内生真菌原生质体制备与再生条件研究

近 年 来 国 际 上 流 行 的 一 种 高 档 切 花 。 我 国 各 地 竞 相 引种 栽
２４一 ， Ｄ＋３ ／ ０ｇ Ｌ蔗糖。 生 培 养 基 为 ２ ｍ Ｔ ＋ 再 ．５ Ｌ Ｋ
０ ５ｍ ／ Ａ ＋ ３ Ｌ 蔗 糖 。 接 种 后 的 材 料 放 在 温 度 ． ｇ ＬＮ Ａ ０ （６± ）℃ 、 照强 度 １ ０ 、 照 时 间 ８ｈ ｄ的 培养 室 内 。 ２ ２ 光 ０ｌ 光 ５ ｘ ／
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Ａ 洋拈 梗 花 药 愈伤 组 织
Ｂ 愈伤 组 织 芽 的分 化 图 ｌ 洋桔 梗 花 药 培 养 再 生 植 株 Байду номын сангаас
Ｃ 花 药愈 伤 组织 的再 生 植株 ．
表１ ３ —５月 份 诱导 培 养基 中激 素 和 蔗 糖 浓 度 对 洋 桔 梗 花 药 愈伤 组 织诱 导 的 影 响
收稿 日期 ：０ ０— ５— １ ２ １ ０ ２
导愈伤率最 高， 达到 ７ ％ ， ０ 极显著 高于 ４月取 材的花 药愈伤
诱导率。
２ ３ 不 同的取 材 时 间对 洋 桔梗 花 药愈 伤 组 织 分化 的影 响 ．
作者简介 ： 周旭红（９ ８ ） 女 ， １７ 一 ， 湖南永州人 ， 硕士 ， 助理研 究员， 主要
２ ２ 同一 培 养基 不 同取 材 时 间 对 洋桔 梗 花 药 愈 伤 组 织 诱 导 ．
的影 响
３ ４ ５月愈伤形成的个数和形成再生植株愈伤的个数 。 、、
１ ２ 试 验 方 法 ．
取花萼与花冠等长 或花冠稍长 于花萼 时的花蕾 ， 预 ４℃
处 理 １ ３ｄ后 ， ５ 的 次 氯 酸 钠 溶 液 消 毒 １ ｉ ， 用 ～ 用 ％ ０ ｒｎ后 再 ａ

微生物发酵生产紫杉醇研究进展摘要：综述了微生物发酵生产紫杉醇的主要研究进展，包括产紫杉醇的内生真菌的生物多样性、真菌细胞发酵生产紫杉醇的优势，同时也对如何改良内生真菌菌种性能和优化培养基组成及培养条件以提升其产紫杉醇的能力，作出了较为全面的综述。

关键字：紫杉醇，微生物发酵，内生菌，产量前言：目前国外市场上的紫杉醇仍依靠从红豆杉树皮中提炼和人工合成方法，目前并未见有第三种形式形成大规模产业化制作的报道。

紫杉醇的生产受着原材料与科技二个方面的约束，短期内无法突破。

为克服红豆杉资源匮乏和紫杉醇需要量的日益扩大的问题，人类对生产紫杉醇开展了多种多样的科学研究，涉及化学全合成、植物细胞培养、微生物转化和微生物发酵。

微生物发酵法生产紫杉醇由于具备突出优点，其研制与发展日益引起中外科研学者的普遍重视。

一、紫杉醇产生菌的研究进展（一）产紫杉醇的内生真菌的种类Stierle和Strobel等首次从短叶红豆杉的树枝上分离出一个可以形成紫杉醇的内生真菌，命名为安德列亚霉[1]。

当时这一发现对于紫杉醇的药源研究是一次重要的突破，为开发紫杉醇的物源提出了一个崭新的途径。

此后，各地研究者相继进行对产紫杉醇的内生真菌的分离操作，先后在西藏红豆杉、云南省红豆杉、东北地区红豆杉、欧洲红豆杉和中国红豆杉中分离到能形成紫杉醇的内生真菌，其寄主植被基本包括红豆杉属下的所有种类。

在国外的树木中，科学家也分离出来到了可形成紫杉醇的内生真菌。

Li等在不同种类的秃柏的韧皮部和木材部中均分离出能形成紫杉醇的内生真菌[2]。

GA等18人在同一种松树中分离出产紫杉醇的内生真菌。

这表明，产紫杉醇的内生真菌不但存在于红豆杉属植被中，在某些非红豆杉属植被中也存在，他的研究结果更拓宽了产紫杉醇的内生真菌的研究范畴。

（二）真菌发酵制备紫杉醇的优越性与过去在红豆杉植株的树皮上获得的紫杉醇比较，由内生真菌发酵制备紫杉醇有着更多的优越性，微生物发酵方法具有以下特点：（1）微生物发酵的方法易扩大化，有利于工业化生产的落地实施；（2）微生物易于通过诱变育种等方法筛选高产菌株，提高紫杉醇的产量，微生物育种及选育速度明显高于植物细胞株；（3）内生真菌生长迅速，在简单培养基中便可大量繁殖，形成丰富的发酵活性性质；（4）内生真菌在生物反应器中生长时，可人为调节各项发酵参数，使代谢路径朝着有利于紫杉醇的生产及高浓度紫杉醇的积累的方向进行。

