寒凝血瘀证小鼠动物模型的建立及评价

中国中医药科技２０１０年１月第１７卷第１期Ｊａｎ．２０１０　Ｖｏ１．１７　Ｎｏ．１　・基础研究・　

寒凝血瘀证小鼠动物模型的建立及评价　周华妙　郭　勇　（‘浙江中医药大学・杭州３１００５３　浙江中医药大学第一临床医学院・杭州３１０００６）　摘要　目的：探索寒凝血瘀证动物模型的制作方法。方法：将ＢＡＬＢ／Ｃ雌性小鼠随机分为２组，即空白　对照组、寒凝血瘀组，采用肾上腺素皮下注射加冰浴法进行造模，对造模前后小鼠进行症状和体征的评　价，测定耳温及血液流变学变化等。结果：模型组小鼠出现寒战、蜷缩少动、爪尾部紫癜等症状，耳温下　降，全血黏度增高，与空白对照组比较有显著性差异。结论：该方法建立的寒凝血瘀证小鼠模型符合中医　证侯特点，具有一定的理论和实践意义。　主题词模型，动物，方法寒凝血瘀证，ｊ、鼠　

血瘀证是临床上各种疾病的常见证侯之一，近年来国内　外许多学者研究有关血瘀证动物模型的制作，运用各种现代　化手段，采用不同途径、不同思路研制出了多种血瘀证模型，　取得了可喜成就，而寒凝血瘀证作为血瘀证的一个亚型，其　模型研究一直受到人们的关注。目前该模型的制作方法…　大致有局部冻伤法、全身冷冻法、风寒环境法、冰水浸泡法、　冰水浸泡加药物法、冷刺激法、寒凉中药法等方法　］。而在　上述造模过程中存在许多随意性，如造模时间短，部分更是　急性造模，造模因素单一或局限，模型评价侧重于生化检查、　血液流变学检查等不足，目前尚没有比较成熟且公认的造模　方法。本实验以中医理论为指导，以中医“寒邪致瘀”之病因　病机，结合血瘀的现代医学的病理生理改变，采用肾上腺素　皮下注射加冰浴的方法建立寒凝血瘀证小鼠模型，为该种模　型的制作提供一种方法，以用于实验研究。　１实验材料动物：健康雌性８周龄ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠２０只，中　国医学科学院上海实验动物中心提供。试剂及药品：生理盐　水：由常州康普药业有限公司生产；０．１％盐酸肾上腺素：由　天津金耀氨基酸有限公司生产，批号：Ｈ１２０２０５２６。主要仪　器：红外耳式体温计：由泰尔茂医疗产品（杭州）有限公司生　产。自动血流变测试仪：北京众驰伟业科技发展有限公司。　２实验方法　２．１造模每天定点小鼠皮下注射０．１％肾上腺素０．０８ｍｌ／　ｋ（用生理盐水稀释至０．２ｍ１），分２次注射，第一次注射后１　小时，进行冰浴（４～６￣Ｃ）４分钟，再过１小时后第２次注射，　连续２周，后２周造模隔天进行。　２．２观察指标及测定　２．２．１症状和体征量化评分表　依据《中药新药临床研究指导原则》（２Ｏｏ２年）、《中医临　床诊疗术语－证侯部分》（１９９７年）及《实验动物学》（陈主初　吴端生主编）制定，见表１。　表１　’　寒凝血瘀证小鼠症状和体征量化评分表　

注：以上评分表中，每项症状和体征轻度为１分，中度为２分，重度为３分，其中总分１～７分为轻度寒凝血瘀征表现，８～１４分为中度寒凝　血瘀证表现，１５～２１分为重度寒凝血瘀证表现。未出现上述症状和体征者计为０分。　２．２．２耳温红外耳式体温计测定。　液流变仪测定。　２．２．３全血黏度　于第２８天，处死小鼠，取血采用自动血　２．３统计学处理采用ＳＰＳＳ１３．０软件包统计，数据均用均　

△通讯作者　数±标准差（　±ｓ）表示，组问差异的显著性采用ｔ检验。　３结果　・２・　中国中医药科技２０１０年１月第１７卷第１期Ｊａｎ．２０１０　Ｖｏ１．１７　Ｎｏ．１　３．１　小鼠不同时段症状和体征量化评分见表２。　表２　寒凝血瘀证小鼠症状、体征量化评分积分表（　±ｓ）　

表２表明模型组小鼠因受寒湿之邪侵袭，一般先有畏　寒、发热与饮水增多等表寒证。在连续冰浴１—２周后，小鼠　出现畏寒喜暖，食少便稀，蜷缩少动，背弓毛枯，口周、齿龈、　爪甲、耳缘紫暗等寒凝血瘀证症状。　３．２小鼠不同时段耳温的变化见图１。　

