外泌体的分离鉴定

外泌体鉴定蛋白介绍外泌体是一类赖以解决细胞间相互作用难题的细胞外囊泡，它们包含了细胞产生的多种生物分子，如蛋白质、核酸和脂质等。

这些分子可通过外泌体释放到细胞外，进而影响周围环境中的细胞和组织。

研究发现，外泌体中所含有的蛋白质在细胞信号传递、免疫调节以及疾病发生发展等方面扮演着重要的角色。

因此，鉴定外泌体中的蛋白质成为研究者的一个重要课题。

外泌体鉴定方法外泌体的鉴定方法主要包括以下几种：1. 质谱法质谱法是当前外泌体鉴定蛋白质的主要方法之一。

通过质谱仪对外泌体样本进行分析，可以获得蛋白质的质量谱图。

然后通过与数据库中的质谱数据进行比对，可以鉴定出样本中存在的蛋白质。

这种方法准确性高，但需要较为复杂的实验设备和分析技术。

2. 免疫印迹法免疫印迹法是一种常用的蛋白质检测方法，也可用于外泌体中蛋白质的鉴定。

首先将外泌体样本进行蛋白质提取，并使用SDS-PAGE进行分离。

然后将分离后的蛋白质转移到膜上，并使用特定的抗体进行检测。

通过观察特定蛋白质与抗体的结合情况，可以确定其是否存在于外泌体中。

3. RNA测序除了蛋白质外，外泌体还携带有丰富的核酸，如mRNA和miRNA。

通过对外泌体中RNA的测序，可以鉴定出外泌体中存在的特定蛋白质的编码基因。

这种方法可以提供一种从基因水平上鉴定外泌体蛋白质的手段。

4. 免疫荧光染色免疫荧光染色是一种用于检测蛋白质分布和定位的方法。

对于外泌体鉴定，可以通过标记特定蛋白质的荧光标记物（如荧光抗体）与外泌体进行共染色，然后使用荧光显微镜观察标记物的分布情况。

这种方法提供了一种直观的方式来确定外泌体中的特定蛋白质。

外泌体鉴定蛋白的意义外泌体中所含有的蛋白质在许多生物学过程中发挥着重要的作用。

下面列举了外泌体鉴定蛋白的几个意义：1.细胞间通讯：外泌体释放的蛋白质可以作为信号分子在细胞间进行通讯。

通过鉴定外泌体中的蛋白质，可以了解细胞间通讯的机制及其调控因子。

2.免疫调节：外泌体中的蛋白质在炎症和免疫反应过程中发挥重要作用。

外泌体分离方法 ps亲和法英文回答：Extracellular vesicles (EVs) are small membrane-bound vesicles released by cells into the extracellular environment. They play important roles in intercellular communication and can carry various molecules such as proteins, nucleic acids, and lipids. Isolating EVs from biological samples is crucial for studying their contents and functions. One commonly used method for EV isolation is the PS affinity method.The PS affinity method utilizes the strong binding affinity between phosphatidylserine (PS) and lactadherin, a protein that specifically binds to PS. By usinglactadherin-coated magnetic beads or plates, EVs containing PS on their surface can be selectively captured. This method is advantageous because it can specifically enrich PS-positive EVs while excluding other non-specific particles.To perform PS affinity-based EV isolation, one would first prepare the biological sample, such as cell culture media or body fluids, and remove any cellular debris by centrifugation. Then, the sample is incubated with lactadherin-coated magnetic beads or plates, allowing the PS-positive EVs to bind to the lactadherin. After a brief incubation period, the beads or plates are washed to remove any unbound materials. Finally, the PS-positive EVs are eluted from the beads or plates for downstream analysis or functional studies.This method has been widely used in various research fields, including cancer biology, immunology, and neuroscience. For example, researchers studying cancer metastasis may use the PS affinity method to isolate EVs from the blood of cancer patients. By analyzing the EV contents, they can identify specific markers or molecules associated with metastasis and potentially develop diagnostic or therapeutic strategies. In another scenario, neuroscientists may isolate EVs from cerebrospinal fluid using the PS affinity method to investigate the role of EVsin neurodegenerative diseases.Overall, the PS affinity method is a valuable tool for isolating EVs and studying their functions. It provides a specific and efficient way to enrich PS-positive EVs from complex biological samples. By using this method, researchers can gain insights into the molecular cargo and communication mechanisms of EVs, ultimately advancing our understanding of cellular processes and disease pathogenesis.中文回答：外泌体是细胞释放到细胞外环境中的小型膜囊泡。