通 过 观 察 ，发 现 桦 褐 孔 菌 原 生 质 体 释 放 方 式 有 ４种 ， 端 位 释 放 （ ２ 、 位 释 放 （ ３ 、 即 图 ）侧 图 ） 菌 丝 段 端 位 释放 （ ４） 原 位 释 放 （ ５ 。 图 和 图 ）
吸去多余 水分。 １０ｍ 湿菌丝体加 １ Ｌ酶液 ， 每 ０ ｇ ｍ
再 生培 养基 ：液 体培 养基 ＋ 脂 ６ｇ Ｌ ， 琼 ・一 以 ０６ｍ ｌＬ ． ｏ・ 蔗糖 配制 ，Ｈ值 ６５ ｐ ．。 再 生 对 照 培 养 基 ： 体 培 养 基 ＋ 脂 ６ｇ Ｌ 液 琼 ・～， 以蒸馏水配制 ，Ｈ值 ６５ ｐ ．。 ０６ｍ ｌＬ ． ｏ・ 甘露醇 、 蔗糖 、 ａ １Ｋ １ Ｎ Ｃ、Ｃ。
天津农业科学 Ｔ ｎｉ ｇｉ ｌ ｒ ｃｅｃｓ ｉ ｊｎ ｒ ｕｔ ａ Ｓｉｎｅ ａ Ａ ｃ ｕｌ
・植 物 生 理 与 生 物 技 术
桦褐 孑 菌原 生质体 制备 与再 生 Ｌ
李 瑁 ， 成 金 郭
（ 天津师 范大 学 生 命科 学学 院 ， 津 ３ ０ ８ ） 天 ０ ３ ７
摘
要： 用正交设计方 法对桦褐孑 菌 原生质体最佳制备 与再生条件从 酶条件 、 采 Ｌ 酶解时 间 、 温度等 ５个方面进行 了研 究 。试
研 究已有许多成功报道 ，但 就桦褐孔菌原 生质体 育 种研究而言 ， 至今鲜见报道 。 笔者利用正交设计
Ｓ Ｃ一 Ｗ— Ｊ ２超 净工 作 台 ，Ｇ 一 ６ Ｔ Ｌ １Ｇ高 速 冷冻 离 心 机 ， Ｈ Ｓ恒温水 浴锅 ， ａ ｎ Ｈ — Ｇ ｌ 显微镜等 。 ｅ 固体斜 面培养基 ： 棉籽皮 ２０ｇ Ｌ ０ ・ 和马铃薯
Ｋ值 大 是 较 好 的试 验 条件 ， 由表 ２可 知 ， 褐 桦
取生长 旺盛的菌丝尖端接种于盛 ５ Ｌ液体 ０ｍ

一株内生真菌的原生质体制备及再生过程研究
材料准备：
内生真菌菌株
无菌工作台和器具（如培养皿、显微镜片、移液器等）无菌培养基（如琼脂、乳糖酸钠琼脂培养基等）
无菌培养液（如培养基溶液）
去离子水或无菌PBS缓冲液
培养基制备：
根据内生真菌的要求配制适宜的无菌培养基。

煮沸溶液中加入琼脂，并搅拌至溶解。

转移至培养器并加盖，进行高压灭菌。

菌种处理：
在无菌条件下，将内生真菌分离出来。

用无菌培养液或去离子水洗涤菌株，去除杂质。

原生质体制备：
将清洗后的菌株转移到含有少量无菌培养液的培养皿中。

用显微镜检查，确保菌株没有受到污染。

在无菌条件下，用移液器将菌株转移到新的培养皿中。

将培养皿置于振荡器中，以帮助分离真菌的原生质体。

过一段时间后，观察原生质体的形成情况。

原生质体再生：
将形成的原生质体转移到含有适宜培养基的培养皿中。

在适宜的温度（一般为25-30摄氏度）下，进行培养。

定期观察并记录原生质体再生的过程。

根据需要，可以进行进一步的培养和分离。

基 础培 养 基 中加 入 ０ ７ｍ ｌＬＮ Ｃ 溶液 渗 透 压 稳 定 剂 。 ． ｏ ａ １ ／ １ １３ 试 剂 ．． １ １４ 酶 解 液 ．． 渗 透 压 稳 定 剂 设 为 ４组 ， ０ ７ｍ ＬＬＮ Ｃ 、 即 ． ｏ／ ａ １ 酶 解 液 成 分 配 组 筛 选 设 为 ６组 ， ２ ｏ ％ 即 ．ｏ ０ ７ｍ ｌＬＫ １ ０７ｍ ＬＬ甘 露 醇 、． ｏ／ ． ｏ／ Ｃ 、 ． ｏ／ ０７ｍ ＬＬ葡 萄糖 。
中 图分 类 号 ：Ｑ ３ ９３ 文献 标 志 码 ： Ａ 文 章 编 号 ：０２～ ３ ２ ２ １ ）２— １０— ３ １０ １０ （０ １ ０ ０ ０ ０
紫杉醇是一种复杂的具有抗癌 活性的二萜生物碱 ， 最早 由美 国的 Ｗａｉ ｎ 等从短叶红 豆杉 （ ａｕ ｒ ｉｌ ） Ｔｘｓ ｅｆ ｉ 中分离出来 ｂ ｖｏ ａ 的 。在生物体内 ， 紫杉醇 的作用机理是 抑制微管 蛋白的
究［ ］ Ｊ ．作物学报 ，０ ７ １ ：２ ２ ０ （ ） １０ห้องสมุดไป่ตู้１５ ２．
陈 文强 等 ： 株 产 紫 杉醇 内生 真 菌 的原 生 质 体 制 备 与再 生 １
１ 材料 与 方 法
１ １ 材 料 ．
一 ｌ ｌ一 ０
１： （ ３ 菌丝体湿重 ： 酶液体积 ） 的比例将 内生真 菌菌丝体 （ 培 养 ３ｄ 加 入 到 不 同 种 类 酶 配 组 的 酶 解 液 中 ， ３ ） 在 ０℃ 、Ｈ 值 ｐ
物外 ， 还可达到改进产 品质量 、 扩大品种 和简化生产工艺等的
效果 。通过原生质体诱变 ， 选育产紫杉醇 内生真菌的高产菌
株， 发挥 菌 株 的 遗传 潜 力 ， 高 菌 株 的 紫杉 醇产 量 ， 微 生 物 提 为

文章篇号:1007-2764(2006)03-0263-093微生物原生质体制备及再生的影响因素谭文辉，李燕萍，许杨（南昌大学中德联合研究院 食品科学教育部重点实验室，江西南昌 330047） 摘要：原生质体的制备及再生，是原生质体技术的前提和基础。

本文较全面地介绍了影响微生物原生质体制备及再生的因素，以期在原生质体形成和再生的最佳条件下制备原生质体，为进一步实验打下良好的基础。

关键词：原生质体；制备；再生Factors Affect the Formation and Regeneration of Protoplasts ofMicroorganismTan Wen-hui, Li Y an-ping, Xu Y ang(The Key Laboratory of Food Science of Ministry of Education (Nanchang University); Sino-Germany Joint ResearchInstitute, Nanchang 330047, China)Abstract: Formation and regeneration of protoplasts is the precondition and foundation of protoplasts technology. The factors that affect the formation and regeneration of protoplasts from microorganism were investigated to find the optimum condition of formation and regeneration of protoplasts. It is important to make the good foundation for further research.Keywords: Protoplasts; Formation; Regeneration原生质是有组织的生活物质，是细胞生命活动的物质基础，所有的原生质有相似的基本组成成分和特性。

