿瘤干细胞的分离培养与生物学特性

人结直肠肿瘤干细胞的分离培养与生物学特性马丽君;王立斌;李海;叶萍;谢晓亮;李玉奎;杨银学【期刊名称】《肿瘤防治研究》【年(卷),期】2014()4【摘要】目的从人结直肠肿瘤细胞中分离培养结直肠肿瘤干细胞(Colon cancer stem cells)并研究其生物学特性。

方法采用有限稀释法筛选分离具有连续克隆能力的单细胞,通过MTT比色法对其体外增殖能力进行鉴定,流式细胞仪分析细胞表面标记CD133、CD166、CD24、CD47、CD200、CD90、CD44、EPCAM的表达情况;PCR检测Oct4、Sox2、Nanog、C-myc等相关基因的表达,实时荧光定量PCR检测其表达量。

结果三例能够形成肿瘤球的原代培养细胞CD166阳性细胞所占比例分别为61.9%、52.4%、47.8%,CD47阳性细胞所占比例分别为99.8%、97.2%、99.9%;不能形成肿瘤球的原代培养细胞中CD166阳性细胞为10.8%,CD47阳性细胞为0.1%;CD133、EPCAM、CD24、CD200四个表面标记在两种细胞中的表达均低于0.5%,CD44、CD90在两种细胞中的表达均高于95%;与原代细胞相比,克隆细胞具有较强的体外增殖能力并且高表达Oct4(P<0.05)、C-myc(P<0.01)及Sox2基因,不表达Nanog基因。

结论人结直肠肿瘤中存在具有自我更新和增殖潜能的结直肠肿瘤干细胞,在体外可将其分离、培养和纯化。

【总页数】5页(P345-349)【关键词】结直肠肿瘤;肿瘤干细胞;克隆细胞【作者】马丽君;王立斌;李海;叶萍;谢晓亮;李玉奎;杨银学【作者单位】宁夏医科大学总医院干细胞研究所;宁夏医科大学总医院结直肠外科【正文语种】中文【中图分类】R735.34【相关文献】1.人脐带间充质干细胞分离培养条件的优化及其生物学特性 [J], 王怡;尹艳丽2.人脐带间充质干细胞体外分离培养及其生物学特性的研究 [J], 韩潇;白海;赵强;杨柯;欧剑锋3.高龄老年人牙髓干细胞分离培养与生物学特性分析实例报告 [J], 乔朋艳;刘洪臣4.人尿源性干细胞的分离培养及生物学特性 [J], 赵长辉;哈木拉提•吐送;木拉提•热夏提;王峰;马军;安尼瓦尔•牙生5.人尿源性干细胞的分离培养及生物学特性 [J], 赵长辉;哈木拉提.吐送;木拉提.热夏提;王峰;马军;安尼瓦尔.牙生;因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

