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专题一传统发酵技术的应用课题1 果酒和果醋的制作1．果酒制作的原理（1）人类利用微生物发酵制作果酒，该过程用到的微生物是，它的代谢类型是，其大量繁殖时的方程。
进行发酵的方式式是。
（2）果酒制作条件传统发酵技术所使用的酵母菌的来源是。
酵母菌生长的最适温度是； PH呈；（3）红色葡萄酒呈现颜色的原因是：酒精发酵过程中，随着的提高，红色葡萄皮的进入发酵液，使葡萄酒呈色。
（4）在、的发酵液中，酵母菌可以生长繁殖，而绝大多数其它微生物都因无法适应这一环境而受到抑制。
2．果醋的制作原理（1）果醋发酵菌种是，新陈代谢类型。
（2）当氧气和糖源充足时醋酸菌将糖分解成，当糖源不足时醋酸菌将变为再变成醋酸，其反应式。
3．操作过程应注意的问题（1）为防止发酵液被污染，发酵瓶要用消毒。
（2）葡萄汁装入发酵瓶时，要留出大约的空间，为什么。
（3）制作葡萄酒时将温度严格控制在。
制葡萄醋的过程中，将温度严格控制在，并注意适时充气，为什么。
4．酒精的检验（1）试剂：。
（2）条件及现象：在条件下，反应呈现。
5.制作果酒、果醋的实验流程挑选葡萄→→→→↓↓果酒果醋6．你认为应该先洗葡萄还是先除去枝梗，为什么？。
7.每次排气时只需拧松瓶盖，不要完全揭开瓶盖；制醋时，再将瓶盖打开，盖上一层纱布，进行葡萄醋的发酵，其目的是。
8.排气口要通过一个长而弯曲的胶管与瓶身连接，其目的是。
课题2 腐乳的制作1.制作原理（1）．经过微生物的发酵，豆腐中的蛋白质被分解成小分子的和，脂肪被分解成和，因而更利于消化吸收。
（2）．腐乳的制作过程中起主要作用的微生物是。
它是一种丝状。
（3）．现代的腐乳生产是在严格的条件下，将优良菌种直接接种在豆腐上，这样可以避免其他菌种的，保证产品的质量。
2. 腐乳制作的实验流程：让豆腐长出→→→密封腌制。
3.实验注意事项（1）在豆腐上长出毛霉时，温度控制在，自然条件下毛霉的菌种来自空气中的。
（2）将长满毛霉的豆腐块分层加盐，加盐量要随着摆放层数的加高而，近瓶口的表层要。
一种保藏酵母菌的方法技术领域本发明涉及一种保藏酵母菌的方法，属于酵母菌的保藏技术领域。
背景技术酵母为单细胞真菌，是子囊菌、担子菌等几科单细胞真菌的通称。
酵母无害，容易生长，可将大分子物质分解成细胞新陈代谢易于利用的小分子物质，属于异养生物。
酵母菌是人类文明史中被应用得最早的微生物，其既可用于酿造生产，又是遗传工程和细胞周期研究的模式生物，受到广大科研工作者的青睐。
酿酒酵母在分子遗传学方面被人们的认识最早，也是最先作为外源基因表达的酵母宿主，毕赤酵母作为宿主的外源基因表达系统近年来发展迅速，应用也最为广泛，此外，汉逊酵母中较高的目的蛋白表达量使得其也日益应用于大规模生产中。
随着大量新型酵母工程菌株的构建，酵母工程菌的培养与保存成为了影响其蛋白表达的重要因素：菌种保存方法得当，复苏后酵母生长状态良好，目的蛋白表达量高，产量大大提高。
传统的酵母菌保藏方法主要有两种，一，酵母菌保存于含有一定比例甘油的培养基中，于低温或液氮中保存；二，将酵母中加入脱脂奶粉等保护剂，进行冻干保存。
传统的方法，可以使得酵母成功地复苏培养，逐级放大生产，实现目的蛋白的表达与收获。
然而，传统的保藏方式会造成酵母菌的大量死亡，尤其随着保存时间的增加，酵母的活菌率呈现明显的下降趋势，影响了复苏后的酵母扩大培养。
发明内容本发明的目的在于提供一种提高酵母菌复苏时活菌率的保藏酵母菌的方法、利用该方法保藏的酵母工程菌的目的蛋白表达量也能够获得显著提高。
本发明提供的一种保藏酵母菌的方法，是在酵母菌液中加入甘油和琼脂，混匀后迅速置于液氮中冷冻，之后于-20℃以下长期保藏。
其中，酵母菌液中甘油的终浓度为12％-18％，琼脂的终浓度为0.02％-0.1％，所述％为质量百分比。
优选地，酵母菌液中甘油的终浓度为14％-16％，琼脂的终浓度为0.03％-0.07％，所述％为质量百分比。
更优选地，酵母菌液中甘油的终浓度为15％，琼脂的终浓度为0.05％，所述％为质量百分比。
酵母菌的冷冻保藏方法
酵母菌的冷冻保藏方法可以分为以下几个步骤：
1. 选择合适的培养基：酵母菌的冷冻保存需要使用特定的培养基。
一般常用的培养基有YEPD（yeast extract peptone dextrose），YPD（yeast extract peptone glucose）等。
2. 准备冷冻培养基：根据所使用的培养基配方准备适量的冷冻培养基，并添加适量的甘油（最常用浓度为20%）作为保护剂。
3. 收集酵母菌：从已培养的酵母菌液体培养物或固体培养物中取出适量的酵母菌。
4. 制备冻存管：在已准备好的冷冻培养基中加入酵母菌，混匀后加入冻存管中。
每个冻存管一般加入适量的酵母菌液体培养物（一般为1-2 mL），然后密封。
5. 冷冻：将密封的冻存管放入低温冰箱或液氮罐中冷冻保存。
温度一般可以设置为-80℃或更低的温度。