茯苓原生质体制备与再生条件的优化
汪琪;赵小龙;陈平
【期刊名称】《武汉工业学院学报》
【年(卷),期】2015(000)004
【摘要】对茯苓原生质体形成与再生条件进行研究。

分别从菌丝菌龄、酶种类及浓度、酶解时间、酶解温度4个方面优化了原生质体的制备条件，从再生培养基的成分、原生质体涂布方法、酶解时间3个方面优化原生质体的再生条件。

结果表明：采用培养6天的茯苓菌丝，在3．5％溶壁酶＋1％崩溃酶的混合酶液中，36℃酶解2．5—3 h，获得的原生质体产量最高，可达到39．38×107个／g，双层涂布再生率可达32．7％。

【总页数】5页(P11-15)
【作者】汪琪;赵小龙;陈平
【作者单位】武汉轻工大学生物与制药工程学院，湖北武汉430023;武汉轻工大学生物与制药工程学院，湖北武汉430023;武汉轻工大学生物与制药工程学院，湖北武汉430023
【正文语种】中文
【中图分类】Q71
【相关文献】
1.茯苓原生质体制备与再生条件的优化 [J], 汪琪;赵小龙;陈平;
2.茯苓原生质体制备与再生条件的研究 [J], 王伟霞;李福后
3.基于响应面法的蟹味菇原生质体制备与再生条件优化 [J], 冯婷婷;郭九峰;宋天磊;春霞;刘超雄;李亚娇;慕宗杰;孙国琴;于传宗;王海燕
4.基于响应面法的蟹味菇原生质体制备与再生条件优化 [J], 冯婷婷;宋天磊;春霞;刘超雄;李亚娇;慕宗杰;孙国琴;于传宗;王海燕;郭九峰
5.茯苓原生质体制备与再生条件初探 [J], 梁清乐;王秋颖;曾念开;王怀凯
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原生质体制备和再生的影响因素【摘要】以酿酒酵母YS5为出发菌株，经蜗牛酶酶解获得原生质体后，用紫外线进行诱变处理，通过一级筛选得到了61株诱变菌株，将这些诱变株直接进行发酵，利用气相色谱对发酵液酒精产量进行分析。

结果表明，经过紫外线照射30s后，通过筛选获得了一株酒精发酵较高产菌株，酒精产率达到了10.36%（v/v），比出发菌株提高了3.6%。

【关键词】酿酒酵母；原生质体；紫外诱变；甘蔗汁发酵酵母细胞的融合及酵母原生质体的诱变的一个重要前提就是如何制备大量的原生质体，原生质体制备率受到各种条件的影响，如菌龄、酶浓度、温度、预处理等的影响，因此确定不同因素对酵母原生质体的影响及优化不同因素，可以大大提高产率。

1.菌体菌龄对原生质体制备的影响微生物的生理状态是决定原生质体产量的主要因素之一，特别是菌龄，明显影响原生质体释放的频率。

不同时期的菌体，对各种溶壁酶的敏感性不同，原生质体的形成率与再生率也有很大差异。

较年轻的菌体细胞制备原生质体较为容易，而且此阶段的原生质体再生率也较高。

处于对数生长期的菌体代谢活性高而稳定、细胞壁对酶的作用较为敏感，且大小比较一致，生长适应能力强，故通常取处于对数生长期的菌体制备原生质体。

有研究表明对数生长早期形成率最高，对数生长中期时再生率最高，对数生长晚期的再生率也比对数生长中期的低。

这是由于细胞壁越稚嫩，越易被酶破坏，对数生长早期菌体幼小，代谢活性高而稳定、细胞壁对酶的作用较为敏感，且大小比较一致，故生活适应能力强；对数生长中期幼小菌体对不利因素抵抗能力差，一旦失去细胞壁，较难恢复；对数生长晚期的原生质体存在着很大比例的非活性个体。

菌体如果进入稳定期，细胞壁结构趋于稳定和老化，不易去壁形成原生质体，原生质体形成率显著降低，而且再生率也有所下降。

微生物的菌龄是随着菌种和培养条件而异，酵母菌菌液中加入β-巯基乙醇可以破坏细胞壁组分中的二巯基，处于对数生长期的酵母菌菌体代谢极为旺盛，细胞壁易被瓦解，其细胞壁对蜗牛酶较为敏感，易于酶解脱壁，且酵母菌制备原生质体时，要使菌体同步化才能大幅度的提高制备率。

柄蓝状菌原生质体的制备与再生条件优化张荟蓉;周志义;耿安利【摘要】为了建立以聚乙二醇/氯化钙(PEG/CaCl2)原生质体介导的柄蓝状菌(Talaromyces Stipitatus)高效的遗传转化系统,分别从材料选择,真菌菌龄,不同的渗透压稳定剂,酶的不同种类配比,酶的浓度,酶解时间及不同再生方式对柄蓝状菌EMM原生质的制备与再生条件进行优化.结果表明:以柄蓝状菌EMM接种生长48 h的菌丝为制备材料,1 mol/L MgSO4作为渗透压稳定剂,菌丝在温度为30℃,浓度为50 mg/mL的裂解酶溶液中酶解3 h,得到的原生质体先用再生培养基孵化培养12 h,然后再与PDA培养基混合铺板,以上组合条件下原生质体的释放量可达8.73×108/mL,再生率可达17.7％.【期刊名称】《武汉工程大学学报》【年(卷),期】2018(040)006【总页数】5页(P601-605)【关键词】柄蓝状菌;PEG/CaCl2转化;原生质体;再生条件【作者】张荟蓉;周志义;耿安利【作者单位】武汉工程大学化学与环境工程学院,湖北武汉 430205;武汉工程大学化工与制药工程学院,湖北武汉 430205;新加坡义安理工学院,新加坡 999002【正文语种】中文【中图分类】Q939.9近年来，丝状真菌在工业酶方面的研究得到了广泛应用。

