一、植物病原真菌的分离培养及纯化技术2011..

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810124852.X(22)申请日 2018.02.07(71)申请人 四川农业大学地址 611130 四川省成都市温江区惠民路211号(72)发明人 杨春琳　许秀兰　刘应高　(74)专利代理机构 北京众合诚成知识产权代理有限公司 11246代理人 夏艳(51)Int.Cl.C12N 1/02(2006.01)(54)发明名称一种植物病原菌物的纯化分离方法(57)摘要本发明公开了一种植物病原菌物的纯化分离方法，分离材料主要有：纯培养菌物、植物组织样品两种，采用微型吸取管或者微型挑孢针，基于PDA培养基、WA培养基和无菌浮载液进行纯化分离，本发明结合以往单孢分离方法基础上进行了改进与优化，该方法更具有实用性，且器具简单易获得、成本低廉、操作便捷、成功率较高。

权利要求书4页 说明书9页 附图4页CN 108359605 A 2018.08.03C N 108359605A1.一种基于纯培养菌物的植物病原菌物的纯化分离方法，其特征在于，采用微型挑孢针，包括以下步骤：步骤1、培养纯培养菌物单孢：取纯培养菌物，利用接种针挑取菌块接种于PDA培养基中，接种1-3皿，转移至恒温培养箱中，25℃恒温培养，1-7d，待其产孢；在纯培养菌物培养过程中，定时显微观察，若已产孢，即可进行下一步，若未产孢继续培养，若长时间培养均未产孢，需考虑更换培养基，重复上述步骤，直至产孢；步骤2、挑取单孢前期准备：取出一无菌载玻片，用擦镜纸擦拭干净，镊子夹取一块WA培养基，置于载玻片中央待用；步骤3、于WA培养基上，滴1-2滴无菌浮载液，用接种针在产孢菌落组织中轻微晃动，避免挑取菌丝，将接种针针头黏附的孢子置于无菌浮载液中，释放孢子于无菌浮载液中，使用接种针轻微扰动，在不破坏WA培养基的基础上，使孢子尽量分散开来；放置于低倍显微镜下观察，每视野内，以单个孢子分散排开为准，各孢子间隔以大于200μm为宜；将载玻片放置于无菌培养皿中，室温放置数分钟，直至WA培养基上的无菌浮载液蒸发完全，备用；步骤4、使用微型挑孢针挑取单孢：将载玻片放置于显微镜载物台上，低倍镜(4×)下寻找单孢，锁定单孢，转换高倍镜(10×)，调节视觉清晰，稳定载物台，眼手并用，使用无菌微型挑孢针缓慢接近单孢，轻微碰撞单孢使其黏附于针头尖端；若针头尖端难以黏附单孢时，事先将针头浸没于无菌浮载液中；步骤5、单孢转移与培养：单孢黏附成功后，将其转移至PDA培养基中，后放置于恒温培养箱中进行培养；重复步骤2-步骤5，以实现大量单孢的分离；步骤6、菌物观察：单孢分离结束后，定期观察孢子萌发与生长情况，若单孢分离成功，培养基中会形成单一菌落，若失败，则需重新进行单孢分离。

病原菌分离方法一、实验原理：植物患病组织内的真丝菌丝体，如果给予适宜的环境条件，除了个别种类外，一般都能恢复生长和繁殖。

植物病原菌的分离就是指通过人工培养，重染病植物组织中将病原真菌与其他杂菌相分开并从寄主植物中分离出来，再将分离得到的病原菌于适宜环境内纯化，这个过程总称植物病原的分离培养。

二、实验用具：酒精灯、手术剪、镊子、75%酒精、3%~5%次氯酸钠、灭菌水、培养皿、封口膜、乳酸等三、实验前的准备工作：1、煮培养基（PDA）：马铃薯200g,葡萄糖20g，琼脂粉(AGAR)20g（10:1:1）水1000ml（1）将去皮称量好的马铃薯切片后加水煮沸15~20min（水可以适量多加200ml 左右，因为在煮的过程中会蒸发一些），待土豆煮软即可。

（2）三层纱布滤去马铃薯后将过滤的水倒入洗净的锅中，加琼脂粉搅拌充分后再加热煮沸，小火使其充分融化。

（3）加入葡萄糖并不断搅拌，待其完全融化后双层纱布过滤，定容到1000ml，分装到500ml的玻璃瓶内，每个玻璃瓶最多装300ml，121℃湿热灭菌30min。

2、培养皿干热灭菌170℃1h;蒸馏水、枪头等湿热灭菌121℃30min。

四、实验步骤：1、用75%酒精擦拭超净工作台，所有器具用紫外灯灭菌30min,分离室要保持清洁。

2、取样，病斑大小约20个（含病缘线）3、分装培养基：（1）融PDA，松盖在微波炉中加热约3min（看量多少而定）（2）待冷却至50℃后在超净工作台指示灯显绿灯时分装(3) 分装时滴入一管乳酸约20滴（每10ml培养基中加3滴乳酸）（4）左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15m1(300ml一瓶的培养基倒20多个平板)，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。