6. 保存：将冷冻保存的酵母菌定期检查，并在需要时重新接种到新的培养基上进行培养。
需要注意的是，冷冻保存的酵母菌应该尽可能快地进行解冻，并立即接种到适当的培养基上进行培养，以确保存活率。
微生物菌种保藏方法
微生物菌种的保藏是非常重要的，因为这些菌种可能用于各种实验和研究中。
以下是一些常见的微生物菌种保藏方法：
1. 冷冻保存：将菌种在液氮或-80的冰箱中冷冻保存。
这是最常见的保藏方法，能够长期保存菌株并保持其遗传稳定性。
2. 干燥保存：将菌种在无菌室中取出，用无菌纸或吸水纸吸干，然后放入无菌瓶中密封保存。
干燥保存适用于某些孢子或芽孢的微生物，比如放线菌、链霉菌等。
3. 明胶斜培养基保存：将菌种接种在含有明胶的固体培养基上，然后密封保存。
这种方法适用于某些菌株，如革兰氏阳性菌和厌氧菌。
4. 低温保存：将菌种保存在4的冰箱中。
这种保存方式可以在短时间内保持菌株的活性，但不能长期保存。
5. 液氮保存：将菌种在锅内预冷冷冻过的无菌玻璃管中加入10%甘油或蔗糖，然后立即在液氮中保存。
这种方法适用于大多数微生物，并且可以长期保存。
关于菌种的保存方法导言菌种的保存是保障微生物研究的重要环节。
微生物资源的丧失对生物科技研究以及工业发展都会带来严重的影响。
因此，科学有效地保存菌种对于保护和利用微生物资源至关重要。
本文将介绍常见的菌种保存方法和技术，旨在帮助科学家和研究人员更好地保存和利用菌种资源。
常见菌种保存方法常温冷冻保存法常温冷冻保存是一种方便简单、成本低廉的菌种保存方法。
常见的常温冷冻保存方法有以下几种：1. 菌种液体冷冻保存：将菌种培养物添加到一定浓度的甘油或乙二醇溶液中，并将其储存于-80的冷冻库中。
这种方法可使菌种长期保存，并保持较高的存活率。
2. 菌种冻干保存：将菌种培养物培养到稳定的菌落状态后，直接将其放入真空冷冻干燥机中，去除菌种中的水分，然后存放于常温下。
这种方法适用于一些耐冷冻干燥的菌种。
3. 菌种在琼脂平板上保存：将菌种制备成沉淀后，均匀涂布在琼脂平板上，经过一定的处理后存放于室温下。
这种方法适用于一些菌种，如革兰氏阳性菌。
低温冷冻保存法低温冷冻保存是较为常用的一种菌种保存方法。
常见的低温冷冻保存方法有以下几种：1. 液氮冷冻保存：将菌种培养物中的菌液通过快速冷冻的方法将其冻结成冷冻物，并储存在液氮罐中。
这种保存方式可以确保菌种较好地保存，并且存活率较高。
2. 低温保存箱保存：将菌种培养物制备成菌种沉淀后，将其存放于-20或-80的低温保存箱中。
这种方法适用于一些需要长期保存的菌种。
菌种保存技术无菌操作在菌种保存的过程中，无菌操作是非常重要的。
无菌操作可以有效避免细菌污染，确保保存的菌种的纯度和保存质量。
1. 工作台的消毒：在进行菌种保存操作之前，需要将工作台表面进行消毒处理，如用75%的酒精擦拭表面。
2. 实验器具的灭菌：将实验器具在高温或高压条件下进行灭菌处理，以确保无菌操作的进行。
3. 空气的灭菌：在无菌操作的环境下，可以通过紫外线灭菌等方法来净化空气，避免空气中的微生物污染。
菌种保存记录在菌种保存的过程中，正确记录菌种保存的相关信息非常重要。
食用菌菌种保藏的6种方法
菌种保藏的目的是通过降低菌种的代谢活力，使其处于休眠状态，减缓衰亡速度，保持菌种原有优良性状，防止杂菌污染；当恢复生活条件时，菌种能在很短时间内恢复生机，迅速生长繁殖。
母种的保藏有如下方法：
1.斜面冰箱保藏法：把生长丰满健壮的斜面母种，把棉塞在管口剪平，用蜜蜡封口或换用胶塞，存放于摄氏4度冰箱内保存。
高温菌在16摄氏度为宜。
有效期3—6个月。
2.石蜡油保藏法：斜面母种注入经二次灭菌后，在摄氏40度温箱2天蒸发水分而冷却了的石蜡油至斜面顶尖1—1.5厘米处，再用蜜蜡封管口或换用胶塞，直立于摄氏4度冰箱或室温存放。
保存期可1—2年。
3.孢子保藏法：用2×0.5×0.8厘米经灭菌的滤纸条吸附上孢子，可参考孢子分离法，然后把带孢子的纸条放入无菌试管内，置干燥器内2—3天吸干水分，再改用胶塞。
在冰箱或室温内可保存多年。
4.菌丝球保藏法：常用经灭菌的生理盐水、无菌水、蒸馏水、营养液等装入试管约5毫升作媒介，把经过液体培养至对数生长期的菌丝球4—5个，移入媒介内，用胶塞封口，冰箱摄氏4度或室温可保存1—2年。
5.液氮保藏法：常用经灭菌10%甘油蒸馏水或10%二甲基亚砜蒸馏水为保护剂，注入斜面母种管，刮下菌丝体成悬浮液或孢子液，吸取菌液0.5—0.8毫升注入已灭菌安瓿管，
熔封管口，置液氮冷冻器内，每分钟降摄氏1度，1小时内使其温度降至摄氏负35度，其后迅速降至气相摄氏负150度，液相摄氏负196度保存。
保存期可超过10年。
6.自然基质保藏法：此法多用于原种保藏。
在一些欠设备的地区，也可作母种保藏法。
酵母菌菌种保藏技术规程1范围本规程规定了酵母菌菌种保藏的技术和程序。
本规程适用于酵母菌菌种的保藏。