柄蓝状菌EMM是丝状真菌中一株经过诱变的高产纤维素酶菌株，是由本实验室自主分离得到，其纤维素与半纤维素的产量已经可以达到工业水平［1］。

为了更进一步提高纤维素酶的产量，从分子水平上分析菌株的特性，转化系统的建立成为其研究的第一步［2］。

相比于其他受体的转化体系，丝状真菌因为存在细胞壁，会导致在转化时外源基因很难进入［3］。

针对丝状真菌的转化方法主要有PEG/CaCl2原生质体转化［4-5］，电击转化［6-7］，农杆菌介导转化［8-9］，基因枪转化［10］，限制性内切酶介导转化［11］，其中PEG/CaCl2原生质体转化法和农杆菌介导转化法是现在丝状真菌使用最多的转化方法［12］。

裂壳菌L-14原生质体制备与再生体系构建农倩;张雯龙;谢玲;廖仕同;覃丽萍【摘要】[目的]初步构建裂壳菌L-14原生质体制备和再生体系,为同源菌株原生质体制备研究提供理论依据.[方法]研究细胞壁裂解酶组合、酶解时间、酶解温度、渗透压稳定剂种类对原生质体制备产量的影响,以获得最优制备方案,同时筛选适合的原生质体再生培养基.[结果]菌株经YEPG液体培养基培养7d后,使用0.7 mol/L的NaC1作为渗透压稳定剂配置浓度各为20 mg/mL的崩溃酶+裂解酶复合酶液,在30℃、80 r/min条件下酶解5.5h后可获得较高的原生质体数量,利用PDS培养基的原生质体再生率可达10.65％,显著高于其它类型培养基.[结论]确定了裂壳菌L-14的高效原生质体制备与再生体系,为该菌株遗传转化体系的建立研究奠定基础.【期刊名称】《西南农业学报》【年(卷),期】2019(032)006【总页数】5页(P1302-1306)【关键词】裂壳菌;原生质体;制备;再生【作者】农倩;张雯龙;谢玲;廖仕同;覃丽萍【作者单位】广西农业科学院微生物研究所,广西南宁530007;广西农业科学院微生物研究所,广西南宁530007;广西农业科学院微生物研究所,广西南宁530007;广西农业科学院微生物研究所,广西南宁530007;广西农业科学院微生物研究所,广西南宁530007【正文语种】中文【中图分类】Q939.1【研究意义】裂壳菌(Schizothecium sp.)作为深色有隔内生真菌(Dark Septate Endophyte, DSE)的一个分类单元[1]，广泛分布于林地[2]、重金属矿区[3]、甘蔗种植区[4]、荒漠[5]和沙地[6]等生态环境的植被中，能定殖于多种植物根系中，形成真菌与根系的共生复合体。

