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一、实验目的1. 掌握磺胺嘧啶片的制备方法；2. 了解磺胺嘧啶片的质量控制指标；3. 培养实验室操作技能，提高实验效率。
二、实验原理磺胺嘧啶（Sulfadiazine）是一种广谱抗菌药物，具有杀菌和抑菌作用。
其分子式为C10H12N4O3S，分子量为252.26。
本实验采用固体分散技术制备磺胺嘧啶片，通过将磺胺嘧啶与辅料混合，制成片剂，提高药物在体内的吸收率。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：（1）磺胺嘧啶：纯度≥98%；（2）淀粉：药用级；（3）乳糖：药用级；（4）滑石粉：药用级；（5）硬脂酸镁：药用级。
2. 实验仪器：（1）电子天平；（2）研钵；（3）混合机；（4）压片机；（5）片剂硬度仪；（6）崩解时限仪；（7）紫外分光光度计。
四、实验步骤1. 原料称量：按照处方比例，准确称取磺胺嘧啶、淀粉、乳糖、滑石粉和硬脂酸镁。
2. 混合：将称量好的原料放入研钵中，充分混合均匀。
3. 制粒：将混合好的原料加入适量的水，搅拌均匀，制成软材。
然后将软材通过制粒机制成颗粒。
4. 干燥：将制得的颗粒在60℃下干燥，直至颗粒水分含量降至2%以下。
5. 压片：将干燥后的颗粒通过压片机压制成片，每片含磺胺嘧啶100mg。
6. 检查：（1）外观：片剂表面光洁，色泽均匀；（2）片重：每片重量误差±0.05g；（3）硬度：硬度仪测定，硬度≥5.0N；（4）崩解时限：崩解时限仪测定，崩解时限≤15分钟；（5）含量测定：采用紫外分光光度法测定，含量≥95%。
五、实验结果与分析1. 外观：制备的磺胺嘧啶片外观光洁，色泽均匀，符合要求。
2. 片重：通过压片机压制的片重误差在±0.05g范围内，符合要求。
3. 硬度：硬度仪测定，硬度≥5.0N，符合要求。
4. 崩解时限：崩解时限仪测定，崩解时限≤15分钟，符合要求。
5. 含量测定：采用紫外分光光度法测定，含量≥95%，符合要求。
六、实验结论本实验成功制备了磺胺嘧啶片，通过固体分散技术提高了药物在体内的吸收率。
磺胺嘧啶生物利用度的测定实验报告磺胺嘧啶是一种广谱的抗生素，常用于治疗革兰氏阳性和阴性细菌感染。
了解磺胺嘧啶的生物利用度对于确定适当的药物剂量和给药方式非常重要。
本实验旨在测定磺胺嘧啶的生物利用度，并探讨其影响因素。
实验所需材料：1. 健康成年大鼠；2. 磺胺嘧啶药物；3. 血液采集工具和试剂；4. 手术器械和材料。
实验步骤：1. 动物操作：将大鼠随机分为两组，每组n只。
一个组作为给药组，另一个组作为对照组。
2. 给药：将给药组大鼠口服给予一定剂量的磺胺嘧啶药物，对照组大鼠则给予等量的生理盐水。
3. 血液采集：在给药后不同时间点（如0、0.5、1、2、4、8小时等）采集大鼠血液样本。
使用合适的无菌针头和注射器采集血液，将血液转移到采血管中，然后离心分离血浆。
4. 血浆样本处理：将离心分离的血浆样本转移到标有时间和样本编号的离心管中，并进行标记。
5. 荧光法检测：使用荧光光谱仪检测磺胺嘧啶在血浆中的浓度。
根据磺胺嘧啶的荧光特性，选择合适的激发波长和发射波长进行检测。
6. 数据处理：根据血药浓度-时间曲线，计算磺胺嘧啶的生物利用度。
生物利用度（F）通过计算给药后的面积（A）与静脉给药后的面积（A0）之比来评估。
F = A / A0。
结果和讨论：通过实验数据计算出的生物利用度可以反映磺胺嘧啶的肠道吸收和首过效应情况。
一般而言，生物利用度越高，药物吸收效果越好。
实验结果应该进行统计学分析，以确定给药组和对照组之间的显著差异。
磺胺嘧啶的生物利用度受到多种因素的影响，这些因素包括：1. 药物生物可及性：药物分子的化学结构和溶解度可能会影响其在胃肠道中的溶解和吸收。
2. 肠道吸收：磺胺嘧啶可能通过主动转运或扩散从小肠吸收入血液循环。
因此，肠道功能和健康状况可能会影响生物利用度。
3. 药物代谢和消除：药物代谢和消除速率可能会影响生物利用度。
例如，如果药物在肝脏中被快速代谢和排泄，则生物利用度可能较低。
4. 其他因素：体重、年龄、性别等因素也可能对磺胺嘧啶的生物利用度产生影响。
单克隆抗体的制备、纯化及鉴定一、实验目的：单克隆抗体制备是细胞免疫学的一个重要里程碑，它涵盖了细胞培养、细胞融合、免疫动物和抗体效价检测等各个方面内容。