2术语和定义下列术语和定义适用于本规程2.1定期移植法subculturing亦称传代培养保藏法，指将菌种接种于适宜的斜面培养基上，最适条件下培养，待得到健壮的菌体后，于4～6℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养的一种短期菌种保藏方法。
2.2蒸馏水法preservation in distilled water指将欲保藏的菌种细胞悬浮于无菌蒸馏水中，密封后置于4～6℃保存的一种菌种保藏方法。
2.3液体石蜡法preservation in liquid paraffin亦称矿物油保藏法，定期移植保藏法的辅助方法。
指将菌种接种在适宜的斜面培养基上，最适条件下培养至待得到健壮的菌体后注入灭菌的液体石蜡，使其覆盖整个斜面，再直立放置于低温（4～6℃）干燥处进行保存的一种菌种保藏方法。
2.4－80℃冰箱冻结法preservation at －80℃指将菌种悬浮于保护剂中，在－80℃冰箱中冻结保存的一种长期菌种保藏方法。
2.5液氮超低温冻结法preservation in liquid nitrogen指悬浮于保护剂中的菌种经程控降温后，移置于－196℃的液氮或－150℃左右的液氮气相中保存的一种长期菌种保藏方法。
2.6真空冷冻干燥法freeze-drying指将欲保藏的菌种细胞或孢子悬浮于保护剂中，经预冻后在真空条件下使水分升华，再经真空封存后保存的一种长期菌种保存方法。
3保藏准备工作3.1菌种待保藏的酵母菌菌种必须进行分离纯化，得到纯培养后再进行保藏。
3.2工具、材料接种针或接种环、吸管、镊子、75%酒精棉球、酒精灯、试管架、量筒、烧杯、平皿、标签、波美计等。
3.3器皿3.3.1试管选用平口试管，规格一般为15×150mm。
3.3.2安瓿管制安瓿管的材料应为中性玻璃，质地软硬度要适当。
管的内径为8mm，长度不小于100mm。
果酒酵母发酵及菌种保藏选取1-2种酿酒酵母进行小型酿酒实验，在品尝合格并符合规定的感官及理化指标后，选用常用菌种保藏方法对有价值的菌种进行保藏。
1.实验目的和内容1）掌握果酒酿造的原理并对筛选果酒酵母菌种进行发酵性能测定（起酵时间、产酒精度、耐受性能）。
2）用选育果酒酵母进行小型酿酒实验，掌握果酒酿造一般工艺流程。
3）了解并掌握菌种保藏的常用方法及其优缺点。
4）学习几种常用菌种保藏方法：斜面传代保藏方法、液体石蜡保藏方法、沙土管保藏方法、冷冻干燥保藏方法。
2.实验原理果酒发酵：果浆或果汁中的葡萄糖和果糖在酵母菌的作用下，最后生成酒精和二氧化碳。
可用以下反应式来说明：果酒发酵是一个极其复杂的生物化学现象。
在每一步反应过程中都有酶的参与，除了最后生成酒精、二氧化碳和少量的甘油、高级醇类、醛类物质之外，还会生成二磷酸己糖、磷酸甘油醛、丙酮酸、乙醛等许多中间产物。
果酒的发酵分主发酵和后发酵两个阶段，主发酵是将发酵液的糖分变成酒精，后发酵是继续分解残糖为酒精，加速酒的转化，使酒更加稳定。
用人工培养的酵母发酵的称为人工发酵，利用天然酵母发酵的称为自然发酵。
按照工艺的不同又可分为渣汁混合发酵和渣汁分离发酵两种形式。
微生物具有容易变异的特性，因此经过分离纯化选育的酿酒酵母要经历长期的保存必须要用实验方法对其保藏，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。
低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏方法虽多，但都是根据这三个因素而设计的。
保藏方法大致可分为以下几种：1）传代培养保藏法又称斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等（后者作保藏厌氧细菌用），培养后于4-6℃冰箱内保存。
2）液体石蜡覆盖保藏法是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。
一、引言酿酒酵母细胞透明, 呈圆形或椭圆形, 形体比较大, 一般为7×12μm, 含有转化酶能将葡萄汁中的糖转化成乙醇、二氧化碳和其它代谢产物。
优良纯种酵母应具备下列性能: （1）除酿酒水果本身的果香外, 酵母也应产生良好的果香与酒香。
（2）生长速度快, 有较高的发酵能力, 能将糖分全部发酵完。
（3）具有较高的抗S02能力, 有较好的凝集力和较快的沉降速度。
（4）培养基成分简单, 来源广泛, 价格低廉, 对温度, pH, 离子强度, 溶氧等环境因素不敏感。
（5）能在低温或果酒适宜温度下发酵, 以保持果香和新鲜清爽的口味。
由此可见, 酵母的品质对果酒的产量和质量影响很大。
要获得优良的酿酒酵母, 必须对其进行分离选育。
果酒酵母的筛选应从相应的果品及其种植环境中采样分离, 如成熟果实的表皮、自然腐烂发酵的果肉或果汁和果园的土壤等相关场所。
根据实践经验, 在果汁和自然发酵的果酒醪液中检出率较高, 因为它们的基质环境与酿酒环境很相似。
为使我们需要的酵母易于检出, 应对采集的样品进行富集培养, 通过设置较高的酒精浓度、添加SO2 、调整pH 等手段抑制不需要的微生物的生长, 使希望检出的微生物得到增殖。
