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第27卷第6期2007年6月生态学报ACTA ECOLOG I C A SI N I C A V o.l 27,N o .6Jun .,2007基金项目:国家自然科学基金海外青年学者合作研究基金资助项目(30528013);国家自然科学基金资助项目(30670325);新世纪优秀人才支持计划资助项目(NCET -05-0328)收稿日期:2006-05-21;修订日期:2007-01-19作者简介:陈亚州(1982~),男,海南琼海人,硕士生,主要从事植物次生代谢研究.E-m ai:l c h i nxunfong @126.co m*通讯作者Correspond i ng au t hor .E -m a i :l xf yan @m ai.l h.l cnFoundati on ite m:Th e proj ect was fi nanci ally s upported by Nati onalNatural Science Foundati on ofC h i na (N o .30528013,30670325)and Progra m f or N e w Cen t u ry Excellent Talents i n Un ivers i ty (No .NCET-05-0328)Recei ved date :2006-05-21;Accepted date :2007-01-19Biography :CHEN Y a -Zhou ,M aster candidat e ,m ai n l y engaged i n p l an t s econdary m et abolis m.E-m ai:l ch i nxun fong @芥子油苷在植物-生物环境关系中的作用陈亚州,阎秀峰*(东北林业大学生命科学学院,哈尔滨 150040)摘要:芥子油苷是一类含氮、含硫的植物次生代谢物质,主要分布于白花菜目的十字花科植物。
松花菜浙017花球成熟过程中的营养品质分析顾宏辉;王建升;赵振卿;艾荒原;黄文斌;盛小光;虞慧芳【摘要】以松花菜新品种浙017为试验材料，分析了花球不同生长发育时期的花球形态变化，花球中叶绿素、类胡萝卜素、可溶性总糖、维生素C、总多酚、芥子油苷等含量和抗氧化能力的变化。
研究结果表明，松花菜花球从小到大，花球即从相对紧实转为松散，花球高度在生长到峰值后开始逐渐下降，而球径及球质量还能继续增长。
花梗颜色从淡色逐渐转变为绿色，花球叶绿素及类胡萝卜素含量显著增长1~2倍。
维生素C、可溶性总糖、总多酚以及抗氧化能力等在生长发育过程中存在着差异，但总体变化不明显。
花球中共检测到12种芥子油苷，包括8种脂肪族芥子油苷和4种吲哚族芥子油苷。
其中主要的脂肪族芥子油苷为3-甲基亚磺酰丙基芥子油苷，主要的吲哚族芥子油苷为吲哚-3-甲基芥子油苷。
% In this paper, we investigated the morphological changes, contents of chlorophyll, carotenoids, soluble sugars, vitamin C, total phenols, glucosinolate and antioxidant capacity during different growth and development periods in loose-curd cauliflower cultivar Zhe 017 (Brassica oleracea var. botrytis L.). The results showed that, as the curd grew, it became looser gradually, and its height descended gradually after it got the peak value, but the diameter and weight of the curd were continuously increased. The contents of chlorophyll, carotenoids significantly increased by 1-2 times, and