二、实验原理：骨髓瘤细胞在体外培养能大量无限增殖，但不能分泌特异性抗体；而抗原免疫的B淋巴细胞能产生特异性抗体，但在体外不能无限增殖。
将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合后形成的杂交瘤细胞，继承了两个亲代细胞的特性，既具有骨髓瘤细胞能无限制增殖的特性，又具有免疫B细胞合成和分泌特异性抗体的能力。
经在HAT培养基[含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)]中进行选择性培养，未融合的脾细胞因不能在体外长期存活而死亡；未融合的骨髓瘤细胞合成DNA的主要途径被培养基中的氨基蝶呤阻断，又因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶（HGPRT），不能利用培养基中的次黄嘌呤完成DNA的合成过程而死亡。
只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，因此能在HAT培养基中存活和增殖。
经过克隆选择，可筛选出能产生特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，在体内或体外培养，即可无限制地大量制备单克隆抗体。
三、试剂与器材：细胞培养板、解剖器械、平皿、酶标仪、加样器、细胞计数板、CO2培养箱、倒置显微镜等。
四、操作方法：1、抗原制备；一般而言，抗原的纯度不很重要，特别是免疫原性较强的抗原。
A．可溶性抗原（蛋白质）以1mg/ml～5mg／ml的溶液加等量的弗氏完全佐剂乳化，分多点小鼠皮下注射，总量为0.3ml～0.6ml，间隔３～５周再同样注射一次，１０天后，断尾取血一滴，测抗体效价，选滴度高的小鼠做融合试验。
一个月后可以经静脉（尾静脉）给予无佐剂抗原0.2ml～0.4ml，３～４天后，杀死小鼠取脾做融合用。
B. 颗粒性抗原如抗原来源方便，可以不加佐剂而增加免疫次数，缩短间隔时间。
例如用羊红血球免疫小白鼠，以１％浓度每只皮下注射０.２ml，每周２次，共免疫５～８次，取脾前３天，再免疫一次即可。
磺胺甲基嘧啶单克隆抗体的制备与鉴定的开题报告题目：磺胺甲基嘧啶单克隆抗体的制备与鉴定摘要：磺胺甲基嘧啶是一种广泛用于临床治疗的抗生素，因其广谱、低毒等特点备受青睐。
为了更好地应用于临床，本文旨在制备磺胺甲基嘧啶单克隆抗体，从而实现对磺胺甲基嘧啶的高灵敏度、高特异性检测。
关键词：磺胺甲基嘧啶，单克隆抗体，制备，鉴定1. 研究背景随着现代医学的发展，抗生素在临床上的应用越来越广泛。
磺胺甲基嘧啶是一种新型抗生素，广谱、低毒、速效等特点备受青睐。
然而，磺胺甲基嘧啶的检测方法还比较落后，目前使用的大多是传统的化学检测方法，存在一定的缺陷。
因此，研发一种高灵敏度、高特异性的检测方法对提高磺胺甲基嘧啶的检测效果具有重要意义。
单克隆抗体是一种极为重要的生物分子工具，具有高灵敏度、高特异性、高稳定性等优点。
因此，制备磺胺甲基嘧啶单克隆抗体，对于解决磺胺甲基嘧啶的检测问题具有重要的意义。
2. 研究内容本研究以磺胺甲基嘧啶为免疫原，通过动物免疫和细胞融合技术制备磺胺甲基嘧啶单克隆抗体，然后对其进行鉴定。
2.1 免疫原的制备以磺胺甲基嘧啶为免疫原，通过某种方法将其与载体结合，制备成免疫原。
2.2 动物免疫将免疫原注射入小鼠体内，刺激其产生特异性抗体。
2.3 细胞融合将经免疫处理的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合，得到杂交瘤细胞。
2.4 克隆化将杂交瘤细胞进行限稀，将单个细胞分别种植在96孔板中，使其进行单克隆化。
2.5 克隆抗体的筛选将每个单克隆抗体导入到ELISA实验中，筛选出对磺胺甲基嘧啶特异性较高的单克隆抗体。
2.6 鉴定选取筛选出的单克隆抗体，进行Western blot、间接免疫荧光染色等多种实验技术对其进行鉴定。
3. 预期结果通过上述实验流程，预计可以成功制备出特异性较高的磺胺甲基嘧啶单克隆抗体，并对其进行鉴定；从而完成对磺胺甲基嘧啶检测方法的创新探究，为临床应用提供一种新的检测工具。
4. 结论本研究旨在制备磺胺甲基嘧啶单克隆抗体，通过一系列实验流程，预计可以成功地制备出特异性较高的单克隆抗体，为磺胺甲基嘧啶的检测提供了一种新的方法。