ZEB1蛋白与恶性肿瘤干细胞相关通路鉴定

ZEB1蛋白与恶性肿瘤干细胞相关通路鉴定肿瘤干细胞（CSCs）是一种具有自我更新和多向分化能力的细胞群体，被认为是肿瘤发展和复发的关键因素。

准确鉴定和了解与肿瘤干细胞相关的通路对于深入研究肿瘤发展和治疗具有重要意义。

本文将探讨ZEB1蛋白与恶性肿瘤干细胞相关的通路鉴定。

ZEB1蛋白是一种转录因子，与肿瘤发展和转移相关。

研究表明，ZEB1蛋白在多种恶性肿瘤中过度表达，与肿瘤细胞的侵袭性、转移能力以及耐药性密切相关。

在肿瘤干细胞中，ZEB1蛋白的表达也被广泛报道。

因此，我们有理由相信ZEB1蛋白在恶性肿瘤干细胞中可能发挥重要的作用。

首先，我们需要确认ZEB1蛋白与恶性肿瘤干细胞的相关性。

已有研究表明，ZEB1蛋白的表达水平在肿瘤干细胞中明显升高。

肿瘤干细胞的典型标志物如CD133、CD44等也与ZEB1蛋白的过度表达密切相关。

进一步的研究发现，抑制ZEB1蛋白的表达可以降低肿瘤干细胞的自我更新和侵袭性能力。

通过这些研究，我们可以初步确定ZEB1蛋白与恶性肿瘤干细胞的相关性。

接下来，我们需要进一步研究ZEB1蛋白在恶性肿瘤干细胞中的作用机制。

研究发现，ZEB1蛋白通过调节多个信号通路参与恶性肿瘤干细胞的自我更新和分化过程。

例如，ZEB1蛋白可以通过抑制miR-200家族的表达，促进肿瘤干细胞的干性特征维持。

此外，ZEB1蛋白还通过调节Wnt/β-catenin通路、Akt/mTOR信号通路等促进肿瘤干细胞的侵袭和转移能力。

进一步研究这些信号通路在ZEB1蛋白调节的肿瘤干细胞中的作用，有助于我们深入了解肿瘤干细胞的分子机制。

除了探究ZEB1蛋白在肿瘤干细胞中的作用机制，我们还需要研究ZEB1蛋白对肿瘤治疗的影响。

ZEB1蛋白的过度表达已被证实与肿瘤细胞的耐药性相关。

一项研究发现，抑制ZEB1蛋白可以增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。

此外，通过抑制ZEB1蛋白，可以降低肿瘤干细胞的耐药性，从而提高肿瘤治疗的有效性。

造血干细胞培养

造血干细胞培养造血干细胞是一类具有自我更新和分化能力的细胞，能够持续产生各种成熟的血细胞。

在人体造血系统中，造血干细胞起着至关重要的作用，它们能够不断地分裂和分化，以满足机体对血细胞的需求。

然而，由于某些疾病或外界因素的干扰，造血干细胞的功能可能受到损害，这就需要进行造血干细胞的培养。

造血干细胞培养是指在体外人工培养条件下，利用特定的培养基和因子，使原始的造血干细胞能够持续增殖和分化，以获得大量的干细胞。

这种培养技术的发展，为临床治疗提供了重要的资源和方法。

造血干细胞培养的关键是提供适宜的培养环境和因子。

首先，培养基的选择非常重要。

培养基中应包含适当的营养物质和生长因子，以支持干细胞的生长和分化。

同时，培养基还应具备维持细胞健康和增殖的功能。

现在，已经开发出多种不同的培养基，如StemPro® HSC Expansion Medium和X-VIVO 10等，可以满足不同类型的干细胞的需求。

培养过程中的因子也是至关重要的。

这些因子能够促进干细胞的增殖和分化。

常用的因子包括血小板衍生生长因子（PDGF）、骨髓基质细胞衍生生长因子（SCF）、造血细胞因子（HSC）、血管内皮细胞生长因子（VEGF）等。

这些因子可以通过添加到培养基中，提供给细胞，以促进其增殖和分化。

在培养过程中，还需要注意对细胞的处理和培养条件的控制。

首先，需要从合适的来源中获取到造血干细胞，如骨髓或外周血。

然后，通过特定的方法分离和富集干细胞，以获取纯度较高的种群。

接下来，将干细胞种植到预先准备好的培养基中，进行培养。

在培养过程中，需要控制培养皿的温度、湿度和氧气浓度等条件，以提供适宜的环境。

在培养过程中，可以通过不同的方法监测细胞的增殖和分化情况。

常用的方法有流式细胞术、定量PCR和免疫组织化学等。

这些方法可以帮助研究人员了解细胞的状态，并进行进一步的调控。

造血干细胞培养的应用非常广泛。

首先，它可以用于临床治疗。