4、表面消毒：（1）75%的酒精3ml~4ml没过样表面10s，快速吸掉酒精（2）3%~5%次氯酸钠（现配现用、避光）10ml消毒2~3min（3）无菌水冲洗2~3次5、转样：（1）器具经酒精灯消毒后无菌水水洗（2）培养皿上写明名称、分离时间后，在酒精灯旁转五点于培养基上。

植物真菌类病害组织病原菌的分离及抑菌圈实验1、病原菌的分离培养及保存1.1材料：（1）病害组织（2）分离培养基（PDA培养基）：20%土豆煮汁，2%琼脂条，1%葡萄糖，蒸馏水，121℃高温灭菌（3）次氯酸钠（4）试管斜面培养基：成分为PDA培养基，121℃高温灭菌1.2方法：剪取作物病害部位，将病害部位用次氯酸钠表面消毒后，置于分离培养基上，然后放置于28℃恒温培养箱内培养。

7天后取出，通过菌落形态和孢子镜检挑选出所要分离的病原菌转接试管斜面，然后将斜面放置于28℃恒温培养箱内培养。

7天后取出，包好放于4℃冰箱内低温保存。

2、病原菌摇瓶菌丝体的培养及菌液的制备2.1材料：（1）试管斜面孢子（2）摇瓶培养基：20%土豆煮汁，1%葡萄糖，蒸馏水，121℃高温灭菌。

2.2方法：将试管斜面孢子转接到摇瓶培养基，然后将摇瓶放到220转/分的摇床上培养，2—3天后，摇瓶菌丝体长到一定的成熟状态（不同真菌菌丝体不同）后，取下摇瓶，放于4℃冰箱内低温保存，待需要做抑菌圈实验时，将摇瓶从冰箱内取出，用组织捣碎机将摇瓶菌丝体高速捣碎2分钟左右，至菌液状态。

3、供试药剂的抑菌圈实验3.1材料：（1）打碎的病原菌菌液（2）底层培养基：2%琼脂粉、蒸馏水，121℃高温灭菌。

（3）上层培养基：成分同PDA培养基，121℃高温灭菌。

（4）链霉素溶液：2400U/mL3.2方法：（1）融化底层培养基，待温度降至70℃，倒入测定木盘，放平至凝固。

（2）融化上层培养基，待温度降至54℃，用无菌移液管加入1mL链霉素溶液以防杂菌干扰；继续降温至48℃，用无菌移液管加入6—12mL的病原菌菌液后迅速晃匀后，倒入测定木盘，放平，待凝固后，即做成抑菌圈实验所用的测定盘。

（3）稀释供试药剂到制定浓度。

（4）在测定盘内摆放牛津杯。

（5）用P型移液器将稀释好的药剂滴入牛津杯内，滴液量为0.26mL/杯，然后盖上玻璃板，放置于28℃恒温培养箱内培养，培养时间为16—18小时。

病原物的分离培养和纯化摘要：本实验采用组织分离法，在无菌操作条件下对一种山茶树叶部病原真菌进行分离培养和纯化。

该实验在PDA平板培养基的四个方向上各放置一片新鲜的病叶组织（3mm×3mm），四片病叶组织用0.1％升汞液消毒，时间分别为10s、15s、20s、25s。

设两组重复4d后观察发现，一个PDA平板培养基四个方向上都长出了菌落，而另一个只有10s和15s方向长出了菌落。

长出的菌落均较为单一，但观察可知消毒15s得到的菌落病原真菌生长最良好，因此15s 的消毒时间比较适合于这种真菌的分离。

在无菌条件下，用接种铲从消毒时间为15s的菌落边缘挑取两小块分别移入两支斜面试管培养基，在25℃左右恒温箱内培养，几天后，都被细菌污染了。

关键词:山茶病叶，真菌，分离培养，纯化，PDA培养基，斜面试管培养基目的意义在研究病原菌的形态、生理、生态以及病原菌对寄主植物的致病性等多种试验中，常常需要病原菌的纯培养物。