磺胺嘧啶单克隆抗体的制备与鉴定王刘花;许杨;郭杰标;张泓;何庆华【期刊名称】《食品科学》【年(卷),期】2010(031)011【摘要】采用重氮法同时制备结合比分别为9.0、8.0、3.7的3种磺胺嘧啶免疫抗原,并将其免疫BALB/c小鼠,其中结合比为8.0的一组免疫效果最佳.获得一株稳定分泌抗磺胺嘧啶单克隆抗体的杂交瘤细胞(1F6),体内诱生法制备腹水.间接ELISA 测定腹水效价为1:1.28×106,建立间接竞争ELISA标准曲线,其检测下限为10.4ng/mL,线性范围为14.8～421.5ng/mL,IC50值为79.1ng/mL,与磺胺二甲嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶交叉反应率分别为0.3%、0.99%、4.5%,与磺胺甲噁唑、磺胺喹恶啉、对氨基苯甲酸、磺胺、对氨基苯磺酸未见有交叉反应.经鉴定,单克隆抗体免疫球蛋白为鼠IgG的2b亚类.【总页数】5页(P192-196)【作者】王刘花;许杨;郭杰标;张泓;何庆华【作者单位】南昌大学,食品科学与技术国家重点实验室,中德联合研究院,江西,南昌,330029;南昌大学,食品科学与技术国家重点实验室,中德联合研究院,江西,南昌,330029;南昌大学,食品科学与技术国家重点实验室,中德联合研究院,江西,南昌,330029;南昌大学,食品科学与技术国家重点实验室,中德联合研究院,江西,南昌,330029;南昌大学,食品科学与技术国家重点实验室,中德联合研究院,江西,南昌,330029【正文语种】中文【中图分类】S859.84【相关文献】1.磺胺嘧啶单克隆抗体的制备及其免疫学特性研究 [J], 刘庆堂;滕曼;职爱民;刘宣兵;杨艳艳;柴书军;邓瑞广;张改平2.抗血管紧张素Ⅱ单克隆抗体制备及初步鉴定 [J], 徐彬瑗;白云鹏;曾玲3.猪德尔塔冠状病毒S蛋白单克隆抗体的制备与鉴定 [J], 范前进;刘秋歌;石达;王潇博;张家林;汤荣锋;陈建飞;冯力4.抗人Ig轻链系列单克隆抗体的研制1．抗人λ轻链亚型／亚群单克隆抗体的制备及特性鉴定 [J], 赵蓉;郑志竑;谢捷明;包少佳;吴国华;邱文萱5.猪塞尼卡谷病毒单克隆抗体的制备及鉴定 [J], 莫红芳;揭凯;陈鑫;文威;刘文强;陈焕春;钱平;李祥敏因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
第15卷第1期2017年1月生物加工过程Chinese Journal of Bioprocess EngineeringVol.15 No. 1Jan. 2017floi:10. 3969/j. issn. 1672-3678. 2017. 01. 011兽药残留检测中磺胺嘧啶ELISA试剂盒的研制田博u，金坚\惠人杰\徐凤莲2,吴涛2,李伟2(1.江南大学药学院，江苏无锡214122; 2.无锡同昕生物技术有限公司，江苏无锡214028)摘要：以合成的耦联抗原B S A磺胺嘧啶和磺胺嘧啶（SD)的单克隆抗体为材料，建立了 SD间接竞争ELISA的方法。
方法的检测灵敏度为0.213 ng/mL，线性检测范围为1.84~57.41 ng/mL，除与磺胺二曱嘧啶反应率超过10% 夕卜，与其他磺胺类药物交叉反应率均低于1.5%，4尤放置180 d没有明显的变化。
采用猪尿、牛奶、猪肉3类样本进行的添加回收实验，批内CV均小与10%，批间CV小于15%，平均添加回收率介于75%~90%。
因此，组建的试 剂盒可以满足动物饲养检测SD的要求。
关键词：磺胺嘧啶；间接竞争ELISA;回收实验；交叉反应率中图分类号:TS201 文献标识码:A 文章编号：1672-3678(2017)01-0069-04 Determination of sulfadiazine in the veterinary drugs residue by sensitive ELISA TIAN Bo12，JIN Jian1，HUI Renjie1，XU Fenglian2，WU Tao2，LI Wei2(1. School of Pharmaceutical Sciences，Jiangnan University，Wuxi 214122，China;2. Wuxi Tongxin Biotechnology Co. Ltd.