对于一些血液系统的疾病，如白血病、再生障碍性贫血等，造血干细胞移植是一种常用的治疗方法。

msc的培养方法总汇

msc的培养方法总汇MSC（主动子细胞）是一种常见的培养方法，用于研究和生产细胞系。

本文将总结MSC的培养方法，并提供一些有关培养MSC的实用技巧。

一、基本培养条件1. 培养基：常用的MSC培养基包括DMEM/F12、α-MEM和RPMI 1640等。

这些培养基通常会添加10-20%的胎牛血清(FBS)或人血清。

此外，还可以添加一些辅助因子，如L-谷氨酸、抗生素和抗真菌药物等。

2. 温度和湿度：MSC的培养通常在37℃下进行，湿度保持在95%以上。

3. CO2浓度：将CO2浓度保持在5%～10%可以提高MSC的生长速度和细胞增殖率。

4. 培养皿：培养MSC可使用培养皿、培养瓶或多孔板等。

根据需求选择合适的培养器具。

二、细胞传代1. 细胞密度：在细胞达到80%-90%的密度时，进行细胞传代。

过高的密度可能导致细胞凋亡或细胞间粘连。

2. 细胞分离：可以使用胰酶、胆酸酯酶等消化酶将MSC从培养器具上分离下来。

分离过程需要控制时间和酶的浓度，以避免损伤细胞。

3. 细胞计数：使用细胞计数仪准确计数MSC的数量，以便进行下一步的传代或实验。

4. 细胞接种：将适量的MSC接种至新的培养器具中，并添加新的培养基。

三、细胞鉴定1. 表面标记物：使用流式细胞术或免疫细胞化学染色等技术，检测MSC表面的标记物，如CD73、CD90和CD105等。

2. 三向分化：MSC具有多向分化潜能，可以分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞。

通过特定的培养条件和染色方法，可以确定MSC 的分化潜能。

3. 基因表达：使用实时荧光定量PCR等技术，检测MSC中特定基因的表达水平，以评估其多向分化潜能和干细胞特性。

四、细胞扩增与冻存1. 细胞扩增：通过适当的培养条件和传代方法，可以扩增MSC的数量。

需注意控制细胞密度和培养时间，避免细胞过度增殖或老化。

2. 细胞冻存：将MSC冻存可用于长期保存和后续实验。

在冻存前，使用适当的细胞冻存液和冷冻容器，遵循正确的冷冻和解冻步骤。

细胞培养：干细胞的培养

成体干细胞
➢ 是成体组织内具有自我更新及分化一种或一种以上子细胞的未成熟细胞。
➢ 来源于成体组织或器官，一般具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织。为多能干细胞或单能干细胞，如造血干细胞和上皮干细胞等。
12
3、根据干细胞组织发生的名称进行分类:
➢胚胎干细胞 ➢造血干细胞 ➢骨髓间质干细胞 ➢肌肉干细胞 ➢成骨干细胞 ➢内胚层干细胞 ➢视网膜干细胞 ➢胰腺干细胞
19
山中伸弥
约翰·伯特兰·格登
（Shinya Yamanaka）（ John Bertrand Gurdon）
2012年的诺贝尔生理学或医学奖获得者
20
山中伸弥
1962年出生于日本大阪府，日本医学家，京都大学再生医科研究所干细胞生物系教授
人生万事如塞翁失马：高中热衷柔道，受伤了10多次 (骨折)，最后阶段学习，考入国立神户大学医学部；毕业后，蹩脚的整形外科医生；1989年，进入大阪大学研究生院，毕业后，前往美国旧金山的格拉斯顿研究所留学，开始从事老鼠的胚胎干细胞研究。1996年回国后研究陷入停滞；1999年12月，成为奈良先端科学技术大学院大学的副教授；2003年，日本科学技术振兴机构为他提供了为期5年、总额3亿日元的研究经费，至此逐步走向成功。
1999年12月，干细胞研究进展被《科学》杂志评选为该年度世界十大科学进展之首。
2007年日本的Yamanaka研究小组和美国的James Thomson 研究小组分别获得诱导多能性干细胞（induced pluripotent stem cell，iPS细胞）。
2013年，加州大学旧金山分校的丁盛团队发现了化学诱导多能干细胞（CiPSCs）。
无饲养层培养法：利用各种能分泌抑制分化因子的细胞制备条件培养基或在基础培养基中加入重组的LIF制备条件培养基。