外泌体的研究进展一、本文概述随着生物医学研究的深入，细胞间的信息交流机制逐渐成为研究的热点。

作为细胞间交流的重要载体，外泌体（Exosomes）的研究在近年来取得了显著的进展。

本文旨在综述外泌体的基本特征、生物学功能及其在疾病诊断和治疗中的应用，同时探讨当前面临的挑战和未来的发展趋势。

我们将简要介绍外泌体的定义、结构特点以及产生机制，帮助读者理解其作为细胞间信息传递的重要角色。

接着，我们将重点讨论外泌体在肿瘤、心血管疾病、神经退行性疾病等医学领域的研究进展，包括外泌体在疾病发生发展中的作用机制，以及作为疾病标志物的潜力。

我们还将关注外泌体在疾病诊断和治疗中的应用前景，如作为药物递送载体、肿瘤疫苗以及生物标志物等方面的研究。

我们将对当前外泌体研究面临的挑战和未来的发展方向进行深入探讨，以期为推动外泌体在生物医学领域的应用提供有益的参考。

二、外泌体的结构与功能外泌体是一种由细胞主动分泌的，直径约为30-150纳米的膜性囊泡，普遍存在于各种体液中，包括血液、尿液、乳汁、脑脊液和细胞培养基等。

这些囊泡在细胞间的物质传递、信息交流以及免疫反应等方面发挥着重要作用。

近年来，随着外泌体研究的深入，其独特的结构和功能逐渐被人们所揭示。

结构上，外泌体由磷脂双分子层膜包裹着内部的水溶液组成，其膜上嵌有多种蛋白质，包括四跨膜蛋白、热休克蛋白、整合素等。

这些蛋白质不仅参与外泌体的形成和分泌过程，还负责将外泌体与靶细胞进行特异性结合，实现精准的物质传递。

外泌体的膜上还含有丰富的糖类和脂质，这些成分对于外泌体的稳定性和功能也至关重要。

功能上，外泌体具有多种生物学活性。

外泌体可以传递信息分子，如mRNA、miRNA、蛋白质等，这些分子在细胞间的信息交流过程中发挥着关键作用。

外泌体可以参与免疫反应，通过传递抗原或免疫调节分子，影响免疫细胞的活性和功能。

外泌体还具有促进血管生成、抑制肿瘤生长等多种生物学活性。

值得一提的是，外泌体的功能与其来源细胞密切相关。

外泌体的分离鉴定和生物学功能研究进展霍彩云1>2,霍华3,唐玉玲1,郭晓桐1,杨光辉1,李颖鑫1,王书扬S胡艳欣1(1.中国农业大学动物医学院,北京海淀100193； 2.北京市农林科学院畜牧兽医研究所,北京海淀100097；3.吕梁市中心医院，山西吕梁O33OOO)中图分类号：R733文献标志码:A外泌体是指由磷脂双分子层膜包裹蛋白质、脂质和核酸形成的囊泡结构，可以由几乎所有种类的细胞分泌,并存在于各种体液之中，包括血液、尿液、唾液、乳汁、羊水、恶性肿瘤、腹水等，是细胞间信号运输的主要载体[1]%近年来，由于其独特的生物学功能,使外泌体被越来越多的科学家关注，并且常被用于肿瘤诊断的早期检测标志物和疾病的临床治疗中。

本文从外泌体的分离鉴定、生物学功能以及在疾病中的临床应用等方面加以综述，以期为外泌体在临床中的诊断和治疗提供参考依据。

1分离目前对外泌体的分离主要采用4种方法，包括分级超速离心法、梯度密度离心法、超滤法和使用试剂盒提取。

其中，分级超速离心法是分离高纯度外泌体的经典方法,具有操作简单、技术难度低等优势。

由于活细胞释放多样的胞外囊泡，例如外泌体、微泡或凋亡小体等，其具有不同的结构和生物学特性[2]%外泌体直径约为50-100nm，微囊泡尺寸直径约为100-1000nm，凋亡细胞所释放的凋亡小体直径约为50~1000nm,通常可通过分级超速离心法将这些尺寸不等的囊泡分离出％当离心力为2000g时可分离出大的囊泡，而离心力为100000g时即分离出尺寸小于150nm的囊泡，可称为外泌体％然而，有文献证实这些尺寸小于150 nm的囊泡不仅是外泌体，还包括其他的囊泡⑶％梯度密度离心法、超滤法也经常用于外泌体的提取，但是其纯度较超速离心法低％然而，这3种方法收稿日期：2019—03—25基金项目：国家自然科学基金面上项目(31772702)作者简介:霍彩云(1992-),女，博士生,研究方向为预防兽医学，E-mail:1476893197@霍华(1988-),男，检验师，本科，主要从事医学检验工作，E-mail：791552312@：霍华霍云对通讯作者:胡艳欣,E-mail:huyx@文章编号：0529—6005(2020)05—0075—03均对样本的需求量大且提取过程中外泌体的损失量较多，对于如血清等稀少样品而言，存在一定的缺陷％随着技术的进步，外泌体抽提试剂盒被用于样品的外泌体分离中，尤其适用于稀少样本或外泌体分泌量少的样本％该试剂盒通常基于聚合物沉淀法，原理是体积排阻的聚合物通过夺取水分子使外泌体溶解度降低，进而在低速离心条件下发生沉降％尽管该方法具有快速、灵敏、节约样本和产量高等优点，但因其得到的外泌体纯度低而影响了外泌体功能等研究结果的可信度％因此，这4种方法各有利弊，在实际中应根据试验要求选用合适的提取方法，以期分离到高纯度的外泌体％2鉴定外泌体鉴定可分为3个层面:形态学特征、蛋白标志物、粒径和浓度。