，Wuxi 214028，China)A b stract：Using indirect competitive enzyme linked im munosorbent assay(ELISA)，a rapid，highlyselective and extremely sensitive m ethod has been established for the determination of sulfadiazine (SD).The SD detection limit was 0.213 ng^mL for indirect competitive ELISA formats，the assay ranges from1.84 to57. 41 ng/mL，except for the cross reactivity with sulfadimidine is over 10%，cross reaction withother sulfadrugs were low than 1.5%，and there was no significant change under 4 ^in 180 d.The within-run and between-run CVs of the SD-ELISA were less than 10% and 15%，respectively.The m ean recoveries from the SD-free pig urine，milk and pork were 75% to 90%.The results show that the SD-ELISA m ethod can be applied to detect the SD contamination in food and animal feed.K eyw ords：sulfadiazine;indirect competitve ELISA；recovery test;cross-reaction rate动物性食品中兽药和饲料添加剂的残留对环 境和人体健康的危害已成为现在亟待解决的问题 之一，其中，磺胺类药物特别是磺胺嘧啶（SD)、磺胺 甲基嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶和磺胺甲基异恶唑等作 为饲料添加剂或动物疫病治疗药物的不合理用药 在动物性食品中的残留已受到国际社会的普遍关 注[1-2]。
磺胺二甲基嘧啶单克隆抗体的制备及免疫学检测方法的建立的开题报告一、选题背景及意义磺胺二甲基嘧啶（sulfamethoxazole）是一种广泛用于临床治疗的抗菌药物。
然而，长期使用磺胺类药物容易引起耐药性的产生，严重威胁患者的用药效果和生命安全。
因此，准确、快速地检测磺胺二甲基嘧啶的残留量是至关重要的。
已有研究表明，单克隆抗体法是目前最为常用的磺胺二甲基嘧啶检测方法之一。
因此，本研究旨在建立一种高效、稳定的磺胺二甲基嘧啶单克隆抗体，以及相应的免疫学检测方法，为磺胺二甲基嘧啶的检测提供新的技术手段和理论基础。
二、研究任务1. 通过分别免疫BALB/C小鼠和New Zealand兔，制备具有高亲和力、稳定性和特异性的磺胺二甲基嘧啶单克隆抗体。
2. 对单克隆抗体进行鉴定和优选，筛选出最佳的抗体，并将其纯化。
3. 建立磺胺二甲基嘧啶的间接竞争ELISA检测方法，并优化试验条件，确定检测的灵敏度和特异性。
4. 通过测定不同样品中磺胺二甲基嘧啶的含量，验证所建立的免疫学检测方法的可行性和准确性。
三、研究内容1. 磺胺二甲基嘧啶单克隆抗体的制备（1）免疫小鼠和兔子：将磺胺二甲基嘧啶制备成较大的蛋白质载体，免疫小鼠和兔子，获得其多克隆抗体，进行筛选和鉴定。
（2）细胞融合：将小鼠和兔子的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合，获取杂交瘤细胞，检测其产生的单克隆抗体。
2. 磺胺二甲基嘧啶单克隆抗体的鉴定与物性分析（1）竞争酶联免疫吸附法（cELISA）：通过cELISA对单克隆抗体的亲和力、特异性、适应性和抗体浓度进行鉴定和优选。
（2）Western Blot：对单克隆抗体进行Western Blot检测，从而了解其分子量和纯度。
3. 磺胺二甲基嘧啶的间接竞争ELISA检测方法的建立（1）反应体系的优化：“双抗法”或“竞争法”。
（2）半衰期的测定。
（3）灵敏度和特异性的测定。
4. 免疫学检测方法的应用建立的间接竞争ELISA检测方法，用于检测不同来源、不同处理方法的磺胺二甲基嘧啶残留量，并确定其检出限值和准确性。
