血红蛋白的提取和分离(优质课)

50cm高
（3）样品加入与洗脱
①调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降 到与凝胶面平齐，关闭出口。 ②滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加 样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏 凝胶面。 ③样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝 胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。 ④洗脱：小心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当 高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。 ⑤收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集 流出液，每5ml收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如 果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功） ⑥注意：正确的加样操作：1、不要触及并破坏凝胶面。2、 贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。
血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过 观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋 白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。
实验结果分析与评价
1、你是否完成了对血液样品的处理？你能 描述处理后的样品发生了哪些变化吗？
观察处理的血液样品离心后是否分层，如果分层 不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原 因。 此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和 淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后 续血红蛋白的提取纯度。
凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示
基础知识
（二）缓冲溶液 1.概念:
在一定的范围内，凡是能够抵制外加少量 强酸或强碱的影响使原来溶液PH值基本保持不 变的混合溶液。
2.作用:
能够抵制外界的酸和碱对溶液PH值的影 响，维持PH基本不变。
基础知识
（二）缓冲溶液 3.缓冲溶液的配制:
通常由1－2 种缓冲剂溶解于水中配制而 成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同 PH范围内使用的缓冲液。
水 分
血 液
固体物质： 血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等 白细胞 两个α－肽链 血细胞 血小板 红细胞 血红蛋白 两个β一肽链 （最多） （90％） 四个亚铁血红素基团
血红蛋白的特点：
血红蛋白 两个α－肽链 两个β一肽链 四个亚铁血红素基团
每个肽链环绕一个亚铁血红素基团， 此基团可携带一分子O2或一分子CO2，
（一）蛋白质提取和分离步骤
样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定
（二）操作过程
1.样品处理：
可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的 血液来分离血红蛋白。
1.提问：用鸡的红细胞提取DNA，用猪、牛、羊的 红细胞提取血红蛋白的原因是什么？ 鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA 的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋 白含量丰富，便于提取血红蛋白。 2.提问：血液有哪些成分？ 血浆
(1)红细胞的洗涤:
①目的: 去除杂质蛋白，利于后续血红蛋白的分离纯化. ②操作： 1、采集血样 2、低速短时间离心（速度越高和时间越长，会使白细 胞等一同沉淀，达不到分离的效果） 3、吸取血浆：上层透明的黄色血浆。 4、盐水洗涤：下层暗红色的红细胞+五倍体积的0.9％ 的NaCl溶液洗涤，搅拌10min 5、低速短时间离心： 6、重复3、4、5步骤三次 上清液中已没有黄色：红细胞洗涤干净。
2.凝胶色谱操作:
（2）凝胶色谱柱的装填
①凝胶的选择： A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。 B、代表意义：“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度 及分离范围。 75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨 胀时吸水7.5克。 ②凝胶的前处理： 配置凝胶悬浮液： 计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中 充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。
洗涤次数过少,无法除去血浆蛋白。
(2)血红蛋白的释放：
加蒸馏水到原血液体积， 加40％体积的甲苯 （溶解细胞膜）
置于磁力搅拌器搅拌10min（加速细胞破裂）
红细胞破裂，释放出血红蛋白
(3)分离血红蛋白溶液：
①过程：将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速 度离心10 min。
②试管中溶液层次：
①当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时， 相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通 道，路程较长，移动速度较慢;②而相对分子量 较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在 凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对 分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。③依 据的特性是：蛋白质分子量的大小。
4.凝胶色谱法分离蛋白质的原理和具体过程
③凝胶色谱柱的装填方法： A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。 B、装填：将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱 内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀 注意：
1、装填时尽量紧密：降低凝胶颗粒之间的空隙。
2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅 乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。
（2）凝胶色谱柱的装填
（3）样品加入与洗脱
注意：正确的加样操作是：1、不要触及并破坏凝胶面。 2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。
收集得到的纯化后的蛋白
思考下面的问题：
1、在血红蛋白纯化的整个过程中不断用磷酸缓 冲液处理的目的是什么？ 让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持结构和 功能正常。 2、与其他蛋白质相比，血红蛋白有什么特点？ 这一特点对你进行血红蛋白的分离有什么启示？
丙烯酰胺和交联剂
N,N’-亚甲基双丙烯酰胺（形成交联）
N,N’-亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚反应
2.原理：
蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取于 它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。
3. SDS作用机理:
SDS能使蛋白质发生完全变性。解聚成单 条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分 子量。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS 复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白 质分子原有的电荷量。因而掩盖了不同种蛋 白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决 于分子的大小。
4.提问：在本课题中使用的缓冲液是:____ , 其目的是: 磷酸缓冲液
利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血 红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色)和 科学研究(活性)
（三） 电泳：
2.原理：
基础知识
1.概念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。
①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸 等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些 基团会带上正电或负电。②在电场的作用下， 这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极 移动。③电泳利用了待分离样品中各种分子带 电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不 同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实 现样品中各种分子的分离。
(4)透 析：
①过程： 取1ml的血红蛋白溶液装 入透析袋中，将透析袋 放入盛有300ml的 20mmol/l的磷酸缓冲液 中（pH为7.0），透析 12h
1mL
20mmol/L磷酸缓冲液
②目的： 除去样品中分子量较小的杂质和离子。 或用于更换样品的缓冲液。
透析过程动画演示
利用透析袋透析
2.凝胶色谱操作:
（1）凝胶色谱柱的制作：
①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端磨平。 ②底塞的制作： 打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用 100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。注意事项：玻璃管的 上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还 会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。 ③顶塞的制作：打孔→安装玻璃管。 ④组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。 ⑤安装其他附属结构。
（3）样品加入与洗脱
注意：正确的加样操作是：1、不要触及并破坏凝胶面。 2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。
三、实验结果分析与评价
1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处 理后的样品发生了哪些变化吗？
观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图518），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋 白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋 巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白 的提取纯度。
3、提取分离方法
凝胶电泳法
基础知识
（一） 凝胶色谱法（分配色谱法） 1.概念：
根据被分离的蛋白质相对分子质量的大小， 利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行 分离。
2.凝胶：
大多数凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或 琼脂糖）构成的多孔小球体，内部有许多贯穿的 通道。
基础知识
（一） 凝胶色谱法（分配色谱法） 3.凝胶色谱法的原理
第1层（最上层）：甲苯层（无色透明）； 第2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体）； 第3层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（红色透明液体）； 第4层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色）。 ③分离： 滤纸过滤：除去脂溶性沉淀层， 分液漏斗中静置：分出下层的红色透明液 体。
试管中溶液层次
甲苯层（无色透明） 白色薄层固体 红色透明液体 杂质沉淀层（暗红色）
血红蛋白的提取与分离
基础知识
1.分离生物大分子的基本思路：
选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物 理或化学性质的生物大分子。
2.蛋白质分离和提取的原理：
根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和 大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质 和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同种 类的蛋白质。 凝胶色谱法
2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你 的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？
1、由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝 胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是 否装填得均匀。 2、加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖— 2000或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色 带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。
（2）凝胶色谱柱的装填
④洗涤平衡：装填完毕后， 立即用缓冲液洗脱瓶，在 50cm高的操作压下，用300ml 的20mmol/l的磷酸缓冲液 （pH为7.0）充分洗涤平衡12 小时。注意：1、液面不要低 于凝胶表面，否则可能有气 泡混入，影响液体在柱内的 流动与最终生物大分子物质 的分离效果。2、不能发生洗 脱液流干，露出凝胶颗粒的 现象。