然而，在自然情况下，病原菌通常是与其他杂菌混生在一起的，从受病组织或其他基物中将病原菌单独分选出来，叫做分离。

分离和培养是植病实验室最基本的操作技术之一，了解其基本原理及方法，对植物病害描述、鉴定、命名以及植物病害接种体的培养等很多经常接触或者要使用到的试验操作步骤和研究手段都是很有帮助的。

通过本实验，我们可以了解植物病原菌分离培养和纯化的基本原理和方法，掌握实验室常用的消毒与灭菌方法，掌握培养基的制作和无菌操作技术。

1材料与方法1.1 试验材料1.1.1供试材料新鲜山茶树真菌病叶叶片1.1.2 试验仪器与用品真菌培养基、水、超净工作台、灭菌培养皿、试管、玻璃棒、铁架台、棉花、纱布、烧杯、接种铲、70％酒精、0.1％升汞、胶头滴管、天平、无菌水、酒精灯、火柴、镊子、剪刀、试管塞、报纸、扎绳、记号笔、不锈钢锅、电磁炉、高压锅蒸汽灭菌锅、恒温培养箱等。

1.2 试验方法1.2.1试管的制作用棉花和纱布制作试管塞，要求拔出时有明显声音，盖上时端部留3分之一且膨大，能够阻止杂菌的进入，拔出时力度合适。

植物病原真菌的分离培养精选文档TTMS system office room 【TTMS16H-TTMS2A-TTMS8Q8-实验十三植物病原真菌的分离培养一、实验原理植物患病组织内的真菌菌丝体，如果给予适宜的环境条件，除个别种类外，一般都能恢复生长和繁殖。

植物病原菌的分离就是指通过人工培养，从染病植物组织中将病原真菌与其它杂菌相分开，并从寄主植物中分离出来，再将分离到的病原菌于适宜环境内纯化，这个过程总称植物病菌的分离培养。

植物病原真菌的分离一般都是采用组织分离法，就是切取小块病组织，经表面消毒和灭菌水洗过后，移到人工培养基上培养。

二、实验目的：植物病原菌的分离培养是植物病理学实验最基本的操作技术之一，它对原害鉴定，病原形态观察、植物病害接种体的培养等方面都是经常使用的研究手段。

通过本实验，要求植物病原菌分离培养的一般原则和方法。

三、实验材料及准备：1．分离材料：梨黑斑病（Alternaria kikuchiana），柿树圆斑病（Pestnlotia sp）及杉木炭疽病（Glomerella cingolata）新发病的病叶；杨树烂皮病（Cytospora chrysosperma）国槐腐烂病（Dothiorella sp.）的带有新病斑的枝条；油松种子。

2．分离用具（每小组为单位）酒精灯4个，手术剪4把，眼科镊4把，PDA培养基3瓶，培养皿（Φ9cm）24套，小烧杯（5ml）4个，大烧杯1个，斜面培养基12管，灭菌水4瓶，75%酒精瓶1个（内放脱脂棉球）%升汞瓶1个，5%乳酸瓶（60ml）1个，火柴1盒，湿、干纱布各4张。

四、实验方法及步骤：（一）、分离前的准备工作：1．工作环境的清洁和消毒分离培养一般在无菌室、无菌箱或无菌工作台（超净工作台）上进行，无菌室和无菌箱要经过喷雾除尘，并用药物或紫外线照射消毒（常用消毒药物为70%酒精，2%煤酚皂液，5%石炭酸液等喷雾。

若用紫外线灯照射则需20-30分钟）。

实验三植物病原菌的分离和培养一、实验目的在研究病原菌的形态、生理、生态以及病原菌对寄主植物的致病性等多种试验中，常常需要病原菌的纯培养物。

然而，在自然情况下，病原菌通常是与其他杂菌混生在一起的，从受病组织或其他基物中将病原菌单独分选出来，叫作分离。

分离和培养是植病实验室最基本的操作技术之一。

通过本次实验学习植物病原菌分离培养的原理和常用的方法。

二、内容、材料和方法(一)分离材料的选择分离材料的选择对分离培养的成败有着决定的影响，因为在感病植物受害部位的内外，要有多种腐生菌，为减少腐生菌的污染，分离所用的病害材料应尽可能新鲜，并且最好在病、健交接处选材取样。