一、目的：制订详尽的工作程序，规范检验操作，保证检验数据的准确性。
二、范围：适用于原料药磺胺嘧啶成品的标准操作程序。
三、职责：1. 检验员：严格按操作规程操作，认真、及时、准确地填写检验记录；2. 化验室负责人：监督检查检验员执行本操作规程。
四、内容：1. 性状：取1g样品于洁净的玻璃皿上观察，本品应为白色、黄白色或粉白色结晶粉末或晶体。
溶解度：本品在稀酸和稀碱液中溶解，在96%乙醇和丙酮中微溶，在水中不溶。
2. 鉴别：2.1 红外鉴别：2.1.1 仪器：红外分光光度计2.1.3试剂：光学溴化钾、磺胺嘧啶对照品2.1.3 测试方法：按《XYK/SOP-QC7040红外分光光度法检查操作规程》操作，本品的红外光吸收图谱应与对照品的图谱一致。
2.2 薄层色谱：2.2.1 仪器：干燥箱、硅胶G薄层板、三用紫外仪、电子天平2.2.2 试剂：氨水、硝基甲烷、二恶烷、甲醇、磺胺嘧啶对照品2.2.3 测试方法：混合溶剂：浓氨水：甲醇（4:96）测试溶液：溶解20mg样品于3ml混合溶剂并稀释至5ml对照溶液：溶解20mg磺胺嘧啶对照品于3ml混合溶剂中并稀释至5ml展开剂：稀氨水-水-硝基甲烷-二恶烷（3:5:40:50）稀氨水:取浓氨溶液（25%~30% m/m）41g，用水稀释至100ml（100g/L~104g/L NH3）。
照《XYK/SOP-QC7024薄层色谱法检查操作规程》检查，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以稀氨水-水-硝基甲烷-二恶烷（3:5:40:50）为展开剂，展开至板的3/4后，在105℃下干燥，在254nm的紫外灯下检查，供试品溶液与对照溶液薄层板上的主斑点的大小和位置应保持一致。
2.3 熔点：2.3.1 仪器:熔点仪、油浴锅、干燥箱2.3.2 试剂：硅油、甲苯2.3.3 测定方法：取样品3.0g置于干燥洁净的试管中，将试管以45°倾斜浸泡在270℃的硅油中，样品将会分解形成白色或者黄白色的升华物，取升华物加入甲苯进行重结晶，结晶物在100℃条件下干燥，按XYK/SOP-QC7036熔点检验操作规程测定，其熔点应为123～127℃。
磺胺嘧啶单克隆抗体的制备与鉴定王刘花，许 杨*，郭杰标，张 泓，何庆华(南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，中德联合研究院，江西 南昌 330029)摘 要：采用重氮法同时制备结合比分别为9.0、8.0、3.7的3种磺胺嘧啶免疫抗原，并将其免疫BALB/c 小鼠，其中结合比为8.0的一组免疫效果最佳。
获得一株稳定分泌抗磺胺嘧啶单克隆抗体的杂交瘤细胞(1F6)，体内诱生法制备腹水。
间接ELISA 测定腹水效价为1:1.28×106，建立间接竞争ELISA 标准曲线，其检测下限为10.4ng/mL ，线性范围为14.8～421.5ng/mL ，IC 50值为79.1ng/mL ，与磺胺二甲嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶交叉反应率分别为 0.3%、0.99%、4.5%，与磺胺甲噁唑、磺胺喹恶啉、对氨基苯甲酸、磺胺、对氨基苯磺酸未见有交叉反应。
经鉴定，单克隆抗体免疫球蛋白为鼠Ig G 的2b 亚类。
关键词：磺胺嘧啶；重氮法；酶联免疫检测；单克隆抗体Preparation and Identification of Anti-sulfadiazine Monoclonal AntibodyWANG Liu-hua ，XU Yang* ，GUO Jie-biao ，ZHANG Hong ，HE Qing-hua(Sino-Germany Joint Research Institute, State Key Laboratory of Food Science and Technology, NanchangUniversity, Nanchang 330029, China)Abstract ：In order to generate a monoclonal antibody (McAb) against sulfadianzine (SD), three separate immunogens with SD/BSA conjugation ratios of 9.0, 8.0 and 3.7 were prepared by