细菌外泌体制备
细菌外泌体制备是通过培养细菌并收集其分泌的外泌体来进行的。

以下是一般的细菌外泌体制备步骤：
1. 细菌培养：选择合适的培养基和条件，将细菌进行培养，使其达到适宜的生长状态。

2. 细菌收获：当细菌生长到一定程度时，将培养液进行离心，将细菌菌体沉淀。

3. 外泌体分离：将沉淀的细菌菌体用适当的缓冲液进行重悬，然后进行超声处理或其他方法破碎菌体，释放出细菌外泌体。

4. 外泌体纯化：通过超速离心等方法，将细菌细胞碎片等杂质去除，得到相对纯净的外泌体溶液。

5. 外泌体检测：使用方法如质谱分析、电子显微镜观察等手段对纯化后的外泌体进行检测和鉴定。

需要注意的是，不同的细菌和研究目的可能需要不同的外泌体制备方法和条件。

此外，外泌体的制备过程中要注意无菌操作以避免污染。

外泌体药物开发流程外泌体药物开发流程引言外泌体药物开发是一项旨在利用细胞外囊泡（也称为外泌体）作为传递药物的载体的新兴技术。

该技术具有诸多优点，如药物稳定性和可控性较强、穿透性更强、毒副作用较低等。

本文将详细介绍外泌体药物开发的各个流程。

流程一：外泌体提取与分离外泌体的提取与分离是外泌体药物开发的第一步。

主要的步骤包括： 1. 细胞培养：选择合适的细胞株进行培养，如肿瘤细胞、造血细胞等。

2. 收集上清液：培养细胞后，将上清液收集起来，其中包含了细胞分泌出的外泌体。

3. 离心：对收集到的上清液进行离心，将其中的外泌体沉淀下来。

4. 洗涤：用适当的缓冲液进行洗涤，去除杂质。

5. 再次离心：对洗涤后的外泌体进行再次离心，获得纯净的外泌体沉淀。

流程二：纯化与表征为了确保提取到的外泌体质量优良、纯度较高，需要进行纯化与表征的步骤。

具体流程如下： 1. 超滤/浓缩：使用超滤膜对外泌体进行浓缩，去除杂质分子。

2. 纯化：采用差速离心、密度梯度离心等技术对外泌体进行纯化。

3. 鉴定：利用透射电镜、动态光散射等技术对外泌体进行形态和粒径的鉴定。

4. 蛋白质定量：利用比色法、荧光法等对外泌体中的蛋白质含量进行定量分析。

5. 其他特性分析：对外泌体的脂质组成、表面相关分子等特性进行分析。

流程三：药物封装与修饰外泌体药物开发的核心步骤是将药物封装到外泌体内，并进行合适的修饰以提升药物的稳定性和靶向性。

具体流程如下： 1. 药物封装：利用电穿孔、超声共破等方法将药物封装到外泌体内。

2. 载体修饰：通过修饰外泌体表面的脂质、蛋白质等，使其具有更好的稳定性和靶向性。

3. 药物释放：利用适当的方法，控制外泌体内药物的释放速率和方式。

流程四：药物评价与体外实验为了评估外泌体药物的疗效和安全性，需要进行药物评价和体外实验。

具体流程如下： 1. 细胞摄取实验：将药物封装的外泌体与特定的细胞系进行共培养，观察细胞是否摄取外泌体，并评估药物的释放效果。

最常用的外泌体提取方法外泌体作为近几年来的研究热点，受到了科研工作者的青睐及追捧。

由于外泌体内携带有大量的miRNA, 少量lncRNA,Mrna 以及DNA蛋白质成为液体活检的潜力无限的研究对相。

所以，获得纯度高、内容物完整的外泌体非常之重要，那么，外泌体的提取方法也显得尤为重要。

一、差速离心法差速离心法可以说是最传统最普遍的外泌体提取方法。

原理是：首先低速离心以除去细胞和细胞凋亡碎片；随后，高速离心以去除大囊泡；最后高速离心以沉淀外泌体。

具体步骤是: 以下所有步骤都在4℃下进行，1、300×g 10min，弃沉淀，去除细胞2、2000×g 20min，弃沉淀，去除死细胞3、10,000×g 30min ，弃沉淀，去除细胞碎片等亚细胞成分4、10,000×g 70min，弃上清，沉淀即为外泌体5、PBS（每10ml细胞培养液用30mlPBS重悬）清洗沉淀物，混匀， 10,000×g 70min6、l ml PBS溶解沉淀（外泌体），立即使用或置于-80℃备用。

7、一般超速离心法会结合密度梯度离心，这样得到的外泌体更纯，具体做法第4步后蔗糖梯度离心，10,000×g 70min，以去除密度大于1.21g/ml的颗粒。

优点是：成本低，操作简单，获得的囊泡数较多。

缺点是：耗时耗力（需用时8-30h，并且每次只能处理6个样本），获得的外泌体纯度不是很高，高速及重复离心也会对外泌体产生很大的伤害，并且不适用于如血浆和血清等粘性液体生物样本。

二、密度梯度离心法该方法由于比较繁琐，用的较少。

原理是：像所有的脂质小囊泡一样，外泌体可以悬浮于特定密度梯度的蔗糖中，其密度范围1.13g/ml-1.21g/ml，将要分离外泌体的样本液体置于梯度蔗糖介质上，随后通过离心将外泌体分离。

此法获得的外泌体纯度较高，但步骤繁琐，耗时，对离心时间极为敏感。

具体步骤是：收集培养2d的上清液。

不同细胞外泌体蛋白组分析检验细胞外泌体是一种细胞分泌物，它们被包裹在双层脂质囊泡中，并以外泌质的形式释放到细胞外。

细胞外泌体在生物体内起着重要的介导细胞间通讯和信息传递的作用。

近年来，对细胞外泌体的研究逐渐深入，特别是关于其蛋白组成的分析检验。

细胞外泌体蛋白组分析检验是通过不同的技术手段来鉴定和量化细胞外泌体中的蛋白质成分。

这项检验可以提供关于细胞外泌体来源、功能和生物活性等方面的重要信息。

在进行细胞外泌体蛋白组分析检验之前，首先需要从细胞培养上清液、体液样本或组织液中提取细胞外泌体。

目前常用的提取方法有超速离心法、滤膜法、聚乙二醇沉淀法等。

这些方法可以分离出细胞外泌体颗粒，并将其中的蛋白质进行后续分析。

对于细胞外泌体蛋白组分析的技术手段非常多样。

其中，质谱分析是应用最广泛的方法之一。

质谱分析可以通过测定蛋白质的质量、质量/电荷比和碎片的质谱图谱来识别和定量蛋白质。

常用的质谱分析技术有液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）和气相色谱-质谱（GC-MS）等。