随着研究的深入，人们发现极端或特殊生境中的DSE对促进宿主植物生长，提高耐受环境胁迫能力等方面有都发挥着重要作用[7-9]。

第34卷　第2期河南师范大学学报(自然科学版)V ol.34　N o.2　2006年5月J ournal of Henan N ormal Universit y(N atural S cience)M ay.2006 文章编号:1000-2367(2006)02-0106-04一株内生真菌的原生质体制备及再生过程研究郭丹钊,李　兰(河南科技学院生命科技学院,河南新乡453003)摘　要:通过对酶系组成和酶解条件的研究,得出了制备禾本科植物内生真菌N eot y phodi um sp.原生质体的最佳条件:鲜菌丝由10.3%蔗糖溶液预处理,酶系组成为1.5%崩溃酶、1.0%蜗牛酶、1.0%纤维素酶和2.0%溶菌酶,酶解温度32℃,p H6.8,酶解5h,原生质体得率达7.3×103个/mg鲜菌丝.另外,液体再生涂布平板法结合钙离子作用可使原生质体再生率达4.72%,为不含钙离子处理组的2.5倍.关键词:原生质体;内生真菌;N eot y p hodi um s p.;制备;再生中图分类号:Q813.2 文献标识码:A内生菌以禾本科植物内生真菌最为常见[1],这类内生真菌与其宿主植物有着密切的互利共生关系[2],但同时它会提高植物体内麦角碱类生物碱的含量,给畜牧业带来重大的损失[3].将内生真菌制备成原生质体[4],从而更便捷地进行遗传物质的改造,实现共生体品系的改良,是内生菌资源利用的一个重要方向.本文对一株禾本科植物内生真菌原生质体的制备与再生过程进行了研究,为进一步研究禾本科牧草2内生菌共生体系提供了理论和技术依据.1　材料与方法1.1　材　料内生真菌RB-1菌株(N eot y p hodi um s p.)由本实验室分离并初步鉴定.崩溃酶(SIGMA),其余试剂购自上海化学试剂公司.最小成分培养基(MM)(g/L):(N H4)2SO41;MgSO4・7H2O0.1;KH2PO43;K2H PO47;葡萄糖5;液体再生培养基:渗透压稳定剂(ST或STC)中加入0.5%酵母膏和0.7%葡萄糖.固体再生培养基: PDA培养基加10.3%蔗糖.双层固体再生培养基:下层为含2%琼脂的固体再生培养基,上层为含1%琼脂的固体再生培养基.渗透压稳定剂(p H7.5).ST等渗液:1mol/L山梨醇、20mmol/L Tris-HCl(p H7.5);STC等渗液: 1.2mol/L山梨醇、10mmol/L Tris-HCl(p H7.5)、50mmol/L CaCl2.1.2　方　法1.2.1　菌丝培养:将菌株接种于PDA培养基,8d后转接于30ml MM液体培养基中,于28℃静置培养.1.2.2　酶液的配制:用无菌的0.7mol/L NaCl溶液配置,经0.22μm微孔滤膜过滤除菌.1.2.3　原生质体的制备:取培养40d的菌丝经无菌水荡洗后用无菌滤纸吸去多余水分.称取0.1g鲜菌丝于2ml离心管中,加入酶液酶解0～8h,其间每隔5～10min颠倒离心管数次.随后加入1ml ST缓冲液750g离心5min.吸取酶解菌丝团上方约0.5ml的液相,适当稀释,通过血球计数板计算原生质体浓度和得收稿日期:2005-07-07基金项目:河南科技学院2004年度高层次人才科研项目(040125)作者简介:郭丹钊(1978-),女,江苏丹阳人,河南科技学院讲师,硕士,主要从事微生物资源开发利用的研究.率,并观察原生质体的释放方式[5].酶系组成、酶解反应温度、酶解时间、酶解液p H 值等设置见结果部分.1.2.4　原生质体的再生及再生形态的观察:分别吸取19.8ml 含ST 和STC (含Ca 2+)等渗液的液体再生培养基于50ml 离心管中,加入一定浓度的原生质体悬液0.2ml.混匀后,吸取0.1ml 的混合液加入到p H 6.8的液体再生培养基中或涂布于再生平板上,于28℃暗培养9～10h 后,取样于显微镜下观察其再生状态.继续培养7d 后统计再生菌落数,它与涂布原生质体数目的比值即为原生质体再生率.观测再生菌株的菌落形态、孢子大小和孢子梗长短,初步判断原生质体制备和再生过程对实验菌株的影响.2　结果与分析2.1　原生质体的制备2.1.1　原生质体的释放方式及酶系组成对原生质体制备的影响制备得到的原生质体直径主要集中于4～6μm (图1).经观察发现菌株RB -1有两种基本的原生质体释放方式:顶端释放:酶解初期,菌丝顶端出现孔洞,从中释放出一个至多个原生质体.原位释放:随着酶解时间的延长,菌丝的细胞壁被整个酶解,原生质体在原位形成球状体,单个或数个地呈串珠状排列.28℃下设计正交试验L 9(34)(表1),通过极差R 值的比较可以看出,这4种酶在消解细胞壁时所起的作用大小依次为崩溃酶>蜗牛酶>纤维素酶>溶菌酶,其优化配比为崩溃酶(1.5%)、蜗牛酶(1.0%)、纤维素酶(1.0%)和溶菌酶(2.0%).图2比较了优化酶系与等质量体积百分比(5.5%)的不同酶系制备原生质体的效果,可见优化酶系明显较相同用量的单一酶有更好的酶解效果,表明优化酶系中的各酶份能有效互补.表1　酶组合正交实验安排及结果处理崩溃酶/%蜗牛酶/%溶菌酶/%纤维素酶/%原生质体得率/(个・mg -1)10.50.5 2.0 1.0 1.6×1022 1.00.50.50.5 4.0×1023 1.50.5 1.0 2.0 1.4×10340.5 1.0 1.00.5 1.7×1025 1.0 1.0 2.0 2.08.0×1026 1.5 1.00.5 1.0 2.9×10370.5 2.00.5 2.0 2.6×1028 1.0 2.0 1.0 1.09.0×1029 1.5 2.0 2.00.5 2.7×103K 1 5.9×102 1.96×103 3.56×103 3.27×103K 2 2.1×103 3.87×103 2.47×103 3.96×103总和=9.69×103K 37.0×103 3.86×103 3.66×103 2.46×103R6.41×1031.91×1031.19×1031.5×1032.1.2　p H 值对原生质体制备的影响将2.1.1中筛选出的优化酶系p H 值分别设置为5.8、6.2、6.5、6.8、7.1和7.5,结果显示在p H 6.8时701第2期 郭丹钊等:一株内生真菌的原生质体制备及再生过程研究综合酶效最高(图3),原生质体得率为6.1×103个/mg鲜菌丝.2.1.3　酶解温度和时间对原生质体制备的影响对优化酶系进行28℃、32℃和35℃3个温度处理,由图4可见,在32℃处理下原生质体得率最高.由图5随酶解时间的延长原生质体产量不断提高,至酶解5h 时达到最大值,随后原生质体数量呈下降趋势,这是由于过量酶解造成原生质体破裂速度大于其形成速度所致.2.1.4　菌丝预处理对原生质体制备的影响用10.3%的蔗糖溶液预处理菌丝0.5h ,后续原生质体制备步骤同上.测得此法原生质体得率为7.3×103个/mg 鲜菌丝,较无菌水处理对照组的原生质体得率(6.1×103个/mg 鲜菌丝)高出近20%.2.2　原生质体的再生2.2.1　再生方法和Ca 2+对再生率的影响再生方法:液体再生涂布平板法和双层固体再生法对3种原生质体再生方法———液体再生法进行了比较.结果表明液体再生法无法获得和筛选再生菌株;双层固体再生法操作繁琐,融化温度不易控制且再生率低(<<1‰);液体再生涂布平板法先把原生质体悬浮液转移到液体再生培养基中使其在液相中再生5h ,再涂布到固体再生培养基上,克服了以上两种方法的不足,原生质体再生率为1.85%.Ca 2+的影响:液体再生培养基中分别添加ST 和STC (含Ca 2+50mmol/L )两种等渗液,原生质体经此处理后,分别涂布至固体再生培养基上,待菌落长出后计算再生率.结果显示液体再生涂布平板法结合钙离子作用可使原生质体再生率达到4.72%(表2),为不含Ca 2+的ST 组的2.5倍.表2　Ca 2+对菌株RB -1原生质体再生率的影响处理ST STC 再生率/% 1.85 4.722.2.2　原生质体的再生过程取再生培养9～10h 时的培养物进行观察,原生质体由于再生的不同步性可使得在同一视野内同时呈现各种再生阶段(图6).结果显示菌株RB -1原生质体的再生方式有两种:一种是原生质体上首先伸出一突起物(或称芽)(图6a ),随后该突起物逐渐增大并延伸成一条菌丝(图6c ),进而发育成正常菌丝(图6d ,e );另一种为原生质体类酵母状分裂(图6b ),而后在酵母状串珠链的一端或两端形成芽管,进而发育为菌丝.经再生培养,菌株RB -1的原生质体再生并在平板上长成菌落(图6f ),再生后的菌株记录为RB -1R.2.2.3　再生菌株部分形态学特征描述根据表3的结果,初步判定再生菌株无显著变异.表3　再生菌株RB -1R 与出发菌株RB -1的形态学特征比较菌株菌落形态特征生长速度/(mm ・d -1)孢子形态孢子大小/μm孢子梗大小/μm隔膜RB -1棉质,致密,白色0.6柠檬型 4.8×3.617.4×2.6无RB -1R棉质,致密,白色0.7柠檬型5.0×2.919.6×2.6无3　结　论本研究成功地实现了禾本科植物内生真菌N eot y p hodi um s p.原生质体的制备和再生.得到了制备原生801河南师范大学学报(自然科学版) 2006年质体的最佳条件(原生质体得率可达7.3×103个/mg 鲜菌丝).液体再生涂布平板法结合钙离子作用可使原生质体再生率达到4.72%,较不含钙离子的处理组高出2.5倍.经此再生法得到的再生菌株初步判断无显著变异.参　考　文　献[1]　邹文欣,谭仁祥.植物内生菌研究新进展[J ].植物学报,2001,43(9):881-892.[2]　Clay K.Fungal endophytes of grasses :a defensive mutualism between plants and f ungi[J ].Ecology ,1988,19:10-16.[3]　Hoveland C S.Importance and economic Significance of the Acremonium endophytes to performance of animals and grassplant [J ].Ecosystems &Environment ,1993,44:1-2.[4]　谭周进,肖启明,肖克宇.原生质体融合技术在微生物菌种选育中的应用[J ].生物技术,2003,13(1):35-36.[5]　Murray F R ,Latch G C M ,Scott D B.Surrogate transformation of perennial ryegrass ,Lolium perenne ,using genetical 2ly modified Acremonium [J ].Mol G en Genet ,1992,233:1-9.Protoplast Preparation and R egeneration from a G ramineous E ndophyteGUO Dan 2Zhao ,L I Lan(College of Life Science and Technology ,Henan Institute of Science and Technology ,Xinxiang 453003,China )Abstract :By studying the enzyme combinations and factors of enzyme 2hydrolysis ,the conditions for protoplast prepara 2tion f rom gramineous endophyte Neotyphodium sp.were optimized.While hyphae were digested by enzyme combination (p H6.8)consisting of 1.5%driselase ,1%snailase ,1%celluase and 2%lysozyme for 5h at 32℃,the protoplasts were obtained at the percentage of 7.3×103/mg.The results showed that the protoplast regeneration rate could amount to 4.27%with liquid 2solid culture method and CaCl 2treatment ,which was 2.5times higher than that in C K.K ey w ords :protoplast ;gramineous endophyte ;N eot y p hodi um s p.;preparation ;regeneration901第2期 郭丹钊等:一株内生真菌的原生质体制备及再生过程研究。