酵母检出后, 应对其的发酵性能进行考察, 包括酵母的一系列生理生化特性和风味物质形成的能力等, 这些可通过作生理生化实验和三角瓶小型发酵实验分析和测定。
二、实验仪器与材料样品: 新鲜苹果（未经清洗）榨汁。
YEP.培养基（富集培养基）.蛋白胨20g，葡萄糖20g，酵母膏10g，蒸馏水定容至1000ml. （每次根据需要量按如此比例配置，下同....PDA培养基（酿酒酵母培养基）: 马铃薯200g, 葡萄糖20g, 琼脂20g, 蒸馏水定容至1000ml.（马铃薯去皮, 切成块煮沸后再煮30分钟, 然后用纱布过滤, 再加糖及琼脂溶化后定容至1000 ml。
121℃灭菌30分钟。
）PYG培养基（菌种保藏培养基）：蛋白胨 3.5g, 葡萄糖15g, 酵母膏 1.5g, KH2PO42.0 g, MgSO4·7H2O1.0 g, （NH4）2 SO41.0 g, 琼脂20g, 蒸馏水定容至1000ml.试剂：亚硫酸钠、乙醇, 碘液, 无菌生理盐水等。
菌种的保藏和防止衰退的措施菌种保藏的要点：选择适宜的培养基﹑培养温度和菌龄，以便得到健壮的细胞或孢子；保存于低温﹑隔氧﹑干燥﹑避光的环境中，尽量降低或停止微生物的代谢活动，减慢或停止生长繁殖；不被杂菌污染，在较长时期内保持著生活能力。
方法和原理定期移植法：将菌种接种于所要求的培养基上，在最适温度中培养，至静止期或产生成熟的孢子时，置入5℃的冰箱(或冰库)保存。
在培养和保存的过程中，由于代谢产物的累积而改变了原菌的生活条件，结果菌落群体中的个体就不断衰老和死亡，因此每5～15天或 1～4个月重新移植一次，具体间隔时间因种而异。
凡能人工培养的微生物都可用此法保存。
此法不需特殊设备，但烦琐，费时，而且经常移植容易引起菌种退化。
矿油封藏法：将化学纯的液体石蜡(矿油)经高压蒸气灭菌，放在40℃恒温箱中蒸发其中的水分，然後注入斜面培养物中，使液面高出斜面约 1厘米。
将试管直立，放在15～20℃室温中保存。
由于在斜面培养物上覆盖一层液体，既能隔绝空气，又能防止培养基因水分蒸发而干燥，可以延长菌种保藏的时间。
但注入的液体必须不与培养基混溶﹑对菌种无毒，不易被利用和挥发。
此法适用于酵母菌﹑芽孢杆菌；不适用于固氮菌﹑乳酸杆菌﹑明串珠菌﹑法门氏菌和毛黴目中的大多数属种。
此法简便易行，但必须注意防火和污染。
沙土管法：将沙或土过筛﹑烘干﹑装管﹑灭菌﹑然後将菌种制成孢子悬液滴入其中混匀，放到盛氯化钙的干燥器里吸除水分，干燥後保存或用火焰封管後保存。
吸附在干燥沙土上的孢子因缺水而处于休眠状态，可保存较长时期。
此法适用于芽孢杆菌﹑梭状芽孢杆菌﹑放线菌﹑镰刀菌等。
麸皮法：将麸皮制成培养基，培养要保存的菌种，待生长良好後，置干燥器中保存。
这是根据中国酿造酒﹑醋﹑酱时制麴的经验所采用的一种保藏方法，适用于谷物微生物区系中的种类。
L－干燥法：又称液体干燥法或真空干燥法，用含3%谷氨酸钠的0．1M磷酸缓冲溶液(pH7.0)做分散媒，将待保藏的微生物制成高浓度的细胞悬液，滴入无菌安瓿瓶中，每管0.05毫升；将安瓿瓶固定在多歧管上，并以水浴保持安瓿瓶内样品温度为10℃，在 13.3～1.3帕的真空度下干燥，火焰封管保存。
优良葡萄酵母菌的分离纯化与保藏一、实验器材和试剂1、器材手动榨汁机，培养皿，试管，接种环，酒精灯，棉塞，无菌工作台，生化培养箱，牛皮纸，高压蒸汽灭菌锅，显微镜，纱布，250ml锥形瓶，手持折光仪，漏斗，烧杯，玻璃棒，胶头滴管，广口瓶A14-100ml，100ml量筒，分析天平，读数吸管，软管，发酵瓶，干燥滤器，水浴锅，蒸发皿，烘箱，干燥器，托盘天平。
（用量及规格参看附表）2、试剂琼脂，盐酸，葡萄糖，白砂糖，酒石酸，NaHSO3，50%的葡萄酒蒸馏酒，含糖量为20%的葡萄汁，蒸馏水，双蒸水，发酵葡萄酒用葡萄汁3、实验所用基本培养基及其制备方法（1）含有2%琼脂的新鲜葡萄汁培养基：取250ml锥形瓶，在其中加入含有2%琼脂的新鲜葡萄汁100ml,并调节pH至4-4.5,加棉塞后包上牛皮纸,置于高压蒸汽灭菌锅内用1.1MPa压蒸汽灭菌20min,取出后将其冷却至45℃左右,作为培养基。
（2）PDA-AS即马铃薯葡萄糖琼脂培养基加入50μg/mL 的氨苄青霉素和链霉素，并调节pH至4-4.5。
PDA-AS 培养基是用来培养真菌的（氨苄青霉素和链霉素2种抗生素可以抑制细菌的生长）二、实验原理经查阅资料可知葡萄表面主要含有以下几种菌：李斯特菌的，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，酵母菌，镰刀菌，假单胞菌属，青霉菌。
它们的部分特性差别如条件下培养，可以除去青霉菌与假单胞菌属等好氧菌。
然后，再在有氧条件下培养培养，可以去除镰刀菌等厌氧菌。
接着，在转接到加有抗生素的培养基上培养，可以除去李斯特菌与金黄色葡萄球菌。
最后根据大肠杆菌为短杆菌，而酵母菌很少有杆状形态的区别，借助显微镜观察即可分离出酵母菌而排除大肠杆菌。