病、健交接处，除材料新鲜，污染的可能性小外，病原菌的生活力强、比较活跃，容易分离成功。

(二)分离方法病原菌分离的方法因材料不同而异，植病实验室最常见的方法有组织分离法和稀释分离法两种。

1.组织分离法：这种方法适用于大部分病菌的分离，此法又分为小块组织分离和大块组织分离两种方法。

分别以玉米大斑病、小麦根腐病和梨褐腐病为试材进行。

(1)叶斑病类病原菌的分离（玉米大斑病病菌的分离）取玉米大斑病病叶，在病、健交界处剪取2—3毫米长的病组织。

用10%漂白粉（次氯酸钙）溶液消毒（漂白粉溶液现用现配）3-5min，时间长短依病组织不同而异，然后直接移至PSA平板培养基上(为防止细菌污染，可在培养基中加入1000ppm链霉素10毫升)，倒置于20—25℃室温下，待菌落长出后挑取前缘菌丝，回接于PSA斜面培养基上，在25℃温箱中培养，待菌落颜色变深后，在无菌条件下镜检是否是玉米大斑病菌，弱仅有玉米大斑病菌的孢子，则说明已获得了纯培养，否则，则需要继续转至斜面培养基上进行纯化，直至获得纯培养。

(2)种子内部病原菌的分离（小麦根腐病菌的分离）选择典型的小麦黑胚粒3—4个，在70%的酒精中浸2—3秒钟后，以镊子夹住投入0.1%升汞溶液中表面消毒2—3分钟（处理时间可自30秒至30分钟不等），然后取出小麦粒，以灭菌水冲洗3次，再移至已倒好的马铃薯琼脂平板培养基上，注意要以小麦的黑胚部位着靠在培养基上，倒置在25℃温箱中培养，待菌落长出后，挑取前缘菌丝于马铃薯斜面培养基上培养，培养3-4天后，无菌条件下镜检是否获得纯培养。

病原菌分离培养总结（合集五篇）第一篇：病原菌分离培养总结病原菌的分离培养方法一、基本原理植物病原菌的分离培养，是植物病理实验室工作中的基本技能。

为了获得某微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧气等条件要求不同，而供给它们适宜的生活条件，即让病原菌生活在适宜的培养基上，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而得到纯菌株。

植物病原真菌的分离方法主要有组织分离法和稀释分离法两种。

最常用的方法是组织分离法，而稀释分离法主要用于病组织上产生大量孢子的病原真菌的分离。

为了获得分离菌的纯培养，必须要进行分离菌的纯化，纯化的方法类似于分离工作中采用的稀释分离法或划线分离法。

二．病原真菌的分离培养（花生褐斑病为例）1.分离的准备工作（1）分离材料准备：花生褐斑病叶片：病斑圆形或近圆形暗褐色、黑褐色，淡黄色晕圈。

背面有许多黑色小点，呈同心轮纹状排列。

（2）培养基的准备: PDA培养基,加热熔化，紫外灭菌后倒板； （3）分离工作仪器与用品：超镜工作台、培养箱、无菌培养皿、剪刀、解剖刀、镊子、接种铲(针)、70％酒精、0．1％升汞、酒精灯、火机、记号笔、橡皮筋套、可调式电炉等。

（升汞是剧毒药物，在操作时应特别小心）。

2.组织分离法（1）工作前用肥皂洗手，无菌操作前还要用70％酒精擦拭双手；在使用无菌操作间时，呼吸要轻，不要说话。

（2）酒精灯放入中间合适位置，点燃后不要在移动，保证火焰周围无菌环境；（3）取花生褐斑病的症状典型病叶(或其他分离材料)，选择典型的单个病斑，用剪刀或解剖刀从病斑边缘(病健交界处)切取小块病组织数块。

（选择新患病的组织作为分离的材料，可以减少腐生菌混入的机会。

腐生菌一般在发病很久而已经枯死或腐败的部分滋生，因此，一般斑点病害应在临近健全组织的部分分离。

）（4）表面消毒：用菌培养皿一次准备流程（75%酒精—0.1%升汞—无菌水—无菌水—无菌水），将病组织放人70％酒精中浸3—5s后，按无菌操作法将病组织移人0．1％升汞液中分别表面消毒1 min左右（如植物组织柔嫩，则表面消毒时间宜短；反之则可长些），然后放入灭菌水中连续漂洗三次，除去残留的消毒剂。

植物病原菌分离方法第四章植物病原菌分离与纯化植物病原菌一、植物病原菌分离流程二、分离的准备分离的准备工作无菌室操作前保持清洁无菌接种工作准备培养基的准备分离材料选择以收获的材料从病健交界处采样果实腐烂从开始腐烂处分离根腐和枯萎层可能从离土较远处分离有些枯萎如野火病被固定在局部，从病斑边缘分不到等有些材料污染严重时可先接种再分离：即将病组织接种到健康材料等发病后分离组织表面消毒⑴升汞：1‰◆升汞1g HCl(浓)25ml 水1000ml◆升汞先溶于盐酸中，加水后稀释，也可用NaCl 5g/L 代替盐酸，但易沉淀◆作用：盐酸，NaCl增加溶解度，HCl能增强杀菌能力。