the color of the curd peduncle changed from light green into dark green. The contents of nutrients exhibited differently during the growth and development periods of the curd, but there was no significant difference in contents of vitamin C, soluble sugars, total phenols and antioxidantcapacity. A total of 12 kinds of glucosinolates were detected, including 8 kinds of aliphatic glucosinolates and 4 kinds of indole glucosinolates, and glucoiberin and glucobrassicin were the main aliphatic and indole glucosinolatea.【期刊名称】《长江蔬菜》【年(卷),期】2012(000)022【总页数】4页(P48-50,51)【关键词】松花菜;浙017;营养品质;花球【作者】顾宏辉;王建升;赵振卿;艾荒原;黄文斌;盛小光;虞慧芳【作者单位】浙江省农业科学院蔬菜研究所,杭州,310021;浙江省农业科学院蔬菜研究所,杭州,310021;浙江省农业科学院蔬菜研究所,杭州,310021;浙江万好食品有限公司;温州神鹿种业有限公司;浙江省农业科学院蔬菜研究所,杭州,310021;浙江省农业科学院蔬菜研究所,杭州,310021【正文语种】中文花球松散型花椰菜（简称松花菜，下同）是花椰菜的一种特殊类型，具有花球松大、花梗青、口味佳等特点[1]。
化学调控对十字花科植物中芥子油苷代谢的影响及其机理芥子油苷及其代谢产物具有抗癌功效,是蔬菜中一类重要的功能成分,其中萝卜硫苷的代谢产物萝卜硫素是目前已知的抗癌活性最强的天然植物化学物质青花菜芽菜是青花菜种子发芽后7-9d的嫩芽,因富含萝卜硫苷和萝卜硫素而成为芥子油苷代谢研究的模式体系。
芥子油苷的生物合成途径在模式植物拟南芥中已经基本阐明。
芥子油苷的合成与积累不仅与其所处的发育阶段有关,而且受到其内部信号分子和外界环境包括生物因素和非生物因素的调控。
本文致力于探索改善青花菜芽菜中芥子油苷等品质成分的安全有效的化学调控手段。
通过分析各种化学调控方式如激素,糖和氯化钠等对青花菜芽菜中芥子油苷等功能成分和品质的影响,找出促进青花菜芽菜中功能成分芥子油苷积累的化学调控手段,并探索这些化学调控方式促进芥子油苷积累的分子机制。
在此基础上,以模式植物拟南芥的各种激素,糖和芥子油苷相关的突变体以及转基因植物为材料,探究不同的化学手段调控芥子油苷代谢的分子机理,以完善芥子油苷的代谢调控网络,并为更好地应用化学调控方式改善蔬菜保健品质提供理论依据和技术支撑。
得到如下结果：1、蔗糖可以有效促进青花菜芽菜中芥子油苷和花青素的积累,但对这两种物质的诱导机制存在差异。
研究了不同种类的糖(蔗糖,葡萄糖,山梨醇和果糖)对青花菜芽菜中主要功能成分芥子油苷和花青素的影响,结果表明,蔗糖,葡萄糖.山梨醇和果糖处理都可以促进青花菜芽菜中芥子油苷和花青素的积累,其中,蔗糖在促进芥子油苷和花青素积累方面最为有效,但是蔗糖对二者的调控机制不尽相同,蔗糖促进花青素积累的作用并不能够被1：1葡萄糖果糖复合物所模拟,故蔗糖可能是以蔗糖分子的形式调控花青素的合成和积累。
通过分析蔗糖处理青花菜芽菜后花青素合成相关基因的表达发现,蔗糖可以在分子水平上调控其转录因子(BoMYB2, BoMYB3和BoTT8)和合成基因(CHS, CHI, F3H, F3’H, DFR, LDOX和GST)进而调控花青素的合成。
青花菜MYB28、MYB29基因克隆与功能分析脂肪族芥子油昔(aliphatic glucosinolates, AGSL)是一种广泛存在于十字花科植物中的含氮、含硫的植物次生代谢产物,其降解产物(如萝卜硫素)不仅在植物防御、响应生物或非生物胁迫的生理过程中具有重要的作用,而且还具有极强的抗癌活性。
MYB28和MYB29是调控脂肪族GSL生物合成的两类重要转录因子。
