细胞凋亡实验步骤及注意事项

实验项目名称细胞凋亡的显示一、实验目的1．了解细胞凋亡的形态学观察2．掌握荧光显微镜的使用方法二、实验原理1.细胞凋亡，是由基因编辑控制的细胞主动参与的自杀过程，是一种生理性调节机制。

细胞发生凋亡时，在组织中是呈单个细胞发生;细胞体积浓缩:细胞器完整，细胞膜完好;细胞核浓缩、碎裂(染色质浓缩)，有规律性的断裂成核碎片。

细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期:1期的细胞核呈波纹状(rippled)或呈折缝样(creased)，部分染色质出现浓缩状态;Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;b期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。

2.顺铂等肿瘤化疗药物可以作为细胞凋亡诱导剂诱导细胞凋亡。

三、实验仪器与试剂1.材料：A549肺癌细胞2.仪器：荧光显微镜3.试剂：0.01mM PBS, 4%多聚甲醛，DAPI染料4．其它:盖玻片、载玻片、细胞培养板、移液枪、封口膜、烧杯、滤纸、滴管,吸水纸等。

四、实验步骤（一）荧光显微镜使用步骤○1将已处理好的样本放到载物台上○2将10X物镜转入光路，调节载物台纵横移动手轮，将标本移入光路○3调节滤光片转换器，选择3档UV光观察:○4调节粗条手轮，看清荧光图片轮廓后，再调节微调手轮调节，直至看到清晰的荧光图像。

○5推出摄影/目视切换杆，电脑拍照（二）观察细胞凋亡1. 盖玻片置于细胞培养皿中，二氧化碳培养箱培养A549肺癌细胞24h，形成细胞爬片；随后加入浓度为3ug/ml的顺铂培养24h，诱导细胞凋亡；2. 取出细胞培养皿，吸出培养基；3. PBS洗涤2次：加入2ml PBS，静置2min，吸出；重复操作一次；4. 加入2ml 37℃预温过的 4%多聚甲醛固定细胞10min；5. 在干净的封口膜中滴加20ul稀释好的DAPI，小心取出细胞爬片，细胞面向下避光孵育10min；6. PBS 洗涤2次：吸水纸吸干DAPI，在爬片一端用注射器加入PBS约0.1ml，吸水纸在爬片另一端吸出PBS（虹吸法）；重复操作一次。