◆处理时间：30’S-30min不等，常3－5min；所需时间因材料不同而异，消毒后灭菌水3－5次附在组织表皮的气泡，含使消毒剂不能与寄生表面直接通气影响消毒效果，除气泡抽气、70％酒精浸2－3秒⑵漂白粉◆常用表面消毒剂适用于病组织表面消毒，也可处理种子◆成分：漂白粉10g，水140ml，过滤后使用。

◆最好现配现用，放久失效，有效成分CaClO次氯酸钙◆好的消毒液易使有色纸褪色，且产生氯气有强烈臭味。

◆一般3－5min，时间长短因材料不同而不同。

处理种子5－10min，长的可达20－30min。

优点：杀菌能力强，具有挥发性，不会遗留在组织上影响分离结果，其杀菌能力小于升汞。

（3）酒精：70％，浸很短时间（几秒到1min）灭菌水洗。

◆较大的材料在酒精中浸或棉花擦，然后在火焰烧去。

◆幼嫩的病组织，表面用药剂消毒时可能会同时杀死其中的病原真菌，消毒时间应尽量缩短。

比较安全的方法是不用药剂消毒，而以灭菌水换洗八九次。

培养基的准备●分离失败的原因，有时是由于培养基不适宜。

寄生性细菌对培养基的要求要比腐生性细菌严格。

一种适宜于纯培养的培养基不一定适宜于分离（杂菌太多）●有时分离失败的原因不是培养基的成分不适宜，而是由于培养基的酸度不适当或存放的时间太长。

普通植物病理学实验十七、病原菌的分离培养和纯化一、目的要求(1)了解分离与纯化微生物的基本原理及方法。

(2)掌握倒平板的方法和组织分离、稀释分离、平板划线分离的基本操作技术。

(3)掌握在平板、斜面及液体培养基上培养病原菌及观察其培养性状的方法。

二、基本原理植物病原菌的分离培养，是植物病理实验室工作中的基本技能。

为了获得某微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧气等条件要求不同，而供给它们适宜的生活条件，即让病原菌生活在适宜的培养基上，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而得到纯菌株。

植物病原真菌的分离方法主要有组织分离法和稀释分离法两种。

最常用的方法是组织分离法，而稀释分离法主要用于病组织上产生大量孢子的病原真菌的分离。

病原细菌的分离方法以划线分离法为最常用，在有些情况下也采用稀释分离法。

为了获得分离菌的纯培养，必须要进行分离菌的纯化，纯化的方法类似于分离工作中采用的稀释分离法或划线分离法。

三、材料、仪器与用具1．材料(依当地情况进行选择，下列材料供参考)(1)稻瘟病叶、病节、病穗颈(pyricularia orycae)。

(2)玉米大斑病叶(exserohilum turcicum)。

(3)玉米弯孢菌叶斑病叶(curvularia lunata)。

(4)玉米小斑病叶(bipolaris maydis)。

(5)番茄灰霉病果(botrytis cinefca)。

(6)黄瓜菌核病果(sclerotinia sclerotiorum)。

(7)黄瓜细菌性角斑病叶(pseudomonas syringaepv．1achrymans)。

(8)水稻白叶枯病叶(xanthomonas campestms pv.oryeue)。

(9)大豆细菌性斑点病叶(pseudomonas syringaepv．glycinea)。

(10)白菜软腐病叶(erudnia carotovora subsp．carotovora)。

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植物病原菌的分离就是指通过人工培养，从染病植物组织中将病原真菌与其它杂菌相分开，并从寄主植物中分离出来，再将分离到的病原菌于适宜环境内纯化，这个过程总称植物病菌的分离培养。

植物病原真菌的分离一般都是采用组织分离法，就是切取小块病组织，经表面消毒和灭菌水洗过后，移到人工培养基上培养。

二、实验目的：植物病原菌的分离培养是植物病理学实验最基本的操作技术之一，它对原害鉴定，病原形态观察、植物病害接种体的培养等方面都是经常使用的研究手段。

通过本实验，要求植物病原菌分离培养的一般原则和方法。

三、实验材料及准备：1．分离材料：梨黑斑病（Alternaria kikuchiana），柿树圆斑病（Pestnlotia sp）及杉木炭疽病（Glomerella cingolata）新发病的病叶；杨树烂皮病（Cytospora chrysosperma）国槐腐烂病（Dothiorella sp.）的带有新病斑的枝条；油松种子。