在拟南芥中MYB28和MYB29直接调控脂肪族芥子油苷的合成。
在十字花科蔬菜中,青花菜中的芥子油苷含量最为丰富,成分更为复杂,目前国内外对青花菜AGSL生物合成途径中的结构基因研究的较多,而对其中起调控作用的转录因子的研究则相对较为滞后。
本研究以高萝卜硫素青花菜“福青1号”为材料,克隆了MYB28和MYB29两种转录因子,并对其表达模式以及功能进行初步了分析,主要研究结果如下：(1)通过同源克隆的方法,克隆出青花菜脂肪族芥子油苷合成调控转录因子MYB28的2个同源基因(BoMYB28-1, BoMYB28-2)和MYB29的2个同源基因(BoMYB29-1和BoMYB29-2)。
生物信息学分析发现,这四个转录因子核苷酸序列与其他物种同类基因的同源性较高,均含有明显的MYB家族R2R3型转录因子结构,初步确定它们为青花菜BoMYB28和BoMYB29基因。
上述四个转录因子提交至GenBank数据库,登录号分别为：KM262765.1、KM262766.1、 KM262767.1和KM262768.1。
(2)分别构建了BoMYB28-1,BoMYB28-2 、 BoMYB29-1和BoMYB29-2基因的亚细胞定位载体,并进行瞬时表达,结果显示在洋葱表皮细胞核中均出现明显的绿色荧光,表明BoMYB28-1,BoMYB28-2 、 BoMYB29-1和BoMYB29-2基因定位于细胞核中的转录因子基因。
(3)荧光定量PCR分析结果表明,四个同源基因在青花菜不同组织中基因的表达量存在显著差异。
高效液相色谱对芥子油苷的提取和分离I 准备阶段：1. 水浴锅设置80℃2.配制两瓶70%的甲醇，其中一瓶置于水浴锅中温浴。
3.5mM苄基芥子油苷.2.33mg/ml4.0.5M醋酸盐（PH=5）[30mlHAC，960ml H2O，加10-20g NaOH 粉末，调至PH=5]5.20mM的醋酸盐，PH=5：将4中的稀释25倍6.DEAE sephadex A-25：称取3g 树脂，加90ml 0.5M 醋酸盐（PH=5）室温过夜溶解。
7.硫酸酯酶：15mg溶解于6ml 20mM 醋酸钠中，PH=5（16100uM/hour/g）II 芥子油提取1. 取新鲜莲座叶，鲜重5-10mg2. 放入1.5mlEP管中，迅速放入液氮。
3. 研磨成粉末后并加入1ml 预热的70%的甲醇。
4. 加入50ul 5mM 的苄基芥子油苷5. 盖好盖子漩涡震荡置于冰上，剩下的样品重复步骤3-4。
6. 所有的样品置于80℃10min。
7. 4000rpm，10min。
8. 将上清液转移至1.5 的离心管。
9. 用预热的甲醇重新提取两次，收集所有的上清液至4ml，-20℃保存。
III 芥子油苷的脱硫纯化1. 搅拌DEAE sephadex A-25 树脂成溶液，用1ml的移液器取1ml 加入BioRad 管中，让其沉淀。
2. 用5ml 的灭菌水清洗（禁止干燥）。
3. 加入所有的芥子油苷提取液。
4. 用2ml的70%的甲醇清洗两次，2ml 的灭菌水清洗5次，2ml 20mM 醋酸盐PH=5清洗一次。
5. 加入0.5ml 硫酸酯酶，直至上侧的橡胶管中剩余1-2mm的液相。
IV 脱硫芥子油苷的洗脱1. 用1ml 灭菌水洗脱3次。
2. 浓缩至EP 管中剩余0.5ml 液体V HPLC分离脱硫芥子油苷1. 取60ul 洗脱液于HPLC管中，吸入30ul2. 检测：PDA 190nm-370nm （或者DV229nm和260nm）3. 流速：1ml/min4. 运行梯度：灭菌水（A）和甲醇（B），60minA100%,B0% 2minA to 60%B线性48min，60%B to 100% B 线性3minA 0%，B100% 3minB to 100% A 线性4minVI 芥子油苷的HPLC-MS5. 取60ul 洗脱液加入HPLC管中，吸入6ul6. 检测：质谱，[M+Na+]7. 流速：0.25ml/min8. 运行梯度：混有50uM的醋酸钠灭菌水（A）与甲醇（B），60minA100%,B0% 2minA to 60%B线性40min，60%B to 100% B 线性5minA 0%，B100% 5minB to 100% A 线性8min液相色谱质谱联用分离、鉴定芥蓝中脱硫芥子油苷腊贵晓,方萍,李亚娟,王月1.