此外，免疫学方法也常用于细胞外泌体蛋白组分析检验中。

例如，可以利用Western blot等技术来检测特定蛋白质的存在与表达水平。

ELISA分析则可以定量某些特定蛋白质的浓度，从而反映它在细胞外泌体中的含量。

同时，基因组分析技术也在细胞外泌体蛋白组分析中发挥重要作用。

通过转录组测序可以识别细胞外泌体中的mRNA成分，这有助于了解细胞外泌体的来源和功能。

另外，微阵列分析和多聚酶链反应（PCR）也可以用于细胞外泌体的相关分子研究。

细胞外泌体蛋白组分析检验的结果可以提供关于其功能特点的重要信息。

细胞外泌体中富集的蛋白质通常与细胞信号传递、免疫调节、细胞凋亡和肿瘤转移等生物过程密切相关。

对细胞外泌体蛋白组的深入研究，可以揭示它们在疾病发生和发展中的重要作用。

例如，许多研究表明细胞外泌体蛋白组分析检验在癌症诊断和预后评估中具有潜在的临床应用价值。

通过对细胞外泌体中的蛋白质成分进行分析，可以为肿瘤的早期筛查和疾病分子机制的研究提供重要线索。

外泌体提取方法及鉴定分析研究进展外泌体是细胞分泌的一种微小膜泡，包含了多种生物活性分子，如蛋白质、核酸和脂质等。

近年来，随着生物技术的不断发展，外泌体提取方法和鉴定分析研究取得了显著的进展。

本文将对外泌体提取方法及鉴定分析研究进展进行简要综述。

外泌体是由细胞分泌的一种直径约30-100nm的膜泡，由细胞内吞摄取并加工处理形成。

外泌体在细胞间通讯、物质运输以及疾病诊断等方面具有重要作用。

化学法是一种常用的外泌体提取方法，主要采用离心和沉淀相结合的方法。

首先将细胞培养液进行高速离心，去除细胞和较大的膜泡，然后加入沉淀剂沉淀获得外泌体。

该方法的优点是操作简单、提取量较大，适合大量样本的处理。

但是，该方法纯度较低，可能会影响后续的鉴定和分析。

生物法是一种利用细胞表面标志物进行免疫吸附的外泌体提取方法。

将外泌体进行免疫吸附，再通过洗脱得到纯度较高的外泌体。

该方法的优点是纯度高、对细胞损伤小，适用于珍贵样本的提取。

但是，该方法操作复杂，提取量较小，需要大量的抗体。

基因工程法是一种利用细胞表达特定基因的外泌体提取方法。

将目的基因转染到细胞中，通过表达特定膜蛋白，诱导细胞分泌出外泌体，再对其进行纯化和提取。

该方法的优点是纯度高、提取量较大，适用于具有特定功能的外泌体提取。

但是，该方法需要特定的基因工程技术和细胞系，操作较为复杂。

蛋白质组学在外泌体研究中的应用不断深入。

通过蛋白质组学技术，可以鉴定外泌体中的蛋白质种类、相对丰度以及修饰情况等。

通过比较不同条件下外泌体蛋白质组学的差异，可以研究外泌体的生物学特征和功能。

随着二代测序技术的不断发展，基因序列分析在外泌体研究中也得到广泛应用。

通过对外泌体中的核酸进行测序，可以鉴定其中的基因序列和表达水平。

通过比较不同条件下外泌体基因序列的差异，可以研究外泌体在细胞间通讯和疾病诊断等方面的作用。

转录组测序转录组测序可以分析外泌体中的mRNA、lncRNA和miRNA等转录本。

巨噬细胞来源外泌体的提取与鉴定晏飞利，李慧，李春红（西南医科大学药学院药剂学教研室，四川泸州646000）摘要目的：提取和鉴定巨噬细胞来源的外泌体，为后续开展外泌体相关的研究建立稳定的提取方法，并为当前外泌体的提取方法提供一定参考。

方法：使用超速离心结合过滤法提取鼠源巨噬细胞培养上清液中的外泌体；通过马尔文粒度分析仪测定其粒径大小和电位，透射电镜观察其形态特征，BCA 试剂盒测定外泌体的含量，同时用Western Blot 技术验证外泌体的特征蛋白CD9和CD63的表达。

结果：从鼠源巨噬细胞培养上清液中分离出的外泌体，马尔文粒度分析显示粒径大小为（97.3±5.73）nm，Zeta 电位为-21.26±1.72。

透射电镜下观察可见茶托样、均质、具有膜样结构的微小囊泡，直径约100nm；20mL 培养基能分离出约64μg 外泌体，Western Blot 实验结果显示特征蛋白分子CD9和CD63在外泌体提取物中表达丰度高，而在提取后的细胞上清液中没有检测到表达。