三、取材与菌种的富集培养在八九月份，到沙城某葡萄园，在葡萄园分散的取适量熟透的葡萄，然后迅速带回实验室，进行榨汁处理，然后用四层纱布过滤，得到葡萄汁，调节pH至4-4.5，分别取100ml装入三个250ml三角瓶中，在无氧培养箱中进行富集培养，每隔72小时取10ml富集培养液转接到装有100mlpH为4-4.5的新鲜无菌葡萄汁的250ml三角瓶中培养，如此反复三次，除去其中的不耐酸性环境的和好氧型菌。
实验室最常用的五种菌种保藏方法一、冷冻保存在实验室中，冷冻保存是最常用的菌种保藏方法之一。
这种方法利用低温的环境，将菌种置于-70°C以下的冰柜或液氮罐中进行保存，以减缓菌种的新陈代谢过程，从而延长其保存时间。
冷冻保存不仅适用于常见的细菌菌种，对真菌、酵母菌等微生物也同样适用。
在冷冻保存的过程中，需要注意样品容器的密封性和防潮性，以避免保存过程中的交叉污染和冻结损伤。
二、干燥保存干燥保存是另一种常见的菌种保藏方法。
这种方法通过将菌种置于低温低湿环境中，使其水分蒸发，使菌种变得干燥并进入休眠状态，从而延长其保存时间。
常见的干燥保存方式包括真空冷冻干燥、干燥剂吸附法等。
干燥保存尤其适用于灵敏对湿度敏感的菌种，以及一些难以存活在液体培养基中的微生物。
三、低温保存除了冷冻保存外，低温保存也是常见的菌种保藏方式之一。
在这种方法中，菌种通常被保存在4°C左右的冰箱中，通过控制温度和湿度，延缓菌种的新陈代谢，并保持其生长状态。
这种保存方式不仅适用于微生物的短期保存，也可以用于长期保存对保存温度敏感的微生物。
四、液氮保存液氮保存是一种极低温的保存方式，通过将微生物样品浸没在液氮中进行保存。
这种方法不仅可以有效地防止菌种的新陈代谢和变异，还能够保持菌种的生物特性和遗传信息。
液氮保存适用于需要长期保存的珍贵菌株和难培养的微生物，如土壤中的特殊嗜冷菌和特殊嗜热菌等。
五、冻干保存冻干保存是将微生物样品在冷冻的条件下先冻结，然后通过真空干燥的方式将水分蒸发，最终将样品转变成固态的干燥状态。
这种方法既能保留微生物的生物特性，又能有效地延长样品的保存时间，适用于需要长时间运输和保存的微生物。
总结回顾通过冷冻保存、干燥保存、低温保存、液氮保存和冻干保存等五种菌种保藏方法，可以满足实验室对于微生物样品保存的不同需求。
不同的菌种和实验目的，需要选择合适的保存方式，以确保微生物的品质和可用性。
在进行菌种保存的过程中，需要注意样品的密封性、温度和湿度的控制，以及保存设备的维护和管理。
果酒发酵注意事项果酒发酵注意事项一、发酵准备1、准备足够的原料，糖度及甜度要求符合产品的质量要求。
2、准备干净的植物油，用于润滑桶口、桶底和桶口。
3、准备干净的木锤、拐杖、桶钻等用具，用于压榨果汁或搅拌果汁。
4、准备足够的容器，用于存放果汁和酵母。
二、发酵环境1、发酵环境要求温度控制在16~27℃正常发酵，温度过高发酵会减慢或中断，温度过低也不利于发酵，一般24℃是最佳发酵温度。
2、发酵环境要求保持相对湿度在75-85%，避免果酒受潮变质。
3、发酵环境要保持光线充足，避免果酒变质，发酵环境不宜过于潮湿、空气太干、有异味。
三、发酵条件1、果酒的发酵要考虑到水份、糖度、果汁成分、PH值等条件，所以在发酵之前，必须进行调配，以确保质量稳定性。
2、发酵前先加入相应的防腐剂，以防止果汁受污染，并加入必要的矿物质元素，以促进酵母的发酵。
3、发酵时应控制酵母的温度，温度越低发酵速度越快，但果酒产品质量也会受到影响，温度越高发酵速度越慢，但可以保证果酒产品的质量。
四、发酵中注意事项1、发酵中一定要保证果汁温度不要过高，避免热发酵和酵母受损。
2、果汁发酵过程中要经常搅拌果汁，以提高果汁的发酵率。
3、发酵过程中应及时检查水分、pH值、酸度和发酵程度等，以确保果酒的质量稳定。
4、发酵过程中不要给果汁加入来自外界的其它物质，以免影响果汁的发酵及果酒产品的质量。
五、发酵后注意事项1、发酵完成后应尽快冷却，防止果汁发生酸变。
2、发酵完成后应及时洗涤器具，以预防果汁受污染。
3、发酵完成后需要清洗果汁里所有残留的杂质，以免影响瓶装酒的质量。
4、发酵完成后应及时加入防腐剂，以防止果汁受污染，并用瓶子盖好以防止空气中游离微生物污染果汁。
发酵食品生产技术单选题100道及答案解析1. 发酵食品中常用的微生物不包括（）A. 酵母菌B. 乳酸菌C. 霉菌D. 大肠杆菌答案：D解析：大肠杆菌一般不是发酵食品生产中常用的微生物，而酵母菌、乳酸菌和霉菌在发酵食品中应用广泛。
2. 下列属于发酵食品的是（）A. 炒青菜B. 煮鸡蛋C. 酸奶D. 炸薯条答案：C解析：酸奶是通过乳酸菌发酵制成的，属于发酵食品。
炒青菜、煮鸡蛋、炸薯条都没有经过发酵过程。
3. 发酵过程中控制温度的主要目的是（）A. 加快反应速度B. 抑制杂菌生长C. 保证微生物活性D. 以上都是答案：D解析：控制温度在发酵过程中既能加快反应速度，又能抑制杂菌生长，还能保证微生物的活性。