2．分离用具（每小组为单位）酒精灯4个，手术剪4把，眼科镊4把，PDA培养基3瓶，培养皿（Φ9cm）24套，小烧杯（5ml）4个，大烧杯1个，斜面培养基12管，灭菌水4瓶，75%酒精瓶1个（内放脱脂棉球）0.1%升汞瓶1个，5%乳酸瓶（60ml）1个，火柴1盒，湿、干纱布各4张。

四、实验方法及步骤：（一）、分离前的准备工作：1．工作环境的清洁和消毒分离培养一般在无菌室、无菌箱或无菌工作台（超净工作台）上进行，无菌室和无菌箱要经过喷雾除尘，并用药物或紫外线照射消毒（常用消毒药物为70%酒精，2%煤酚皂液，5%石炭酸液等喷雾。

植物病原真菌的分离原理
植物病原真菌的分离原理主要包括以下几个步骤：
1. 采样：选择受感染的植物部位，如叶片、茎、果实等，并避免采样过程中的污染。

2. 表面消毒：使用消毒剂如70%酒精或10%次氯酸钠溶液，对样品进行表面消毒，以杀灭植物表面的细菌和真菌。

3. 组织处理：将消毒后的植物组织切碎或切割成小块，以增加真菌的释放。

4. 培养基接种：将处理后的植物组织均匀地分散于含有适宜营养物质和抑菌剂的培养基上，如琼脂培养基。

5. 培养条件：将接种好的培养基置于适宜的温度和湿度条件下，有利于真菌的生长。

6. 观察和分离：观察培养皿上是否有真菌生长，如果有，则进行分离，通常通过挑取单个真菌菌丝并转移到新的培养基上进行单菌种的培养。

7. 鉴定和纯化：通过对分离得到的真菌进行形态学观察、生理生化特性研究以及分子生物学分析等方法，鉴定其属种和病原性，并进行纯化培养。

通过以上步骤，可以将植物病原真菌从植物组织中分离出来，并得到纯化的菌种，为进一步研究真菌的生物学特性和病害防治提供了基础。

植物病原真菌的分离培养精编版MQS system office room 【MQS16H-TTMS2A-MQSS8Q8-MQSH16898】实验十三植物病原真菌的分离培养一、实验原理植物患病组织内的真菌菌丝体，如果给予适宜的环境条件，除个别种类外，一般都能恢复生长和繁殖。

植物病原菌的分离就是指通过人工培养，从染病植物组织中将病原真菌与其它杂菌相分开，并从寄主植物中分离出来，再将分离到的病原菌于适宜环境内纯化，这个过程总称植物病菌的分离培养。

植物病原真菌的分离一般都是采用组织分离法，就是切取小块病组织，经表面消毒和灭菌水洗过后，移到人工培养基上培养。

二、实验目的：植物病原菌的分离培养是植物病理学实验最基本的操作技术之一，它对原害鉴定，病原形态观察、植物病害接种体的培养等方面都是经常使用的研究手段。

通过本实验，要求植物病原菌分离培养的一般原则和方法。

三、实验材料及准备：1．分离材料：梨黑斑病（Alternaria kikuchiana），柿树圆斑病（Pestnlotia sp）及杉木炭疽病（Glomerella cingolata）新发病的病叶；杨树烂皮病（Cytospora chrysosperma）国槐腐烂病（Dothiorella sp.）的带有新病斑的枝条；油松种子。

2．分离用具（每小组为单位）酒精灯4个，手术剪4把，眼科镊4把，PDA培养基3瓶，培养皿（Φ9cm）24套，小烧杯（5ml）4个，大烧杯1个，斜面培养基12管，灭菌水4瓶，75%酒精瓶1个（内放脱脂棉球）%升汞瓶1个，5%乳酸瓶（60ml）1个，火柴1盒，湿、干纱布各4张。

四、实验方法及步骤：（一）、分离前的准备工作：1．工作环境的清洁和消毒分离培养一般在无菌室、无菌箱或无菌工作台（超净工作台）上进行，无菌室和无菌箱要经过喷雾除尘，并用药物或紫外线照射消毒（常用消毒药物为70%酒精，2%煤酚皂液，5%石炭酸液等喷雾。

若用紫外线灯照射则需20-30分钟）。

病原物的分离与培养病原物的分离与培养在植物病害的研究中具有重要意义，分离、培养病原菌的方法是植物病理学研究工作中最常应用的实验技术。

一方面，在一个新的病害研究中，通过分离与培养获得病原物的纯培养，完成柯氏法则，以明确该病病原；研究病原物的生物学特性和病害循环（侵染、病程等等）。

所谓病原物的分离，即把该病原菌从发病组织上与其他微生物分开；所谓病原物的培养，即将分离的病原菌移到可以让这种病原菌正常生长的营养基质即培养基上，从而获得其纯培养。