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CD133+
CD45−, CD90+
CD133+, CD44+, CD26+, ALDH
References
PMID: 21318290 PMID: 19858069 PMID: 16449977 PMID: 12629218 PMID: 18775674 PMID: 15549107 PMID: 18567795
1,000
0.25
24
100
1
96
1
2
192
-彻底的混匀细胞悬液，根据上表在96孔细胞培养板中加入细胞悬液（200μL/well）； -利用显微镜观察，标记出含有单个细胞的培养板孔； -2~4周后，观察形成肿瘤球的培养板孔； -计算CSC形成肿瘤球的频率（Analysis software: .au/software/elda/）
23
-In vivo CRC LDA
2.2 结直肠癌干细胞培养
Serially dilute cells so that you have the following final cell concentrations Tube 1 (50,000 cells/injection): 600,000 cells in 360 μL media Tube 2 (10,000 cells/injection): 120,000 cells in 360 μL media Tube 3 (1,000 cells/injection): 12,000 cells in 360 μL media Tube 4 (100 cells/injection): 1200 cells in 360 μL media Tube 5 (10 cells/injection): 120 cells in 360 μL media
16
2.1 乳腺癌干细胞培养
实验步骤（Procedure）：
3. 对细胞进行拍照，一般0d, 2d, 4d, 6d或0d, 1d, 3d, 5d, 7d进行拍照；
MDA-MB-231 CSCs
MDA-MB-231
4T1 CSCs
前期长势慢，后期快，一般一周左右传代一次，中途需添加CSCs培养基。
17
5
1.2 肿瘤干细胞特征
3. CSCs对治疗耐受8。
CSCs耐受的主要机制包括： 1）药物外排（ABC-transporters） 2）抗凋亡通路 3）干扰细胞分化 4）乙醛脱氢酶（ALDH） 5）缺氧环境 6）DNA损伤反应 7）周期静止 8）促生存信号通路
Ref: 8Drug Discov Today, PMID: 24819719
bFGF （Prospec）
P/S （gbico）
B27 （gibco）
Insulin （Genview）
BSA （sigma）
氢化可的松注射液（天津金耀）
15
2.1 乳腺癌干细胞培养
实验步骤（Procedure）：
1. 配置乳腺癌干细胞培养基（BCSCs culture media）；
Total volume: 50 mL
Cancer stem cells 19
2.1 乳腺癌干细胞培养
实验步骤（Procedure）：
-检测CSC自我更新能力（PMID: 28214331）
-检测CSC上皮间充质转化（EMT）相关指标：E-cadherin/snail and Ncadherin/Vimentin，检测得比较少，可不检测（PMID: 30188754）
2. CSCs具有一些干细胞特征，包括：休眠、DNA修复机制激活、药物转运蛋白（ABC）表达以及对细胞凋亡天然抗性7。
Refs: 4Histopathology, PMID: 19723143; 5Nat Cell Biol, PMID: 20418870; 6Cell, PMID: 18485877; 7Cancer Res, PMID: 14583474
2.1 乳腺癌干细胞培养
实验步骤（Procedure）：
4. 裸鼠移植瘤实验检测 CSCs成瘤能力（对比普通肿瘤细胞和CSCs）；
接种细胞密度不一致： CSCs可比普通肿瘤细胞接种密度低2~3个数量级，呈梯度增加。
Attentions: -建议体内成瘤实验之前先流式细胞术检测所培养肿瘤干细胞中肿瘤干细胞标志物，如乳腺癌干细胞标志物CD44+、CD24-等，既能说明培养方式未使肿瘤干细胞分化或分化较少，又能保证移植瘤实验的成功率； -裸鼠移植瘤实验皮下成瘤即可，原位移植瘤更好； -既要关注移植瘤成瘤率，还要关注移植瘤成瘤时间。
LUNG
Prostate cancer
Cell surface marker