结论：本研究利用超速离心结合过滤法成功分离了鼠源巨噬细胞来源的外泌体，其形态均匀，提取含量及纯度较高。

关键词巨噬细胞；外泌体；提取；鉴定中图分类号R331文献标志码A doi ：10.3969/j.issn.2096-3351.2020.03.006Isolation and characterization of exosomes derived from macrophagesYAN Feili ，LI Hui ，LI ChunhongDepartment of Pharmaceutical Sciences of School of Pharmacy ，Southwest Medical University ，Luzhou 646000，Sichuan Province ，China Abstract Objective ：To isolate and characterize macrophage-derived exosomes for constructing a stable isola ⁃tion protocol for future relevant research ，and to provide a reference for current isolation of exosomes.Methods ：Exosomes were isolated from the culture supernatant of murine macrophages by ultracentrifugation and filtration.The size and zeta potential of exosomes were determined by a Malvern Zetasizer instrument.The morphologic fea ⁃tures were observed with a transmission electron microscope.The content of exosomes was measured using a BCA kit.Western blot was applied to determine the expression of the marker proteins CD9and CD63.Results ：The exo ⁃somes had a size of 97.3±5.73nm and a zeta potential of -21.26±1.72according to the Malvern granulometer.They were homogeneous ，saucer-like ，and membrane-like microvesicles with a diameter of about 100nm under transmission electron microscopy.Approximately 64μg exosomes were collected from 20mL culture medium.West ⁃ern blot showed high expression of CD9and CD63in the exosome isolates ，but no expression in the cell supernatant after isolation.Conclusion ：We successfully isolated exosomes from murine macrophages by ultracentrifugation and filtration ，with homogeneous morphology and high content and purity.Keywords Macrophage;Exosome;Isolation;Characterization 基金项目：国家自然科学基金（81803478）；四川省科技厅创新苗子工程项目（2017RZ0048）第一作者简介：晏飞利，女，2017级硕士生通信作者：李春红，女，副教授，博士。

-1108-宁夏医学杂志2020年12月第42卷第12期Ningxia Med J,Dec.2020,Vol.42,No.12 Doi：10.13621/j.1001-5949.2020.12.1108•实验研究•成骨细胞源性外泌体的分离提取和鉴定蔡则成】，杨绍兵2,马荣3,张彦龙】，梁思敏3［摘要］目的分离成骨细胞来源的外泌体，并对其进行鉴定。

方法体外培养成骨细胞，用差速离心法分离、提取成骨细胞分泌的外泌体，经透射电子显微镜观察其形态及大小，采用蛋白质印迹法（WB）检测外泌体跨膜蛋白CD9和成骨细胞特异性碱性磷酸酶（AKP）的表达。

结果成骨细胞源性外泌体为直径30-100nm的圆形或椭圆形结构,高表达CD9和AKP蛋白。

结论差速离心法提取的成骨细胞源性外泌体，具有外泌体的一般特性，并高表达成骨细胞特异性蛋白AKP。

［关键词］结核分枝杆菌；外泌体;成骨细胞［中图分类号］Q2-33［文献标识码］AIsolation，extraction and identification of exosomes derived from osteoblasts CAI Zecheng，Y ANG Shaobing2，MA Rong3，ZHANG Yanlong1，LIANG Simin3. 1.Ningxia Medical University，Yinchun750004，China Department of Cardiology，General Hospital of Ningxia Medical University，Y inchun750004，C hina；3.Department of Orthopae­dics，General Hospital of Ningxia Medical University，Y inchun750004，C hinaCorresponding author:L IANG Simin,Email：148376463@[Abstract]Objective The exosomes from osteoblasts were isolated and identified.Methods Osteoblasts were cultured in vitro.The exosomes secreted from osteoblasts were separated and extracted by differential centrifugation.The morphology and size of exo­somes were observed by transmission electron microscopy.The expression of CD9and alkaline phosphatase in osteoblasts were detected by Western blotting.Results The exosomes of osteoblasts were round or oval structures with a diameter of30〜100nm,which highly ex­pressed CD9and AKP protein.Conclusion The osteoblast derived from exosomes have the general characteristics of exosomes and high­ly express the osteoblast specific protein AKP.[Key words]Mycobacterium tuberculosis；E xosomes；Osteoblasts脊柱结核是由结核分枝杆菌引起的慢性感染性疾病,以进行性骨质破坏为主要病理特征［1］，破骨细胞在脊柱结核骨质破坏的发生发展中起着极其重要的作用。