病原物的分离与培养，需经以以几个步骤:1.有关器皿的灭菌和消毒；2.制作培养基；3.病原菌的分离4.病原菌的培养。

－、灭菌与消毒灭菌与消毒是两个不同的概念。

灭菌则是指杀死一切微生物的营养体和孢子。

消毒一般是指消灭病原菌和有害微生物的营养体，在植物病理学实验中，需要进行纯培养，不能有任何杂菌污染，因此对所用器材、培养基和工作场所都要进行严格的消毒和灭菌。

消毒与灭菌的方法很多，一般可分为加热、过滤、辐射和使用化学药品等方法。

(一) 热力灭菌热力灭菌分干热灭菌和湿热灭菌两类。

1．干热灭菌干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。

细胞内的蛋白质疑固性与其本身的含水量有关。

在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之含水量越小，凝固越慢。

因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度高(160～170℃)，时间长1～2 h。

但干热灭菌温度不能超过180 ℃，否则包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。

干热灭菌使用的仪器是烘箱。

干热灭菌有火焰烧灼灭菌和热空气灭菌两种。

火焰烧灼灭菌适用于接种环、接种针和金属用具如镊子等，无菌操作时酌试管口和瓶口也在火焰上作短暂烧灼灭菌。

涂布平板用的三角玻棒也可在蘸有乙醇后进行灼烧灭菌。

通常所说的干热灭菌是在烘箱内利用高温干燥空气(160～170℃)进行灭菌。

此法适用于玻璃器皿如吸管和培养皿等的灭菌。

进行干热灭菌要注意以下问题：物品不要摆得太挤，以免妨碍空气流通；灭菌物品不要接触烘箱内壁的铁板，以防包装纸烤焦起火；在升温过程中，如果红灯熄灭，绿灯亮，表示箱内停止加温；电烘箱内温度未降到70℃以前，切勿自行打开箱门以免骤然降温导致玻璃器皿炸裂。

病原菌的分离培养方法一、基本原理植物病原菌的分离培养，是植物病理实验室工作中的基本技能.为了获得某微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧气等条件要求不同，而供给它们适宜的生活条件，即让病原菌生活在适宜的培养基上，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境,从而得到纯菌株。

植物病原真菌的分离方法主要有组织分离法和稀释分离法两种。

最常用的方法是组织分离法,而稀释分离法主要用于病组织上产生大量孢子的病原真菌的分离。

为了获得分离菌的纯培养，必须要进行分离菌的纯化,纯化的方法类似于分离工作中采用的稀释分离法或划线分离法。

二．病原真菌的分离培养（花生褐斑病为例)1.分离的准备工作（1)分离材料准备：花生褐斑病叶片：病斑圆形或近圆形暗褐色、黑褐色，淡黄色晕圈。

背面有许多黑色小点,呈同心轮纹状排列。

(2)培养基的准备： PDA培养基，加热熔化，紫外灭菌后倒板;（3）分离工作仪器与用品:超镜工作台、培养箱、无菌培养皿、剪刀、解剖刀、镊子、接种铲(针）、70％酒精、0．1%升汞、酒精灯、火机、记号笔、橡皮筋套、可调式电炉等。

（升汞是剧毒药物，在操作时应特别小心)。

2.组织分离法（1）工作前用肥皂洗手，无菌操作前还要用70％酒精擦拭双手；在使用无菌操作间时,呼吸要轻，不要说话.（2）酒精灯放入中间合适位置,点燃后不要在移动，保证火焰周围无菌环境；（3）取花生褐斑病的症状典型病叶(或其他分离材料），选择典型的单个病斑，用剪刀或解剖刀从病斑边缘（病健交界处)切取小块病组织数块。

（选择新患病的组织作为分离的材料，可以减少腐生菌混入的机会。

腐生菌一般在发病很久而已经枯死或腐败的部分滋生,因此，一般斑点病害应在临近健全组织的部分分离。

）（4）表面消毒：用菌培养皿一次准备流程（75%酒精—0.1％升汞—无菌水—无菌水—无菌水），将病组织放人70％酒精中浸3-5s后,按无菌操作法将病组织移人0．1%升汞液中分别表面消毒1 min左右（如植物组织柔嫩，则表面消毒时间宜短；反之则可长些），然后放入灭菌水中连续漂洗三次，除去残留的消毒剂。