——空白对照组　…寒凝血癀组　

图１两组小鼠耳温变化折线图　图１表明模型组小鼠造模２～３天后出现发热，随着冰　浴的进行，体温开始下降至正常，造模１周后体温继续进行　性下降，第ｌ２天左右降至３７℃以下。　３．３各组小鼠全血黏度的变化见表３。　表３　两组小鼠全血黏度的检测结果（　±ｓ，ｍＰａ・ｓ）　

与空白组比较＊Ｐ＜Ｏ．晒。＊＊Ｐ＜０．０１　４讨论　中医认为，寒为阴邪，具有凝滞、收引的特性，人体的气　血，得温则行，遇寒则凝，当寒湿之邪侵袭机体，致使血脉瘀　滞，气血运行不畅；且寒可伤阳，阳气具有温煦脏腑及温运血　脉的功能，阳气受损，阴寒凝滞，不能温运血脉、推动气血运　行，以致血行不通则成血瘀之证。《内经》中提到，“寒邪博　击，易损肌肤脉络脏腑”，“寒独留则血凝泣、凝则脉不通，寒　则凝，凝则成瘀。”近年来，根据中医学寒凝血瘀证的病因、病　机或血瘀的病理生理改变而建立的寒凝血瘀证动物模型的　方法有很多，如吴氏等【３　曾将家兔后肢被毛除去，用冰袋上　下左右围置，冷冻１．５小时，成功建立了家兔的寒凝血瘀模　型；郑氏＿４　将大鼠置于低温冰柜，在零下１５℃的冷环境中，　持续受冻４小时，建造了大鼠的急性寒凝血瘀模型。又如成　氏　将大鼠置于０　１℃冰水中２ｏ分钟，１次／ｄ，连续２周建　造寒凝血瘀证模型；袁氏利用低温寒冷环境复制法复制　等【６ｊ。　本实验根据朱氏　７　等用肾上腺素皮下注射加冰水刺激　建立大鼠寒凝血瘀模型，考虑到小鼠的生理特性不同于大　鼠，将该造模方法加以改良，经多次反复预实验，调整冰浴的　最佳温度为４～ＣＣ，刺激时间为４分钟，盐酸肾上腺素每天　注射量为０．ｏ８ｒｒｄ，ｋ，分２次注射，整个造模时间增加到４周，　以趋符合“久病必瘀”的特点。采用冰浴之寒冷刺激，使小鼠　交感神经兴奋，引起反射性血管收缩，此时小鼠整个机体表　现为生理功能代偿性增强，出现代谢亢进的寒战发热，饮水　增多等表寒发热的症状，随着造模的进行，到第２周逐渐出　现蜷缩少动欲睡，毛枯背弓，寒战但无发热，甚者反应迟钝，　呼吸微弱，机体失去代偿能力，继续寒冷刺激使血管内皮细　胞损伤，受损细胞又释放出生物活性物质，血管壁通透性增　高，血浆大量渗出，使血液增黏、增浓、增聚，微循环障碍，整　个造模过程中联合盐酸肾上腺素皮下注射，造成慢性内皮细　胞损伤，并诱导血小板聚集、红细胞聚集，加重血液凝聚状　态，造模的后两周小鼠状态差，血瘀证症状明显，经反复预实　验采用隔日造模，减少刺激量，以维持寒凝血瘀证证侯或缓　慢加重该证侯的程度，同时减少小鼠死亡率。本实验结果表　明，造模组小鼠较空白组有明显的寒凝血瘀证症状，且全血　黏度均有增高，较空白对照组小鼠有显著性意义，表明建立　的小鼠寒凝血瘀模型成功。　本实验模拟了中医病因病机，结合现代医学病理生理学　基础，从中西医两方面因素出发造模，并且延长了造模时间，　更符合血瘀证“久病～慢性”的特点，这些都与临床较为接　近，较以往采用单一的突发强冷刺激造成的急性模型更接近　血瘀证的发病过程，而且在该模型的评价过程中，更注重寒　凝血瘀证的症状和体征特点，即外部表征，根据《中药新药临　床研究指导原则》及《中医临床诊疗术语・证侯部分》中有关　于寒证、血瘀证的特点，结合小鼠的生理特性，总结出了小鼠　寒凝血瘀证的症候群，并将其量化评分，以评定小鼠寒凝血　瘀证候的程度。在实验过程中，侧重小鼠症状和体征特点的　变化，强调中医“司外而揣内”的思维方式。　