外泌体提取和鉴定外泌体是一种由细胞分泌的微小囊泡，直径通常在 30 150 纳米之间。

它们在细胞间通讯、疾病诊断和治疗等方面具有重要的作用。

因此，外泌体的提取和鉴定成为了生物医学研究中的关键技术。

外泌体的提取方法多种多样，常见的包括超速离心法、超滤法、免疫亲和捕获法、沉淀法等。

超速离心法是外泌体提取的经典方法。

其基本原理是利用不同的离心速度和时间，逐步去除细胞碎片、大囊泡和其他杂质，最终获得较为纯净的外泌体。

这个过程通常需要多次离心，操作较为繁琐，且需要昂贵的超速离心机设备。

但它的优点是能够获得较高纯度的外泌体。

超滤法是基于膜孔径的大小来分离外泌体。

通过选择合适孔径的超滤膜，可以让小分子物质和溶剂通过，而将外泌体截留在膜上。

这种方法相对简单快捷，但外泌体的纯度可能不如超速离心法。

免疫亲和捕获法是利用抗体与外泌体表面特异性抗原的结合来实现分离。

这种方法具有较高的特异性和选择性，但抗体的成本较高，且可能存在非特异性结合的问题。

沉淀法是通过加入特定的试剂，如聚乙二醇（PEG），使外泌体从溶液中沉淀下来。

该方法操作简便，但获得的外泌体可能会含有较多的杂质。

在实际应用中，选择哪种提取方法取决于实验的需求和条件。

如果需要高纯度的外泌体进行深入的机制研究，超速离心法可能是较好的选择；如果是大规模的样本处理或者对纯度要求不是特别高，沉淀法或超滤法可能更为合适。

提取到外泌体之后，接下来就是鉴定。

外泌体的鉴定通常包括形态学观察、粒径分析、标志物检测等方面。

形态学观察可以通过电子显微镜技术，如透射电子显微镜（TEM）和扫描电子显微镜（SEM）。

TEM 能够清晰地显示外泌体的形态、大小和结构；SEM 则可以提供外泌体的表面特征。

通过电镜观察，可以看到外泌体呈现为具有典型双层膜结构的圆形或椭圆形小囊泡。

粒径分析常用的技术是纳米颗粒跟踪分析（NTA）和动态光散射（DLS）。

NTA 可以通过追踪单个颗粒的布朗运动来测量外泌体的粒径分布和浓度；DLS 则是基于散射光强度的波动来计算粒径。

外泌体WB鉴定的方法及步骤
一、技术简介
外泌体（Exosome）主要检测指标为CD63、CD9、CD81、Tsg101、Alix、HSP70等，针对外泌体的定性检测，至少选择2-3个指标就能满足文章发表就可以。

大部分文献中没有检测内参，个别文章中使用了Actin、GAPDH和Tubulin作为内参进行检测，外泌体中的Actin、GAPDH和Tubulin的表达丰度相对于正常细胞样品中的较低，可能会检测不到任何条带或者条带微弱。

有CD9、CD81、CD63和HSP70抗体，专门用于WB检测。

二、实验流程
1. 外泌体BCA法定量。

2. 变性聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳（SDS-PAGE）。

3. 蛋白质转移到PVDF膜。

4. 膜的封闭和抗体孵育。

5. 结果检测。

6. 提供实验报告。

人脐带间充质干细胞来源外泌体的提取、鉴定和蛋白组学分析摘要：目的：探讨人脐带间充质干细胞来源外泌体进行提取鉴定和蛋白组学。

方法：培养人脐带间充质干细胞并采用超滤序贯超离法提取外泌体，通过透射电镜、纳米颗粒跟踪分析、蛋白质定量、蛋白质印迹法及蛋白组学分析等技术鉴定。

结果①所抽取的外泌体分散度比较好，而且均匀。

②，外泌体粒径分布的高峰为（129.5+8.7) nm，它的膜表面是带有负电荷的，其浓度为8.375>109颗粒/ml，平均 zeta电位为（-28.1+3.6) mV。

③ 外泌体中存在着一类特殊的膜蛋白，即CD9,CD63等。

④蛋白质组学研究发现外泌体中的大部分蛋白都具有较高的活性，它们涉及到 RNA剪接、 mRNA加工、蛋白质折叠等生物学过程，涉及到 RNA/DNA等基因材料的合成、加工、降解等过程。

结论：经研究发现，人脐带间充质干细胞外泌体与其母系细胞存在某种“同质”、“差别”，且这些“差别”的蛋白质功能与其自身的免疫学特性都不相关，从而证实人脐带间充质干细胞外泌体具有较小的免疫学活性及较高的安全性。

关键词：人脐带间充质干细胞；外泌体;蛋白组学:免疫原性引言：间充质干细胞起源于中胚层，它是一种能够在各种组织中进行定向分裂并进行自身增生的干细胞，它可以从各种组织中被提取，比如脐带、子宫内膜息肉、月经期血液、骨髓、脂肪组织等，由于它的来源多样化，并且可以大规模地获取，所以它在实验和临床上都有着非常重要的研究价值。

本课题拟通过分离人脐带间充质干细胞源性外泌体，并通过比较两者的蛋白质组水平上的差别，验证其在体外的免疫活性，进而验证其在临床上的应用前景，并评估其在临床应用中的应用前景。

一、资料与方法1.1一般资料选取本企业2021年8月至2022年8月该时间段接受人脐带充质干细胞来源外泌体进行提取鉴定和蛋白组学分析的足月产新生儿脐带50例。

1.2方法1．2.1人脐带间充质干细胞培养及鉴定(1)人脐带充质干细胞的原代培养法：6小时之内，对所收集的脐带进行清洗，并将其两侧有瘀斑或瘀斑的部位，用 PBS对其周边及脐静脉进行彻底的清洗，并将其切割为1毫米×1毫米×1毫米的小段，并将其放置在18 wt的 DMEM全培养剂（Rh)+1 wt青链霉索 V+ DMEN （DMEM）浸润的T75玻璃瓶底部，底部向上，放置在37℃，5%体积分数的 DMEM全培养剂（DMEM）浸润的玻璃瓶中，2小时后将玻璃杯倒置，倒入5 mL DMEM全培养剂，第2日再更换玻璃杯，并用2 mL TrypL酶解，使其达到70%-80%的水平，按1:4的比例进行传代，获取生长良好3-6代细胞。