禾本科内生真菌研究15：禾本科内生真菌Epichlo(e)yangzii原生质体的制备与再生吴正钢;汪捷;谢薇薇;陈永敢;王志伟【摘要】为高效获得内生真菌Epichlo? yangzii Rnj5706菌株的原生质体,分别检测酶系组合、稳渗剂、pH值、酶解温度等因子对E.yangzii原生质体制备的影响.结果表明:制备E.yangzii原生质体的优化条件为液体培养48 h的鲜菌丝在pH值6.8含0.7 mol/L NaCl的酶解液(1.5％崩溃酶、1.0％蜗牛酶、1.0％纤维素酶、2.0％溶菌酶)中32℃酶解4h,这时的原生质体得率为39.2×105个/mL酶解液.并比较不同保存时间下的原生质体的再生比率,表明随保存时间延长,再生比率急剧下降.本研究关于E.yangzii原生质体的制备和再生方法,为内生真菌遗传操作等后续研究提供了基础.【期刊名称】《江苏农业科学》【年(卷),期】2012(040)002【总页数】4页(P17-20)【关键词】Epichlo(e) yangzii;原生质体;制备;酶系组合;再生【作者】吴正钢;汪捷;谢薇薇;陈永敢;王志伟【作者单位】南京农业大学生命科学学院微生物学系,江苏南京210095;南京农业大学生命科学学院微生物学系,江苏南京210095;南京农业大学生命科学学院微生物学系,江苏南京210095;南京农业大学生命科学学院微生物学系,江苏南京210095;南京农业大学生命科学学院微生物学系,江苏南京210095【正文语种】中文【中图分类】Q813.2致谢：南京农业大学纪燕玲老师和彭飞同学参与了部分工作，特此感谢！植物内生真菌(fungal endophytes)是指那些在其生活史的部分或全部阶段生活于健康植物的组织或器官内部，但其宿主植物不表现出外在病害症状的真菌。

现已在80多个属的几百种禾本科植物中发现有Epichlo⊇和Neotyphodium内生真菌的存在，这类内生真菌与宿主植物有密切的互利共生关系，能给植物带来优异的促生长、促分蘖、抗旱、抗病虫、抗食草动物等特性[1-2]。