4. 制作泡菜利用的微生物主要是（）A. 醋酸菌B. 酵母菌C. 乳酸菌D. 霉菌答案：C解析：制作泡菜主要利用乳酸菌的发酵作用。
5. 发酵食品生产中，调整pH 值的作用是（）A. 促进微生物生长B. 抑制微生物生长C. 影响代谢产物生成D. 以上都是答案：D解析：调整pH 值可以促进或抑制微生物生长，同时也会影响代谢产物的生成。
6. 啤酒发酵中使用的主要微生物是（）A. 乳酸菌B. 醋酸菌C. 酵母菌D. 霉菌答案：C解析：啤酒发酵主要依靠酵母菌。
7. 发酵食品生产中，接种量的大小会影响（）A. 发酵速度B. 产品质量C. 微生物生长D. 以上都是答案：D解析：接种量的大小会对发酵速度、产品质量以及微生物生长都产生影响。
8. 酱油发酵过程中，主要的发酵阶段是（）A. 前期B. 中期C. 后期D. 整个过程答案：B解析：酱油发酵过程中，中期是主要的发酵阶段。
9. 发酵食品生产中，通风的目的是（）A. 提供氧气B. 排除二氧化碳C. 控制温度D. 以上都是答案：D解析：通风可以提供氧气，排除二氧化碳，同时也有助于控制温度。
10. 面包发酵使用的酵母属于（）A. 酿酒酵母B. 假丝酵母C. 毕赤酵母D. 以上都不是答案：A解析：面包发酵通常使用酿酒酵母。
在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。
低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏方法虽多，但都是根据这三个因素而设计的。
传代培养保藏法又称斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等（后者作保藏厌氧细菌用），培养后于4-6 ℃冰箱内保存。
材料试剂干酵母、新鲜苹果、亚硫酸钠、乙醇、无菌水、SO2、PDA斜面实验器材试剂瓶(1000 mL)、无菌吸管(1 mL及5 mL)、无菌滴管、榨汁机、方法步骤1、菌种保藏：将实验三纯种分离的菌种，用接种环挑取一环接种于PDA斜面上，将有标记的试管用报纸将塞有棉塞的管部分包好（斜面试管用带帽的螺旋试管为宜。
这样培养基不易干，且螺旋冒不易长霉菌，如用棉塞，塞子要求比较干燥）28℃恒温培养，苹果分离的酵母菌、葡萄分离的酵母菌菌种各接三个斜面。
待菌种长好后，4℃冰箱中保存。
2、果浆制作：选取新鲜完整的无腐烂的苹果6-7个，切成碎块，将果梗分离，防止果梗中的青草味和苦涩物质溶出，用榨汁机完全捣碎。
3、酵母活化：取干酵母1g，加蒸馏水50ml，葡萄糖2.5g充分溶解，放置28℃水浴4小时。
4、二氧化硫处理：二氧化硫在果酒中的作用有杀菌、澄清、抗糖的调整：酿造酒精含量为10%-12%的酒，果汁的糖度需17-20°Bx。
如果糖度达不到要求则需加糖，实际加工中常用蔗糖或浓缩汁。
酸的调整：酸可抑制细菌繁殖，使发酵顺利进行；使酒颜色鲜明；使酒味清爽，并具有柔软感；与醇生成酯，增加酒的芳香；增加酒的贮藏性和稳定性。
干酒易在0.6%-0.8%，甜酒0.8%-1%一般pH大于3.6或可滴定酸低于0.65%时应该对果汁加酸。
7、发酵：将活化的酵母加入到果汁中，摇匀，用纱布封住瓶口，室温发酵。
温度控制在20-28 ℃，发酵时间随酵母的活性和发酵温度而变化，一般约为3-12天。
8、糖度监测：隔一天或两天对发酵液进行糖度测定，方法按5所述操作。
9、蒸酒精度：数据处理果酒设计在室温下发酵苹果汁0.8L砂糖150g亚硫酸6%0.8ml类型甜酒酵母1g酒精度12°苹果酒发酵糖度记录012581218发酵时间/天消耗葡萄17.016.117.318.620.521.7223.97糖标准液体积/ml在2013.12.5进行测酒精度，蒸发原液，的蒸发酒100ml，在20℃，测得酒精度为10.5°，比设计偏小。
果酒酵母发酵及菌种保藏选取1-2 种酿酒酵母进行小型酿酒实验，在品尝合格并符合规定的感官及理化指标后，选用常用菌种保藏方法对有价值的菌种进行保藏。
1.实验目的和内容1）掌握果酒酿造的原理并对筛选果酒酵母菌种进行发酵性能测定（起酵时间、产酒精度、耐受性能）。
2）用选育果酒酵母进行小型酿酒实验，掌握果酒酿造一般工艺流程。
3）了解并掌握菌种保藏的常用方法及其优缺点。
4）学习几种常用菌种保藏方法：斜面传代保藏方法、液体石蜡保藏方法、沙土管保藏方法、冷冻干燥保藏方法。
2.实验原理果酒发酵：果浆或果汁中的葡萄糖和果糖在酵母菌的作用下，最后生成酒精和二氧化碳。
可用以下反应式来说明：果酒发酵是一个极其复杂的生物化学现象。
在每一步反应过程中都有酶的参与，除了最后生成酒精、二氧化碳和少量的甘油、高级醇类、醛类物质之外，还会生成二磷酸己糖、磷酸甘油醛、丙酮酸、乙醛等许多中间产物。
果酒的发酵分主发酵和后发酵两个阶段，主发酵是将发酵液的糖分变成酒精，后发酵是继续分解残糖为酒精，加速酒的转化，使酒更加稳定。
用人工培养的酵母发酵的称为人工发酵，利用天然酵母发酵的称为自然发酵。