中医辨证就是将四诊（望、闻、问、切）所收集的有关疾病　的所有资料，包括症状和体征，概括判断为某种证，四诊是辨　证的基础，而望诊为四诊之首，我们通过望诊对小鼠症状和　体征的变化进行评分，从而辨证为寒凝血瘀证，这与临床中　医辨证论治原则相符合。另外，本实验中对小鼠冷冻的持续　刺激，与盐酸肾上腺素的作用，都是全身性的，使小鼠模型更　全面，更具整体性，同时也体现中医的整体观念。此外，许多　寒凝血瘀证模型大多采用兔、大鼠等较大型动物，较少采用　小鼠，本文采用小鼠造模，该模型有复制简单方便，重复性好　等优点。本实验的小鼠寒凝血瘀证模型符合中医理论的特　点及疾病发病规律，体现了中医辨证论治原则和整体观念，　为该模型的制作提供一种思路，一个方法，以供应用于实验　研究。　参考文献　１谷万里，张俏，史载祥．寒凝血瘀证动物模型的研究述评．中国中　医药信息杂志，２ＯＯ７，６（１４）：８９．　（下转第７页）　中国中医药科技２０１０年１月第１７卷第１期Ｊａｎ．２０１０　Ｖｏ１．１７　Ｎｏ．１　・　７　・　３结果　正常对照组：见图１。细胞间质内邻近肌问丛神经元可　见ＩＣＣ，呈卵圆形或不规则形，细胞突起较多，表面有短粗状　微绒毛，突起间可见细胞嵌合连接，胞质内可见较多环形线　粒体，嵴清晰，粗面内质网发达，表面附着核糖体颗粒及较多　的游离核糖体颗粒、高尔基复合体及少量溶酶体。核大，呈　椭圆形或不规则形，占细胞绝大部分，异染色质较多见，沿核　膜内侧分布，其壁内神经及ＩＣＣ的突起相互连接形成网络，　分布均匀。ＩＣＣ之间及其与平滑肌细胞、神经细胞之问多见　由紧密并置的质膜形成的缝隙连接。　糖尿病模型组：见图２。大鼠胃体的ＩＣＣ数量较正常对　照组减少，细胞表面间隙增宽，嵌合连接松散，细胞体积变　小，膜不清晰。细胞间连接结构有病理损害，结构不清，胞质　部分溶解，线粒体减少，肿胀，嵴断裂或消失，呈空泡样改变，　粗面内质网扩张，表面核糖体脱落。部分细胞核轻度萎缩，　间隙增宽，核内异染色质集聚成团块状。细胞间、细胞与平　滑肌细胞及神经末梢之间的连接减少，大鼠胃的壁内神经及　ＩＣＣ分布不均匀，结构不清，突起连接杂乱。胃毛细血管细　胞排列不齐，部分肿胀并突人管腔使管腔迂曲，胞质有少量　空泡形成。　胃轻瘫模型组：见图３。大鼠胃体的ＩＣＣ数量较空白组　明显减少，细胞表面间隙增宽，嵌合连接松散、消失，细胞体　积变小，膜不清晰。细胞胞问连接结构有病理损害，结构不　清，胞质广泛溶解，线粒体明显减少，肿胀，嵴断裂或消失，呈　空泡样改变，粗面内质网扩张，表面核糖体脱落，游离核糖体　数量减少，次级溶酶体数量增多。细胞核轻度萎缩，间隙增　宽，核内异染色质明显聚集成团块状，分布在核的内膜侧。　细胞之间、细胞与平滑肌细胞及神经末梢之间的紧密连接显　著减少，大鼠胃的壁内神经及ＩＣＣ分布不均匀，结构破坏，连　接松散，突起连接杂乱或不能连接成网。胃毛细血管细胞排　列不齐，部分肿胀并突入管腔使管腔迂曲，胞质内有大量空　泡形成。　西药治疗组与电针治疗组：两组大鼠胃ＩＣＣ的数量较胃　轻瘫模型组增多，较正常对照组稍减少。ＩＣＣ形态结构基本　正常，细胞表面突起增多，可见细胞连接，胞质内线粒体数量　较胃轻瘫模型组增多，嵴清晰可见，粗面内质网排列整齐，数　量较多，表面核糖体颗粒均匀。ＩＣＣ与平滑肌细胞及神经末　梢间连接的病理损害较胃轻瘫模型组轻，其结构较清晰而紧　密。壁内神经及ＩＣＣ的分布及突起连接的病理损害较胃轻　瘫模型组为轻。见图４～５。