实验四黑曲霉原生质体的制备及再生一、实验目的1、掌握黑曲霉培养的方法；2、熟悉黑曲霉原生质体的制备方法；3、懂得原生质体的再生原理。

二、实验原理获得有活力、去壁较为完全的原生质体对于随后的原生质体融合和原生质体再生是非常重要的。

制备原生质体的脱壁酶只能采用滤菌器去菌，对于细菌和放线菌，主要采用溶菌酶；对于酵母菌和霉菌，则一般采用蜗牛酶和纤维素酶。

影响原生质体制备的因素有许多，主要有以下几个方面。

⑴菌体的预处理在使用脱壁酶处理菌体以前，先用某些化合物对菌体进行预处理，有利于原生质体制备。

例如用EDTA(乙二胺四乙酸)、甘氨酸、青霉素或D-环丝氨酸等处理细菌，可使菌体的细胞壁对酶的敏感性增加。

EDTA能与多种金属离子形成络合物，避免金属离子对酶的抑制作用而提高酶的脱壁效果。

甘氨酸可以代替丙氨酸参与细胞壁肽聚糖的合成，其结果干扰了细胞壁肽聚糖的相互交联，便于原生质体化。

⑵菌体的培养时间为了使菌体细胞易于原生质体化，一般选择对数生长期后期的菌体进行酶处理。

这时的细胞正在生长、代谢旺盛，细胞壁对酶解作用最为敏感。

采用这个时期的菌体制备原生质体，原生质体形成率高，再生率亦很高。

⑶酶浓度一般地说，酶浓度增加，原生质体的形成率亦增大，超过一定范围，则原生质体形成率提高不明显。

酶浓度过低，则不利于原生质体的形成；酶浓度过高，则导致原生质体再生率的降低。

为了兼顾原生质体形成率和再生率，有人建议以使原生质体形成率和再生率之乘积达到最大时的酶浓度为最适酶浓度。

⑷酶解温度温度对酶解作用有双重影响，一方面随着温度升高，酶解反应速度加快；另一方面，随着温度升高，酶蛋白变性而使酶失活。

一般酶解温度控制在20～40℃。

⑸酶解时间充足的酶解时间是原生质体化的必要条件。

但是如果酶解时间过长，则再生率随酶解的时间延长而显著降低。

其原因是当酶解达到一定的时间后，绝大多数的菌体细胞均已形成原生质体，因此，再进行酶解作用，酶便会进一步对原生质体发生作用而使细胞质膜受到损伤，造成原生质体失活。

收集原生质体液 4000r/min室温离心10min，收集原生质体沉淀 去上清，沉淀用1mol/L 山梨醇溶液洗涤2次，每次4000r/min离心10min 弃上清将原生质体悬浮于5mL 1mol/L 山梨醇溶液中，-70℃冰箱冷冻保存备用
将制备好的原生质体溶液3200r/min，4℃离 心10min；
经四层无菌镜头纸过滤，制成孢子浓度约为107个/mL的单 孢子悬浮液
将上述制得的孢子悬浮液每1mL接种于一瓶盛有50mL菌丝 培养基的三角瓶中，于30℃静止培养23~25h
6000r/min，离心10min收集幼嫩的菌丝体 用无菌水洗涤菌丝体，4000r/min，离心5min收集菌丝体
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弃上清，沉淀重悬于预冷的STC溶液中，将原 生质体浓度调整为5×106 ~ 5×107个细胞 /mL；
将约2~5µg质粒DNA(体积不超过10µL)与 100µL米曲霉原生质体置冰上轻轻混匀；
加入25µL PTC溶液，冰浴20min；
加入1 mL PTC溶液，室温放置15min；
最后加入2mL STC溶液，混匀。
文献汇报
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培养基成分 高渗溶液（有机/无机）
缓冲液的pH（5.8-7.4） 酶解条件（时间/各种酶的比例）
酶液用高盐还是高渗缓冲液配 擦镜纸收集菌丝体or离心收集菌丝体
双层or单层培养基
高渗缓冲液：
《微生物学实验教程》 周德庆（酵母）
1、接种于液体培养基上培养。
高渗缓冲液：
蔗糖0.5mol/L, MgCl2 10mmol/L,Tris-HCl(pH 7.4) 10mmol/L
2、取培养液10ml，4000r/min离心5min, 弃上清液，用TrisHCl(pH 7.4)、0.5mol/LEDTA、高渗缓冲液各洗涤一次。

黑曲霉原生质体的制备、再生及转化条件姚婷婷;王正祥【期刊名称】《食品与生物技术学报》【年(卷),期】2006(025)004【摘要】为了建立原生质体介导的黑曲霉转化系统,研究了菌龄、酶系统、渗透压稳定剂、酶解时间对葡萄糖淀粉酶生产菌株黑曲霉CICIM F0410原生质体形成与再生的影响.结果表明,培养4 d的幼嫩菌丝体最适于制备原生质体;综合考虑原生质体形成与再生的情况,作者选用1 mol/L山梨醇为最适渗透压稳定剂,1 g/dL蜗牛酶-1 g/dL纤维素酶-0.1 g/dL溶壁酶为最适裂解酶组合,30 ℃酶解2.5～3 h,最适合的原生质体的再生培养基为含0.6 mol/L MgSO4的TZ培养基.在PEG和CaCl2存在条件下,以潮霉素B为选择性标记,质粒pBC-Hygro转化原生质体,每微克DNA可获得4～5个转化子.【总页数】5页(P116-120)【作者】姚婷婷;王正祥【作者单位】江南大学,工业生物技术教育部重点实验室,江苏,无锡,214036;江南大学,工业生物技术教育部重点实验室,江苏,无锡,214036【正文语种】中文【中图分类】Q786【相关文献】1.1株产酸性α-淀粉酶黑曲霉原生质体制备和再生条件优化 [J], 王发祥;俞健;王建辉;李向红;何纪华;刘永乐2.顶头孢霉原生质体制备、再生及带vgb基因的质粒DNA转化条件的研究 [J], 戴秀君;马文婵;李术娜;王全;李红亚;朱宝成3.黑曲霉Ni-5k原生质体的制备和再生 [J], 朱萍;梁海秋;张弘;周河治4.产植酸酶黑曲霉Px原生质体的制备与再生 [J], 张卫兵;甘伯中;李帆;郭爱莲5.黑暗链霉菌原生质体制备、再生及其DNA转化条件的研究 [J], 吴胜;夏焕章;程杉因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

王利娟等： 植物内生真菌分离培养的研究方法
: 8
水冲洗表面残留的消毒剂。家庭用的 ! " # $ %漂 白剂用水稀释至& ’! ( ) ’ 就是最常用的表面消
［ ］ & 毒剂 ， 由于商业次氯酸盐溶液浓度、 可用有效
有时将表面活性剂 （如 ; ） 和消毒剂结合 < 2 2 . = > ) 使用， 消毒后将组织在无菌水或 8 ) ’! 9 : ’ 的乙 醇中浸泡(? 6 .以除去残留的消毒剂。其他的消 毒剂在内生菌研究中并不常用， 包括硝酸银、 氯化 汞 （升汞） 、 福尔马林 （甲醛水溶液） 、 乙醇或丙烯氧 化物。由于升汞的毒性残留以及对自然环境的破 坏作用， 现在国外很少使用， 而是使用一些具有相
高等植物是复杂多样的， 它为各种各样的微 生物提供生存环境。这些微生物中主要是真菌， 有的生活在叶和嫩枝等的表面 （称为表生菌） ， 有 的生活在叶内部组织中 （称为叶内生菌） ， 有的则 生活在树皮中 （称为树皮内生菌） ， 还有的生活在 木材中 （如木质部内生菌和木材腐生菌） 。健康植 物内部组织的内生菌引起越来越多科学家的兴 趣， 从目前己经研究过的植物来看， 可以推断内生 真菌在植物体内是普遍存在的。通过对内生真菌 和宿主专一性分析， 平均每种宿主有! * 种专性 内生真菌， 按地球上有 " 内生真 * 万种植物计算， 菌总数可能超过 # $ $
［ ］ ’ 根菌和假菌根菌） 应属于内生菌 。目前， 关于内
等植物很可能是隐匿着未知真菌的宝库。本文主 要从! 个方面对内生真菌的研究方法进行了简要 综述。
> 植物内生真菌的定义
要弄清内生真菌的定义， 首先要明白内生菌
生菌的概念范畴仍有很大的争议， R = A @ 2 7 2提出的 ［ ］ ’ 内生菌概念被广泛接受 。 植物内生菌包括内生细菌、 内生放线菌和内 生真 菌 。 然而， 过 去’ $ 6中 ， = 7 F G < A =和= 7 F G 3 J K