按照工艺的不同又可分为渣汁混合发酵和渣汁分离发酵两种形式。
微生物具有容易变异的特性，因此经过分离纯化选育的酿酒酵母要经历长期的保存必须要用实验方法对其保藏，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。
低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏方法虽多，但都是根据这三个因素而设计的。
保藏方法大致可分为以下几种：1）传代培养保藏法又称斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等（后者作保藏厌氧细菌用），培养后于4-6C冰箱内保存。
2）液体石蜡覆盖保藏法是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。
3）载体保藏法是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。
4）寄主保藏法用于目前尚不能在人工培养基上生长的微生物，如病毒、立克次氏体、螺旋体等，它们必须在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代，此法相当于一般微生物的传代培养保藏法。
病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法与冷冻干燥保藏法进行保藏。
5）冷冻保藏法可分低温冰箱（-20至-30C , -50至-80C）、干冰酒精快速冻结（约- 70C ）和液氮（-196C ）等保藏法。
6）x x 保藏法先使微生物在极低温度（-70 C左右）下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分（真空干燥）。
有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备细胞悬液，以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。
保护性溶质可通过氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。
保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲亚砜等。
3.实验材料和用具样品：xx水果及压榨汁。
试剂：亚硫酸钠、乙醇、无菌水、化学纯液体石蜡、五氧化二磷、脱脂奶粉、10%HC、l 干冰、95%乙醇、食盐、无水氯化钙、河沙、瘦黄土（有机物含量少的黄土）或者红土；器皿：三角烧瓶（250 mL）无菌试管、无菌吸管（1 mL及5 mL）、无菌滴管、接种环、40目及100目筛子、干燥器、安瓿管、冰箱、冷冻真空干燥装置、酒精喷灯、滤纸条（0.5 X1.2 cm）冰箱，低温冰箱（-30C），液氮冷冻保藏器，玻璃涂棒，血细胞计数板，显微镜，紫外线等（15W），磁力搅拌器，台式离心机，震荡混合器4.操作步骤4.1 自选酵母发酵性性能的检测试验：用选育菌种发酵果酒4. 1 . 1果酒酿造的工艺流程鲜果T分选T破碎、除梗T果浆T分离取汁T澄清T清汁T发酵T倒桶T贮酒T过滤T冷处理T调配T过滤T成品4.1.2 工艺简述1）发酵前的处理前处理包括水果的选别、破碎、压榨、果汁的澄清，果汁的改良等。
①破碎、除梗：破碎要求每粒种子破裂，但不能将种子和果梗破碎，否则种子内的油酯、糖苷类物质及果梗内的一些物质会增加酒的苦味。
破碎后的果浆立即将果浆与果梗分离，防止果梗中的青草味和苦涩物质溶出。
破碎机有双辊压破机、鼓形刮板式破碎机、离心式破碎机、锤片式破碎机等。
②二氧化硫处理：二氧化硫在果酒中的作用有杀菌、澄清、抗氧化、增酸、使色素和单宁物质溶出、还原作用、使酒的风味变好等。
使用二氧化硫有气体二氧化硫及亚硫酸盐，前者可用管道直接通入，后者则需溶于水后加入。
发酵基质中二氧化硫浓度为60-100mg/L。
此外，尚需考虑下述因素：原料含糖高时，二氧化硫结合机会增加，用量略增；原料含酸量高时，活性二氧化硫含量高，用量略减；温度高，易被结合且易挥发，用量略减；微生物含量和活性越高、越杂，用量越高；霉变严重，用量增加。
2）果汁的调整①糖的调整：酿造酒精含量为10%-12%勺酒，果汁的糖度需17-20 °x。
如果糖度达不到要求则需加糖，实际加工中常用蔗糖或浓缩汁。
②酸的调整：酸可抑制细菌繁殖，使发酵顺利进行；使红葡萄酒颜色鲜明；使酒味清爽，并具有柔软感；与醇生成酯，增加酒的芳香；增加酒的贮藏性和稳定性。
干酒易在0.6%-0.8%，甜酒0.8%-1%一般pH 大于3.6 或可滴定酸低于0.65%时应该对果汁加酸。
3）酒精发酵发酵分主（前）发酵和后发酵，主发酵时，将果汁到入容器内，装入量为容器容积的，然后加入3%-5%的勺酵母，搅拌均匀，温度控制在20-28C，发酵时间随酵母的活性和发酵温度而变化，一般约为3-12天。