芥子油苷的提取和纯化称取0. 20 g冻干样品,加入3 mL 70%甲醇(甲醇∶水= 70∶ 30),在70℃的水浴锅中提取10 min,然后4000 r min- 1离心10 min.沉淀再按照上述方法提取2次,合并上述提取液.同时做2个平行.取2 mL提取液流经DEAESephadex A-25萃取柱,待提取液全部流出小柱后,加入200 L硫酸酯酶(0. 1%)溶液.室温反应16 h后用4× 0. 5 mL 超纯水洗脱.洗脱液过0. 45μm微膜,4℃下保存,待HPLC分析.利用2-丙烯基芥子油苷(sinigrin)作为外标进行定量.2.芥子油苷的测定与鉴定测定芥子油苷的主要方法包括气相色谱法测定其降解产物异硫代氰酸盐化合物;高效液相色谱法测定脱硫芥子油苷和完形芥子油苷.对芥子油苷的鉴定一般采用质谱法,包括化学电离、快速原子轰击电离及热喷雾电离等方法.1.超高效液相色谱法测定拟南芥芥子油苷[J]东北农业大学学报，石璐，李梦莎，国静等摘要：将已有的拟南芥芥子油苷高效液相色谱（HPLC）检测方法转换为超高效液相色谱（UPLC）方法，通过条件优化改进，建立拟南芥芥子油苷UPLC检测方法。
不同品种西兰花种子中莱菔硫烷的HPLC分析【摘要】目的建立西兰花种子中莱菔硫烷的HPLC含量测定方法。
方法色谱柱：Waters公司XBridgeTM C18 (150 mm×4.6 mm，5μm)；流动相：甲醇��水(体积比30∶70)；流速：1.0 mL/min；PDA检测器；检测波长：240 nm；柱温:30 ℃。
结果莱菔硫烷在14.6～292.5 μg/mL范围内线性关系良好，r=0.9994，平均回收率为97.32%（RSD=1.2%）。
结论本法简便、准确，重复性好，可用作西兰花种子的质量控制，为不同产地不同品种的西兰花种子的收购及栽培等提供有效监控依据。
【关键词】西兰花种子；莱菔硫烷；HPLC；含量测定Abstract:Objective To establish a method for content analysis of sulforaphane in broccoli seeds.Methods Samples were analyzed on a Waters XbridgeTM C18 (150 mm×4.6 mm，5 μm) column by using m ethanol��water (30∶70) as the mobile phase.The flow rate was 1.0 ml/ min.The detection wavelength was 240 nm.The column temperature was 30℃. Results The calibration curve was linear over the concentration of 14.6～292.5μg/ml for sulforaphane (r=0.9994).The average recovery of sulforaphane was 97.32% and RSD 1.2%.Conclusion The method is simple，accurate，reproducible and can be used for the quality control of broccoli seeds.Keywords:broccoli seeds；sulforaphane； HPLC西兰花又名绿花菜、青花菜等，为十字花科芸苔属甘蓝种中以绿色花球为产品的一个变种，一、二年生草本植物。
高效液相色谱对芥子油苷的提取和分离I 准备阶段：1. 水浴锅设置80℃2.配制两瓶70%的甲醇，其中一瓶置于水浴锅中温浴。
3.5mM苄基芥子油苷.2.33mg/ml4.0.5M醋酸盐（PH=5）[30mlHAC，960ml H2O，加10-20g NaOH 粉末，调至PH=5]5.20mM的醋酸盐，PH=5：将4中的稀释25倍6.DEAE sephadex A-25：称取3g 树脂，加90ml 0.5M 醋酸盐（PH=5）室温过夜溶解。
7.硫酸酯酶：15mg溶解于6ml 20mM 醋酸钠中，PH=5（16100uM/hour/g）II 芥子油提取1. 取新鲜莲座叶，鲜重5-10mg2. 放入1.5mlEP管中，迅速放入液氮。