中药材外泌体鉴定摘要：外泌体是一类重要的细胞外囊泡，它们具有包裹和释放生物活性分子的功能。

近年来，外泌体在中药材研究中引起了广泛的关注。

本文综述了中药材外泌体的特征及其在中药材鉴定中的应用。

首先介绍了外泌体的定义、来源和生物学功能，然后着重讨论了中药材外泌体的提取和鉴定方法。

最后，对中药材外泌体在中药材质量评价、药效成分和作用机制研究中的应用进行了总结，并对未来的研究方向进行了展望。

一、引言中药材是中国传统医学的重要组成部分，具有悠久的历史和丰富的临床应用经验。

然而，由于中药材的复杂性和多样性，其质量控制和疗效评价一直是中药研究的难点和热点问题。

传统的中药材鉴定方法主要依赖于形态学、化学成分和药理学等方面的分析，但这些方法存在着一定的局限性和不足之处。

近年来，外泌体作为一种新的研究对象，被广泛应用于中药材的质量评价和疗效研究中。

二、外泌体的定义和来源外泌体是一类细胞外囊泡，由细胞膜包裹的囊泡内含有细胞释放出的生物活性分子，如蛋白质、核酸和小分子化合物等。

外泌体的直径一般在30-150纳米之间，可以通过离心、超滤等方法从生物体液或细胞培养上清液中分离得到。

外泌体源于多种细胞类型，包括肿瘤细胞、免疫细胞、干细胞等。

它们在生理和病理过程中起着重要的调控作用，可以通过释放内含物质与其他细胞进行相互作用和信息传递。

三、中药材外泌体的提取方法中药材外泌体的提取方法主要包括超速离心、滤膜浓缩和抗体亲和法等。

超速离心是目前最常用的外泌体提取方法之一，通过离心将外泌体从细胞上清液中分离出来。

滤膜浓缩是一种简单高效的方法，通过滤膜对外泌体进行浓缩。

抗体亲和法则是利用特异性抗体与外泌体表面标志物的结合来纯化外泌体。

这些方法各有优缺点，研究者可根据具体的实验要求选择适合的方法。

四、中药材外泌体的鉴定方法中药材外泌体的鉴定方法主要包括形态学观察、蛋白质分析和核酸分析等。

形态学观察是最直观的方法，可以通过电镜观察外泌体的形态和大小。

细菌外泌体鉴定1.引言1.1 概述细菌外泌体是一类微小的囊泡结构，由细菌分泌到其周围环境中的分泌物质。

这些外泌体在细胞间的信息传递、生物物质转运以及与宿主之间的相互作用中扮演着重要角色。

随着对细菌外泌体研究的深入，人们逐渐认识到其在细菌生理病理过程中的关键作用，包括致病机制、抗药性传递以及免疫逃逸等。

细菌外泌体的鉴定是研究细菌外泌体生物学功能的重要手段。

目前，通过综合应用生化、细胞生物学、蛋白质学等多种方法，可以鉴定和分析细菌外泌体的存在和组成。

其中，电镜观察、质谱分析以及分子生物学技术等被广泛应用于细菌外泌体的鉴定过程中。

这些方法的综合运用，有助于我们深入了解细菌外泌体的生物学特性和功能。

本文将着重介绍细菌外泌体的定义和特点，并综述了目前常用的细菌外泌体鉴定方法。

通过对已有文献的分析和总结，我们可以更加全面地了解细菌外泌体的重要性和应用前景。

同时，我们也将探讨细菌外泌体研究的发展方向和所面临的挑战，以期为今后的细菌外泌体研究提供参考和启示。

在本文的后续章节中，我们将详细介绍细菌外泌体的定义和特点，包括其组成成分、形成机制和生物学功能等。

同时，我们还将阐述常用的细菌外泌体鉴定方法的原理和优缺点，并对其应用进行讨论和评价。

最后，我们将对细菌外泌体的研究前景进行展望，并就其进一步发展的方向和挑战进行探讨。

通过对这一领域的全面了解和深入研究，我们相信细菌外泌体的鉴定将为细菌学和医学研究提供重要的理论和实践基础。

1.2 文章结构本篇文章将按照以下结构进行组织和叙述。

首先，在引言部分将对细菌外泌体进行概述，并明确本文的目的。

接着，在正文部分将详细介绍细菌外泌体的定义和特点，并介绍细菌外泌体的鉴定方法。

最后，在结论部分将强调细菌外泌体的重要性和应用前景，并讨论其发展方向和可能面临的挑战。

通过以上结构的安排，以期全面准确地介绍细菌外泌体的鉴定研究，为读者提供一份系统的概述和分析。

1.3 目的细菌外泌体作为一种重要的细胞分泌物，在生物学和医学研究领域具有广泛的应用前景。

外泌体是指包含了复杂RNA和蛋白质的小膜泡（30-150nm），现今，其特指直径在40-100nm的盘状囊泡。

其主要来源于细胞内内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。

现已证实可以分泌外泌体的细胞有：肥大细胞、淋巴细胞、树突状细胞、肿瘤细胞、间充质干细胞等。

外泌体在免疫中抗原呈递、肿瘤的生长与迁移、组织损伤的修复等生理病理上起着重要的作用。

同时，不同细胞分泌的外泌体具有不用的组成成分和功能，可作为疾病诊断的生物标志物。

1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现，1987年Johnstone将其命名为“exosome”。

多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。

其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。

所有培养的细胞类型均可分泌外泌体，且外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中。

有关他们分泌和摄取及其组成、“运载物”和相应功能的精确分子机制刚刚开始研究。

外泌体目前被视为特异性分泌的膜泡，参与细胞间通讯，对外泌体的研究兴趣日益增长，无论是研究其功能还是了解如何将其用于微创诊断的开发。

外泌体携带大量特异性的蛋白质（如细胞因子、生长因子）以及功能性的mRNAs、miRNAs等生物活性物质，在体内参与细胞通讯、细胞迁移、促血管新生和抗肿瘤免疫等生理过程，与多种疾病的发生和进程密切相关。