残糖降为0.4%以下时主发酵结束。
然后应进行后发酵，即将酒容器密闭并移至酒窑，在12-28 C下放置1个月左右。
发酵结束后要进行澄清，澄清的方法和果汁相同。
4）成品调配果酒的调配主要有勾兑和调整。
勾兑即原酒的选择与适当比例的混合；调整即根据产品质量标准对勾兑酒的某些成分进行调整。
勾兑，一般先选一种质量接近标准的原酒作基础原酒，据其缺点选一种或几种另外的酒作勾兑酒，加入一定的比例后进行感官和化学分析，从而确定比例。
调整，主要有酒精含量、糖、酸等指标。
酒精含量的调整最好用同品种酒精含量高的酒进行调配，也可加蒸馏酒或酒精；甜酒若含糖不足，用同品种的浓缩汁效果最好，也可用砂糖，视产品的质量而定；酸分不足可用柠檬酸。
5）过滤、杀菌、装瓶过滤有硅藻土过滤、薄板过滤、微孔薄膜过滤等。
果酒常用玻璃瓶包装。
装瓶时，空瓶用2-4%的碱液在50C以上温度浸泡后，清洗干净，沥干水后杀菌。
果酒可先经巴氏杀菌再进行热装瓶或冷装瓶，含酒精低的果酒，装瓶后还应进行杀菌。
4.1.3 发酵性能测定测定一个发酵周期内酒精度及含糖量变化，绘制发酵曲线，并对自制果酒进行感官评定，分析测定理化指标（糖度、酒度、酸度）。
还原糖、总糖的测定：直接滴定法。
总酸的测定：中和滴定法。
酒度的测定：蒸馏法。
5.菌种保藏（下列各法可根据实验室具体条件与需要选做）见实验十二。
6.实验结果分析1）绘制发酵周期糖度及酒精度变化曲线。
2）对酒样作感官品评，并作理化分析，测定葡萄酒的酒精、残糖、总酸。
7.问题和讨论1）菌种保藏中，石蜡油的作用是什么？2）经常使用的细菌菌株，使用那种保藏方法比较好？3）简述果酒发酵主要影响因素。
附：总糖和还原糖的测定（一） -- 试剂比色法1.实验目的掌握还原糖和总糖的测定原理，学习用直接滴定法测定还原糖的方法。
2.实验原理斐林氏溶液与还原糖共沸，其中斐林氏溶液中的Cu2+被还原糖还原为Cu20 （砖红色）时，反应达到终点，过量的还原糖使次甲基蓝指示剂蓝色褪去，显露出Cu2O的红色即为终点。
3.实验材料和用具1）试剂xx 甲液：称取68.29g硫酸铜（CuS04?5H2O，溶于蒸馏水中并稀释到1000ml。
xx 乙液：称取346g酒石酸钾钠及100g NaOH溶于蒸馏水中，完全溶解后，用蒸馏水稀释到1000ml，贮存于具橡皮塞玻璃瓶中。
0.25％葡萄糖标准溶液：准确称取2.500g经98-105C干燥至恒重的无水葡萄糖，加蒸馏水溶解后移入1000ml 容量瓶中，加入5ml浓HCI （防止微生物生长），用蒸馏水稀释到1000ml。
2）器具电热恒温水浴锅，调温电炉，250ml 锥形瓶，滴定管4.操作步骤1）标定预备试验：吸取费林溶液A、B各5.00 mL于250 mL三角瓶中，加50 mL水，摇匀，在电炉上加热至沸，在沸腾状态下用制备好的葡萄糖标准溶液滴定，当溶液的蓝色将消失呈红色时，加2 滴次甲基蓝指示液，继续滴至蓝色消失，记录消耗的葡萄糖标准溶液的体积。
2）标定正式试验：戏取费林溶液A、B各5.00 mL于250 mL三角瓶中，加50 mL水和比预备试验少1 mL的葡萄糖标准溶液，加热至沸，并保持2 min，加2滴次甲基蓝指示液，在沸腾状态下于1min 内用葡萄糖标准溶液滴至终点，记录消耗的葡萄糖标准溶液的总体积。
计算式中：F――费林溶液A、B各5 mL相当于葡萄糖的克数，g;m --- 称取葡萄糖的质量，g；V――消耗葡萄糖标准溶液的总体积，mL。
3）葡萄酒样品还原糖测定：准确吸取一定量的样品（V1 ）于100 mL容量瓶中，使之所含还原糖量为0.2〜0.4g,加水定容至刻度。
吸取费林溶液A、B各5.00 mL于250 mL三角瓶中，加50 mL水和一定量的试样（试样所含还原糖量为0.2-0.4g）,加热至沸，并保持2 min,加2滴次甲基蓝指示液，在沸腾状态下于1min 内用葡萄糖标准溶液滴至终点，记录消耗的葡萄糖标准溶液的总体积。
按式（4）计算。
4）葡萄酒样品总糖测定：准确吸取一定量的样品（V1）于100mL容量瓶中，使之所含总糖量为0.2〜0.4 g,力口5 mL盐酸溶液，加水至20 mL,摇匀。
于68±!C水浴上水解15min，取出，冷却。
用200 g/L氢氧化钠溶液中和至中性，（加入2滴酚酞，用NaOH 溶液滴定至微红色）。
调温至20C，加水定容至刻度（V2）。
吸取费林溶液A、B各5.00 mL于250 mL三角瓶中，加50 mL水和一定量的试样（试样所含总糖量为0.2-0.4g）,加热至沸，并保持2min，加2滴次甲基蓝指示液，在沸腾状态下于1 min 内用葡萄糖标准溶液滴至终点，记录消耗的葡萄糖标准溶液的总体积。
按下式计算。
式中：X 总糖或还原糖的含量，g/ L;F 费林溶液I、H各5 mL相当于葡萄糖的克数，g;V1 吸取的样品体积，mL;V2 --- 样品稀释后或水解定容的体积，mL;V3 --- 消耗试样的体积，mL;G――葡萄糖标准溶液的准确浓度，g/mL;V――消耗葡萄糖标准溶液的体积，mL。