3. 研磨成粉末后并加入1ml 预热的70%的甲醇。
4. 加入50ul 5mM 的苄基芥子油苷5. 盖好盖子漩涡震荡置于冰上，剩下的样品重复步骤3-4。
6. 所有的样品置于80℃10min。
7. 4000rpm，10min。
8. 将上清液转移至1.5 的离心管。
9. 用预热的甲醇重新提取两次，收集所有的上清液至4ml，-20℃保存。
III 芥子油苷的脱硫纯化1. 搅拌DEAE sephadex A-25 树脂成溶液，用1ml的移液器取1ml 加入BioRad 管中，让其沉淀。
2. 用5ml 的灭菌水清洗（禁止干燥）。
3. 加入所有的芥子油苷提取液。
4. 用2ml的70%的甲醇清洗两次，2ml 的灭菌水清洗5次，2ml 20mM 醋酸盐PH=5清洗一次。
5. 加入0.5ml 硫酸酯酶，直至上侧的橡胶管中剩余1-2mm的液相。
IV 脱硫芥子油苷的洗脱1. 用1ml 灭菌水洗脱3次。
2. 浓缩至EP 管中剩余0.5ml 液体V HPLC分离脱硫芥子油苷1. 取60ul 洗脱液于HPLC管中，吸入30ul2. 检测：PDA 190nm-370nm （或者DV229nm和260nm）3. 流速：1ml/min4. 运行梯度：灭菌水（A）和甲醇（B），60minA100%,B0% 2minA to 60%B线性48min，60%B to 100% B 线性3minA 0%，B100% 3minB to 100% A 线性4minVI 芥子油苷的HPLC-MS5. 取60ul 洗脱液加入HPLC管中，吸入6ul6. 检测：质谱，[M+Na+]7. 流速：0.25ml/min8. 运行梯度：混有50uM的醋酸钠灭菌水（A）与甲醇（B），60minA100%,B0% 2minA to 60%B线性40min，60%B to 100% B 线性5minA 0%，B100% 5minB to 100% A 线性8min液相色谱质谱联用分离、鉴定芥蓝中脱硫芥子油苷腊贵晓,方萍,李亚娟,王月1.芥子油苷的提取和纯化称取0. 20 g冻干样品,加入3 mL 70%甲醇(甲醇∶水= 70∶ 30),在70℃的水浴锅中提取10 min,然后4000 r min- 1离心10 min.沉淀再按照上述方法提取2次,合并上述提取液.同时做2个平行.取2 mL提取液流经DEAESephadex A-25萃取柱,待提取液全部流出小柱后,加入200 L硫酸酯酶(0. 1%)溶液.室温反应16 h后用4× 0. 5 mL 超纯水洗脱.洗脱液过0. 45μm微膜,4℃下保存,待HPLC分析.利用2-丙烯基芥子油苷(sinigrin)作为外标进行定量.2.芥子油苷的测定与鉴定测定芥子油苷的主要方法包括气相色谱法测定其降解产物异硫代氰酸盐化合物;高效液相色谱法测定脱硫芥子油苷和完形芥子油苷.对芥子油苷的鉴定一般采用质谱法,包括化学电离、快速原子轰击电离及热喷雾电离等方法.1.超高效液相色谱法测定拟南芥芥子油苷[J]东北农业大学学报，石璐，李梦莎，国静等摘要：将已有的拟南芥芥子油苷高效液相色谱（HPLC）检测方法转换为超高效液相色谱（UPLC）方法，通过条件优化改进，建立拟南芥芥子油苷UPLC检测方法。
专利名称：一种青花菜花球和籽粒高萝卜硫苷含量品种的选育方法
专利类型：发明专利
发明人：王建升,顾宏辉,虞慧芳,赵振卿,盛小光,沈钰森
申请号：CN202010628694.9
申请日：20200701
公开号：CN111837934A
公开日：
20201030
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种青花菜花球和籽粒高萝卜硫苷含量品种的选育方法，以小孢子培养获得的青花菜双单倍体(DH)系为父本，以多代回交转育获得的高萝卜硫苷青花菜品种的细胞质雄性不育系为母本，有性杂交获得的高萝卜硫苷青花菜新品种。
本发明选育获得的高萝卜硫苷青花菜品种花球中萝卜硫苷含量为普通品种(市场上最高含量品种)的2.5倍以上，籽粒中萝卜硫苷含量为107微摩尔/克以上，且不含烯基化芥子油苷组分。
申请人：浙江省农业科学院
地址：310021 浙江省杭州市江干区石桥路198号
国籍：CN
代理机构：北京众合诚成知识产权代理有限公司
代理人：刘妮
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