由于外泌体的特殊结构和功能，使得它具有潜在的应用价值，一方面可以作为诊断多种疾病的生物指标，另一方面也可以作为治疗手段，未来有可能作为药物的天然载体用于临床治疗。

外泌体的分离纯化一直是科研工作者关注的问题，获得高纯度的外泌体对后续的研究至关重要。

据了解，目前人们多采用超速离心、免疫磁珠、超滤、沉淀或试剂盒等方法实现外泌体的提取分离：1.超速离心法（差速离心）超离法是最常用的外泌体纯化手段，采用低速离心、高速离心交替进行（如图所示），可分离到大小相近的囊泡颗粒。

如何分离纯化、鉴定外泌体外泌体相关研究逐渐从小众走向大众，受到越来越多的关注，涌现了一大批的外泌体课题。

但大家还是感觉外泌体研究好难啊！为什么呢？首要原因就在于该领域里还木有统一的、简单可行且纯度很高的分离方法。

今天就来给大家聊一聊如何搞定外泌体研究中的第一步。

一、分离超速离心法:超速离心法是外泌体分离最常见的技术之一。

据不完全统计，约有1/2的研究者会选择该种方式分离外泌体。

该方法由几个离心步骤组成，可分步去除细胞、细胞碎片和大囊泡，沉淀外泌体（如图所示）。

但该种方法用于血浆和血清等粘性生物液体时效率较低，且重复离心操作有可能对外泌体造成损害，从而降低其质量。

如将超速离心配合蔗糖溶液进行梯度密度离心可得到纯度更高的外泌体，是公认可以得到最高纯度的分离方法。

但此法对离心时间非常敏感，一般需要8-30h，产率较低，同样不适用于血浆和血清等粘性生物液体中外泌体的分离，因此难以广泛普及。

聚合物沉淀法:第二大主流的外泌体分离技术就是基于聚合物的沉淀法了，最常见的聚合物是聚乙二醇（PEG）。

通常将含有聚合物的沉淀溶液与生物体液混合，4℃温育，低速离心，沉淀外泌体（如图所示）。

目前已有成熟的PEG-base商业试剂盒，比如图中的ExoQuick™（System Biosciences）。

这类试剂盒使用容易和快速，不需要额外的设备，且随着产品不断更新换代，提取效率和纯化效果逐渐提高，因而逐渐取代超速离心法并推广开来。

沉淀法的主要缺点是分离物中会有少量的聚合物存在。

不过大家不用担心，一般来说这些物质不会干扰下游分析，使用商业试剂盒提取外泌体也受到越来越多杂志的认可。

二、鉴定外泌体的鉴定是继分离后又一个困扰研究者的问题。

如果大家看过外泌体研究相关的文献，就肯定对一张图印象深刻。

不错，想发外泌体文章，光找到高效率的分离方法还不够，要过的第二关就是证明你分离得到的就是外泌体。

鉴定方式不外乎就是下面这三种：1. 形态学（电镜）；2. 粒子大小（径粒分析）；以及3. 标志蛋白（WB）。

山东植物外泌体鉴定山东植物外泌体鉴定方法及相关参考内容外泌体，是广泛存在于各种生物体中的一种细胞间通讯载体，它们被释放到环境中，可在远离原细胞的地方传递信号信息，调控相邻或远离细胞的生理和病理过程。

外泌体中包含了细胞若干的膜蛋白、脂质和核酸等生物学成分，因此对其进行鉴定显得尤为重要。

1. 外泌体采集与分离外泌体的采集与分离是外泌体鉴定的首要步骤，常用的方法有超速离心、超滤浓缩等。

超速离心是目前外泌体分离与提纯的主要方法，通过逐步加大的离心力分离出外泌体。

超滤浓缩则是通过将外泌体悬液在0.22μm的滤膜上进行浓缩。

2. 外泌体形态结构鉴定外泌体的形态结构鉴定可以通过电子显微镜观察，目前主要应用的是透射电子显微镜（TEM）和扫描电子显微镜（SEM）。

透射电子显微镜可以观察到外泌体的内部结构，而扫描电子显微镜则更适用于观察外泌体的外部形态。

3. 外泌体膜蛋白鉴定外泌体膜上富含的膜蛋白是外泌体的典型标志，因此对膜蛋白进行鉴定可以判定外泌体的存在。

常用的外泌体膜蛋白鉴定方法有免疫印迹法、质谱分析等。

免疫印迹法是通过特异性抗体识别目标蛋白，然后用酶标法或放射自显影法检测目标蛋白的存在。

质谱分析则是利用质谱技术对蛋白质进行鉴定，如蛋白质质谱分析（MS）和质谱成像技术（MSI）。

4. 外泌体核酸鉴定外泌体中的核酸可以通过聚合酶链式反应（PCR）等方法进行鉴定，其中全长RNA鉴定是目前常用的方法。

全长RNA鉴定通过提取外泌体中的RNA，然后用RNA测序技术对RNA进行分析，并结合合适的分析软件对RNA进行识别和分析，从而鉴定外泌体中的核酸。

5. 功能性鉴定外泌体的功能主要表现在调控细胞之间的信号传递和炎症调节等方面，因此进行外泌体功能性鉴定可以进一步了解外泌体的功能特性。

常用的方法有细胞摄取实验、外泌体液质量谱分析等。

细胞摄取实验通过将外泌体与接受者细胞共培养，观察外泌体的作用效果。

外泌体液质量谱分析则是通过质谱技术分析外泌体液中所含的代谢产物和蛋白质，进一步鉴定外泌体的功能。