diazotization method and BALB/c mice were then immunized with the immunogens. An optimum immunization was observed in BALB/c mice immunized with the immunogen with middle SD/BSA conjugation ratio. A McAb (1F6) with high affinity to SD was obtained by hybridoma technique. The titer of the McAb was 1:1.28 ×106 in ascites according to the indirect ELISA determination. IC 50 and the lowest detectable limit (LDL) of the McAb in linear range of 14.8－421.5 ng/mL for SD were 79.1 ng/mL and 10.4 ng/mL, respectively. The cross-reactivity ratios of the McAb against sulfamethazine, sulfamonomethoxine and sulfamethoxydiazine were 0.3%, 0.99% and 4.5%, respectively, while no cross-reactivity to sulfamethoxazole, sulfaquinoxaline, 4-aminobenzoic acid, sulfanilamide or sulfanilic acid was observed.The sub-class of the McAb was identified as IgG 2b .Key words ：sulfadiazine ；diazotization ；ELISA ；monoclonal antibody中图分类号：S859.84 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2010)11-0192-05收稿日期：2009-11-07基金项目：江西省科技支撑计划项目(2007BS12501)作者简介：王刘花(1984—)，女，硕士研究生，研究方向为食品卫生与安全。
E-mail ：wangliumeis@ *通信作者：许杨(1951—)，女，教授，博士，研究方向为食品质量与安全。
E-mail ：xuyang1951@磺胺类药物是人工合成的具有对氨基苯磺酰胺结构的一类抗菌药物的总称，在兽药和医学临床上不仅有预防和治疗作用，而且还有生长促进剂的作用[1]，常被用作动物食品添加剂，分子结构如图1所示。
图 １ 磺胺类药物结构式Fig.1 Chemical structure of sulfonamidesOSONH R 1NH R 2磺胺类药物的不合理使用，使其在动物性食品中的残留问题日趋严重，对人类健康带来巨大的危害。
农业部在2008年动物性食品中兽药残留监控计划的通知中，对磺胺类药物在猪肉、鸡肝、鸡肉、牛奶及羊肉中的残留限量及检测方法作了规定，主要包括：高效液相色谱法[2]、色谱-质谱联用法[3]及酶联免疫法[4-6]。
免疫学检测方法具有特异性强、灵敏度高、方便快捷、成本低等特点，已被大量用于食品安全与检测中。
在免疫学检测方法中，人工抗原的合成是单克隆抗体制备的关键，常见的磺胺类药物人工抗原制备方法有重氮法[7-9]、戊二醛法[10-11]、琥珀酸酐法[12]，以及利用其衍生物制备完全抗原的方法[6,13]。
重氮法引入－N ＝N －作间隔臂，有助于半抗原结构的暴露，有利于特异性抗体的产生[9]。
本实验拟采用重氮法合成人工抗原，制备抗磺胺嘧啶单克隆抗体，旨在为进一步研制开发磺胺嘧啶快速检测试剂盒提供参考。
１材料与方法1.1动物BALB/c 小鼠购自南昌大学医学院实验动物中心。