为原生质体，加入适量 ＳＴＣ 溶液悬浮原生质体，
在同样条件下离心 ２ 次后，弃上清收获原生质体，
用 １ ｍＬ 的 ＳＴＣ 溶液悬浮原生质体计算产量后，
再用 ＳＴＣ 稀释原生质体到合适的浓度，分装保存
在 －８０℃冰箱备用。
１．２．４ 原生质体制备条件的优化 （１） 酶种类
及酶组合： 用 ０．７ ｍｏｌ ／Ｌ ＮａＣｌ 溶液配 制浓度为
山 东 农 业 科 学 ２０１４，４６（８）：１０９ ～１１２
Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
苹果腐烂病菌原生质体制备与再生条件优化
陈亮１ ，伦莹莹１ ，孙庚午１ ，赵迎彤１ ，何邦令１ ，王洪凯２倡 ，刘会香１倡
（１．山东农业大学植物保护学院，山东 泰安 ２７１０１８； ２．浙江大学生物技术研究所，浙江 杭州 ３１００５８）
１１０
山 东 农 业 科 学 第 ４６ 卷
的必要和关键。 对于真菌的原生质体的制备技 术，国内外文献均有记载［１０ ～１２］ ，但由于不同真菌 细胞壁组成成分有所不同，因此酶解的条件差异 较大。 本研究首次对苹果腐烂病菌原生质体的制 备及再生条件进行了优化，获得了一种高效制备 苹果腐烂病菌原生质体的方法，为建立该病菌的 遗传转化及其他相关研究奠定了基础。
关键词：苹果腐烂病菌；原生质体；制备；再生 中图分类号：Ｓ４３６．６１１．１ ＋１ 文献标识号：Ａ 文章编号：１００１ －４９４２（２０１４）０８ －０１０９ －０４
Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｖａｌｓａ ｍａｌｉ ｖａｒ．ｍａｌｉ
１ 材料与方法
１．１ 试验材料 １．１．１ 菌株及试剂 供试菌株为苹果腐烂病菌 （Ｖａｌｓａ ｍａｌｉ ｖａｒ．ｍａｌｉ） ＳＤＡＵ１１ －１７５ 菌株，由本 实验室保存。 试剂为崩溃酶（Ｄｒｉｓｅｌａｓｅ） 和溶壁酶 （Ｌｙｚｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅｓ），美国 Ｓｉｇｍａ 公司产品。 １．１．２ 培养基 ＰＤＡ 培养基（ 常规方法），ＰＤＢ 培养基（ ＰＤＡ 配方中不添加琼脂粉），ＰＤＳ 培养基 （ＰＤＡ 基配方的基础上添加 １ ｍｏｌ ／Ｌ 蔗糖），ＹＰＤ 培养基（ Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ｐｅｐｔｏｎｅ ｄｅｘｔｒｏｓｅ ｍｅｄｉｕｍ ，酵 母提取物 ３．５ ｇ，蛋白胨 ５ ｇ，葡萄糖 １０ ｇ，琼脂粉 １５ ｇ，加水至 １ Ｌ），ＹＰＳ 培养基（ Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ｐｅｐ－ ｔｏｎｅ ｓｕｃｒｏｓｅ ｍｅｄｉｕｍ， ＹＰＤ 配 方 基 础 上 添 加 １ ｍｏｌ ／Ｌ蔗 糖）。 ＳＴＣ 配 方： １．２ ｍｏｌ ／Ｌ 山 梨 醇， １０ ｍｍｏｌ ／Ｌ Ｔｒｉｓ －ＨＣｌ，ｐＨ ７．５，５０ ｍｍｏｌ ／Ｌ ＣａＣｌ２ 。 １．２ 试验方法 １．２．１ 酶解液的配制 配制 ０．７ ｍｏｌ ／Ｌ ＮａＣｌ 溶 液，经高温灭菌后，室温存贮备用。 ６％的酶解液 （崩溃酶∶溶壁酶 ＝１∶１） 用上述 ＮａＣｌ 溶液进行溶 解，待酶完全溶解后，用 ０．２５ μｍ 的微孔滤膜过 滤除菌后，４℃保存备用。 １．２．２ 菌丝体的制备 取纯培养后的苹果腐烂 病菌株接种到 ＰＤＡ 平板上，２８℃培养 ３ ｄ 后，在 菌落上加入 ３ ｍＬ 无菌水，用灭菌的涂布器打断菌 丝，将菌丝转移到盛有 ２００ ｍＬ ＰＤＢ 的三角瓶中， 在 ２８ ℃、１２０ ｒ ／ｍｉｎ 的摇床震荡培养 ５４ ｈ。 菌丝 体用 ４ 层灭菌纱布过滤，并用 ０．７ ｍｏｌ ／Ｌ ＮａＣｌ 冲 洗 ３ 次后收集菌丝体，灭菌滤纸上吸干水分。 １．２．３ 原生质体的制备过程 称取 １．０ ｇ 上述 鲜菌丝，盛于 ５０ ｍＬ 的离心管中，加入 １０ ｍＬ 按 １．２．１ 方法配制好的酶解液，在 ２８ ℃、１００ ｒ ／ｍｉｎ 的摇床上震荡酶解 ３ ｈ 后，用 ２ 层灭菌擦镜纸过 滤酶解 液， 用 ０．７ ｍｏｌ ／Ｌ ＮａＣｌ 溶 液 冲 洗 ２ 次， ４℃、３ ０００ ｒ ／ｍｉｎ 离心 １０ ｍｉｎ，弃上清液，沉淀即