普通植物病理学实验十七、病原菌得分离培养与纯化一、目得要求(1)了解分离与纯化微生物得基本原理及方法。

(２)掌握倒平板得方法与组织分离、稀释分离、平板划线分离得基本操作技术。

(3)掌握在平板、斜面及液体培养基上培养病原菌及观察其培养性状得方法。

二、基本原理植物病原菌得分离培养,就是植物病理实验室工作中得基本技能。

为了获得某微生物得纯培养，一般就是根据该微生物对营养、酸碱度、氧气等条件要求不同,而供给它们适宜得生活条件,即让病原菌生活在适宜得培养基上，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长,而抑制其她菌生长得环境,从而得到纯菌株。

植物病原真菌得分离方法主要有组织分离法与稀释分离法两种。

最常用得方法就是组织分离法,而稀释分离法主要用于病组织上产生大量孢子得病原真菌得分离。

病原细菌得分离方法以划线分离法为最常用，在有些情况下也采用稀释分离法。

为了获得分离菌得纯培养,必须要进行分离菌得纯化,纯化得方法类似于分离工作中采用得稀释分离法或划线分离法。

三、材料、仪器与用具1.材料(依当地情况进行选择,下列材料供参考)(1)稻瘟病叶、病节、病穗颈(pyricｕｌaｒia orycａe)。

（２)玉米大斑病叶(exserohilum ｔurcicuｍ)。

(3)玉米弯孢菌叶斑病叶(cｕｒvｕlarｉa lｕｎａtａ)。

(４)玉米小斑病叶(bipoｌaris mayｄiｓ)。

(5)番茄灰霉病果（botrytｉs cinefcａ)。

(６)黄瓜菌核病果（sclerotinia sｃｌerotioｒum）。

(7)黄瓜细菌性角斑病叶(pseuｄomoｎas syringaｅｐｖ.1acｈｒｙmans)。

（8)水稻白叶枯病叶(xantｈｏmoｎas campeｓｔms pv、ｏｒｙeue)。

(9)大豆细菌性斑点病叶(pseｕdomonas syringaepv.ｇlyｃiｎea)。

(10)白菜软腐病叶（eｒｕdnia cａｒｏtovｏra suｂsp.cａrotovora)。

病原物的分离与培养病原物的分离与培养在植物病害的研究中具有重要意义，分离、培养病原菌的方法是植物病理学研究工作中最常应用的实验技术。

一方面，在一个新的病害研究中，通过分离与培养获得病原物的纯培养，完成柯氏法则，以明确该病病原；研究病原物的生物学特性和病害循环（侵染、病程等等）。

所谓病原物的分离，即把该病原菌从发病组织上与其他微生物分开；所谓病原物的培养，即将分离的病原菌移到可以让这种病原菌正常生长的营养基质即培养基上，从而获得其纯培养。

病原物的分离与培养，需经以以几个步骤:1.有关器皿的灭菌和消毒；2.制作培养基；3.病原菌的分离4.病原菌的培养。

－、灭菌与消毒灭菌与消毒是两个不同的概念。

灭菌则是指杀死一切微生物的营养体和孢子。

消毒一般是指消灭病原菌和有害微生物的营养体，在植物病理学实验中，需要进行纯培养，不能有任何杂菌污染，因此对所用器材、培养基和工作场所都要进行严格的消毒和灭菌。

消毒与灭菌的方法很多，一般可分为加热、过滤、辐射和使用化学药品等方法。

(一) 热力灭菌热力灭菌分干热灭菌和湿热灭菌两类。

1．干热灭菌干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。

细胞内的蛋白质疑固性与其本身的含水量有关。

在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之含水量越小，凝固越慢。

因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度高(160～170℃)，时间长1～2 h。

但干热灭菌温度不能超过180 ℃，否则包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。

干热灭菌使用的仪器是烘箱。

干热灭菌有火焰烧灼灭菌和热空气灭菌两种。

火焰烧灼灭菌适用于接种环、接种针和金属用具如镊子等，无菌操作时酌试管口和瓶口也在火焰上作短暂烧灼灭菌。

涂布平板用的三角玻棒也可在蘸有乙醇后进行灼烧灭菌。

通常所说的干热灭菌是在烘箱内利用高温干燥空气(160～170℃)进行灭菌。

此法适用于玻璃器皿如吸管和培养皿等的灭菌。

进行干热灭菌要注意以下问题：物品不要摆得太挤，以免妨碍空气流通；灭菌物品不要接触烘箱内壁的铁板，以防包装纸烤焦起火；在升温过程中，如果红灯熄灭，绿灯亮，表示箱内停止加温；电烘箱内温度未降到70℃以前，切勿自行打开箱门以免骤然降温导致玻璃器皿炸裂。