CD20+, CD271+ CD44+, CD24+
CD133+
CD44+, ALDH1
CD133+, CD90, CD117, ALDH1 CD44+, CD133+, CD49
References
PMID: 16230395 PMID: 17122772 PMID: 17122772
6
1.3 肿瘤干细胞分离
FACS（荧光激活细胞分选术）和MACS（磁珠细胞分选）是分选CSCs的主要技术。
FACS：通过细胞水平特殊蛋白表达、细胞培养、表观遗传学变化以及CD24 、CD133、CD44等细胞水平标志物的表达方式来分离细胞。
MACS：干细胞分离标准方法，根据特殊干细胞标志物（如CD133）的表达分离细胞。
CSCs的存在最早是在40年前被提出来的，支持CSCs存在的最佳证据来源于对恶性血液性疾病的研究2,3。TPC (Tumor Propagating Cell) = CSCs。
Refs: 1Stem Cell Discovery, 2014, 4, 83-89; 2Nature, PMID: 7509044;
(1) DMEM/F-12; (2) B27;
(3) EGF;
(4) bFGF;
(5) BSA;
(6) Insulin;
(7) Hy;
(8) P/S.
2. 胰蛋白酶消化已分选肿瘤细胞，接种于超低黏附培养板；
梯度稀释：
接种于超低黏附6孔培养板， 1000~20000 cells/4 mL, 以确定后期需要传代的密度及生长周期。
18
2.1 乳腺癌干细胞培养
实验步骤（Procedure）：
5. 体外检测CSC相关因子及干细胞标志物等； -检测CSC生物标志物：CD44/CD24/ALDH（PMID: 28376210）
-检测CSC干性相关因子：Nanog, Cancer cells Oct-4, Sox-2, and C-myc（PMID: 30188754）
3Methods Cell Biol, PMID: 18442654.
4
1.2 肿瘤干细胞特征
1. CSCs的迁移对转移的影响。CD133+胰腺癌细胞具有形成肿瘤的能力；这些细胞能够连续传代，说明其具有自我更新能力，且能够通过制造分化的、非致瘤的子代产生肿瘤异质性4。 EMT（上皮间充质转化）-信号通路相关（如Wnt信号通路5）；经历EMT过程的肿瘤细胞呈现CSC特性6。
流式细胞仪
免疫磁珠分选装置
7
1.4 肿瘤干细胞标志物
Tumor type
Acute myeloid leukemia (AML)
Breast cancer
Ovarian cancer
Glioblastoma
Medulloblastoma Small cell and nonesmall cell lung cancer
11
2 肿瘤干细胞培养技术
另外一种细胞分选方法为MACS，操作简便，但是一次只能够分选一个标志物。
1. 特异性免疫磁珠标签于肿瘤细胞：带CSC标志物的细胞将会被带有标签； 2. 用磁珠分选装置分选细胞：将带有磁珠的细胞吸附于分选装置上，其余细胞将被洗脱； 3. 将靶标细胞从分选装置上洗脱。
CD133, CD44, and et al.（PMID: 21948564）
21
2.2 结直肠癌干细胞培养
3. Extreme Limiting Dilution Analysis（ELDA, 极限稀释法）检测CSC干性特征； -In vitro CRC LDA
Serially dilute cells to obtain the following final cell concentrations Tube 1 (1,000 cells/well): 27,000 cells in 5.4 mL media Tube 2 (100 cells/well): 10,000 cells in 20 mL media Tube 3 (10 cells/well): 2,000 cells in 40 mL media Tube 4 (1 cell/well): 300 cells in 60 mL media
20
2.2 结直肠癌干细胞培养
实验步骤（Procedure）：基本同BCSCs
1. 配置结直肠癌干细胞培养基（CRCSCs culture medium）；
Total volume: 50 mL
(1) DMEM/F-12; (2) B27;
(3) EGF;
(4) bFGF;
2. 检测CSC相关因子：
培养所需材料：超低粘附细胞培养板或培养瓶
6孔超低黏附（吸附）培养板（美国Corning公司）
T25超低黏附培养瓶（美国Corning公司）
14
2.1 乳腺癌干细胞培养