1.2试剂磺胺嘧啶(s u l f a d i a z i n e ，S D )、磺胺二甲嘧啶(s u l f a m e t h a z i n e ，S M 2)、磺胺对甲氧嘧啶(s u l f a m e t h o x y d i a z i n e ，S M D )、磺胺间甲氧嘧啶(s u l f a m o n o m e t h o x i n e ，S M M )、磺胺甲噁唑(s u l f a m e t h o x a z o l e ，S M Z )、磺胺喹恶啉(sulfaquinoxaline ，SQ)、对氨基苯甲酸(4-aminobenzoic a c i d ，P A B A ) 中国兽医药品监察所；磺胺(sulfanilamide ，SN)、对氨基苯磺酸(sulfanilic acid ，p -ASA) 上海晶纯实业有限公司；牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)、弗氏完全佐剂(complete Freund sadjuvant)、弗氏不完全佐剂(incomplete Freund s adjuvant)上海生工生物工程技术服务有限公司；羊抗鼠IgG:HRP 酶标二抗 Gene Tex 公司； DMEM 培养基、小牛血清及HAT 培养基 Hyclone 公司。
1.3仪器与设备Ultrospec 紫外-可见光分光光度计 美国Amersham 公司；Thermo MK3酶标仪 Thermo 公司。
1.4方法1.4.1重氮法SD 人工抗原的制备反应机理如图2所示，采用平行式梯度法同时制备3种不同结合比的SD 免疫抗原的投料比分别为40:1、30:1、20:1，载体蛋白为BSA ，操作同Ding 等[8]的方法，合成后蒸馏水透析3d ，pH7.4 PBS 缓冲液透析2d ，得3组SD 免疫抗原，分别命名为SD-BSA 1、SD-BSA 2、SD-BSA 3；以OVA 代替BSA 制备检测抗原SD-OVA ，投料比为15:1，其他操作方法不变。
将偶合物进行20倍稀释后，分别在波长260nm 、280nm 处测定紫外吸光度，根据式(1)计算偶合蛋白质量浓度。
蛋白质量浓度/(mg/mL)=1.45×OD 280nm －0.74×OD 260nm (1)利用紫外-可见光分光光度计对人工抗原进行扫描，计算摩尔吸光系数(ε)，根据式(2)计算人工抗原的结合比。
ε偶合物－ε载体蛋白人工抗原的结合比= ———————— (2)εSD图 ２ 重氮法制备磺胺嘧啶人工抗原反应机理Fig.2 Synthesis mechanism of SD-BSA, SD-OVA by diazotizationOHCH 2→0～4℃pH8.6N NSO ONH N NHOCH 21.4.2动物免疫选取4～6周龄的BALB/c 小鼠，分别于腹部皮下多点注射3组免疫抗原SD-BSA 1、SD-BSA 2、SD-BSA 3，每组4只，免疫剂量为150μg/只，初次免疫加等量弗氏完全佐剂与免疫抗原混合，充分乳化，28d 后，以等量不完全弗氏佐剂与免疫抗原混合，充分乳化，加强免疫，之后每隔21d 加强免疫一次，4免后断尾采血测效价与阻断。
1.4.3阳性血清的筛检方正滴定法确定检测抗原最佳包被质量浓度，间接ELISA 测定3组小鼠抗血清效价，对效价高的一组进行阻断实验，操作同邓舜洲[14]的方法。
1.4.4抗SD 单克隆抗体的制备及腹水的纯化细胞融合、阳性杂交瘤的筛选与克隆化、腹水的制备与纯化，操作同邓舜洲[14]的方法。
1.4.5间接ELISA 测定单克隆抗体效价采用方正滴定法确定最佳抗原包被质量浓度与抗体稀释度，同时进行单克隆抗体效价的测定，操作同邓舜洲[14]的方法。
1.4.6间接竞争ELSIA 建立标准曲线以2μg/mL SD-OVA 包被酶标板，SD 标准品的质量浓度分别为500、400、250、100、75、50、20、10、5、2、1ng/mL(溶于 0.0lmo1/L pH7.4 PBS 缓冲液)，以结合率(B /B 0，B 是不同质量浓度的SD 标准品的OD 450nm 值，B 0是SD 标准品质量浓度为0时的OD 450nm 值)为纵坐标，以不同S D 质量浓度为横坐标，绘制标准曲线。
1.4.7间接竞争ELISA 鉴定单克隆抗体特异性选取其他7种磺胺类药物：磺胺二甲嘧啶、磺胺N NNH SO ONH 20～4℃NaNO 2+HCl磺胺嘧啶→N NNH SO O N N Cl+－重氮盐＋,,载体蛋白磺胺嘧啶人工抗原对甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺喹恶啉、磺胺、对氨基苯磺酸和对氨基苯甲酸，根据式(3)计算交叉反应率[15]。