细胞凋亡诱导技术的使用教程细胞凋亡是一种广泛应用于生物研究和药物开发领域的重要技术。

它是一种程序性细胞死亡的形式，通常由外界刺激或内源性信号引起。

本文将为您介绍使用细胞凋亡诱导技术的步骤、方法和注意事项。

第一步：选择适当的细胞凋亡诱导剂在进行细胞凋亡实验前，您需要根据实验目的和研究对象选择适当的细胞凋亡诱导剂。

常用的细胞凋亡诱导剂包括化学物质如顺铂和纤维芽细胞生长因子（FGF）等，以及光照、温度、药物等其他外界刺激。

确保所选的诱导剂具有稳定的活性和可重复性。

此外，在选择诱导剂时，还需考虑细胞类型和所需的凋亡研究重点。

第二步：确定适当的细胞系和培养条件选择适当的细胞系对于细胞凋亡实验至关重要。

不同类型的细胞对于细胞凋亡的响应可能不同，因此在开始实验之前，您应首先确认所选细胞系是否容易发生细胞凋亡。

一般来说，肿瘤细胞比正常细胞更容易发生凋亡反应。

此外，确定细胞的培养条件也是非常重要的。

不同的细胞系对培养基组分和培养条件的要求有所不同，在实验前应进行相关的优化。

第三步：优化诱导剂的浓度和处理时间在实验中，您需要确定诱导剂的最佳浓度和处理时间。

这些参数的选择应基于前期的实验数据和文献报道。

一般来说，使用较低剂量的诱导剂和较短的处理时间可以获得更为准确和可靠的实验结果，并减少不必要的细胞损失。

因此，在进行正式实验之前，先进行浓度梯度和时间梯度的预实验是非常重要的。

第四步：检测细胞凋亡的方法选择在细胞凋亡实验中，您需要选择适当的方法来检测细胞凋亡的程度。

常用的方法包括荧光染料染色、流式细胞术和电镜观察等。

荧光染料如荧光素酶染料（如Annexin V-FITC/PI染色）可用于进行早期和晚期凋亡细胞的区分，而流式细胞术则可提供关于凋亡细胞比例和细胞周期的详细信息。

根据实验需要和设备条件，选择适当的检测方法。

第五步：数据分析和实验结果解读在完成细胞凋亡实验后，您需要对结果进行合理的数据分析和解读。

根据实验所用的方法，计算并记录凋亡细胞比例、细胞周期等相关指标。

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常见细胞凋亡检测的方法与注意事项大家常把细胞凋亡和细胞坏死混淆,其实两者是不同的细胞死亡形式，大家可以在死亡细胞的形态、生化和分子指标上将二者区分开来，细胞凋亡检测的方法不少，这里就总结下几种常用的检测方法.细胞凋亡检测更多详情，点击查看不可不知的细胞检测方法——MTT一、细胞凋亡的形态学检测根据凋亡细胞固有的形态特征，人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。

1 光学显微镜和倒置显微镜（1) 未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。

贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落.(2）染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等.凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。

2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。

常用的DNA特异性染料有:HO 33342 (Hoechst 33342），HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。

三种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。

紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。

Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释成终浓度为2~5mg/ml。

DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。

细胞凋亡检测技术的使用注意事项细胞凋亡（Apoptosis）是一种正常的基因调控程序性细胞死亡过程。

它在生物体发育、组织修复以及免疫系统调节中发挥着重要作用。

因此，准确检测和分析细胞凋亡对于科学研究和临床诊断具有重要意义。

细胞凋亡检测技术的使用要求细致和准确，以下是一些使用注意事项。

1. 样本处理和细胞抗原表达的影响：在进行细胞凋亡检测时，样本的处理和细胞抗原表达水平会直接影响结果的准确性。

确保样本处理过程中的细胞收集和处理操作严谨，以避免细胞损伤或凋亡反应的异常。

此外，细胞表面的抗原表达水平在不同的细胞类型和状态下可能会有很大的差异，因此，在选择检测方法时应对不同的细胞类型和处理条件进行优化。

2. 正确选择适当的检测方法：细胞凋亡的检测方法多种多样，包括细胞色素c释放、DNA碎片化、磷脂外翻等。

在选择合适的检测方法时，应根据实验需求和被测细胞类型的特点进行合理的选择。

不同的方法有不同的优缺点，例如，某些方法可能适用于细胞培养液中的凋亡细胞检测，而另一些方法则适用于体外分离的凋亡细胞。

所以，根据实际情况和实验目的选择最适合的方法是非常重要的。

3. 标本处理的严谨性：细胞凋亡的检测过程要求标本处理过程非常严谨，尤其是对于实验中的组织或细胞培养样本。

任何可能影响结果的因素（如变性剂、酶处理、酸碱度等）应避免或最小化。

此外，应避免样本受到过高温度的影响，以免造成凋亡过程的不正常启动。

4. 控制实验条件的一致性：为了确保结果的稳定和可靠，实验的条件应保持一致。

包括培养基的成分和浓度、细胞的培养时间以及细胞密度等因素都应在不同的处理组中保持一致。

此外，应严格控制实验室温度和湿度等环境条件，以确保实验的可重复性和结果的准确性。

5. 合理设置负对照和阳性对照：细胞凋亡检测中，合理设置适当的对照组是确保结果准确性的关键。

负对照组是指未经处理或未经暴露于凋亡诱导剂的样本组，用于检测基线的细胞死亡情况。

阳性对照组是指使用已知凋亡诱导剂处理的样本组，用于验证技术的敏感性和有效性。

细胞凋亡检测步骤
细胞凋亡检测步骤一般包括以下几个步骤：
1. 收集细胞样品：收集需要检测凋亡的细胞样品，可以是培养细胞、动物组织或人体组织。

样品应保持新鲜和完整。

2. 处理细胞样品：根据实验需要，对细胞样品进行处理，例如给予某种刺激物或药物，或者采用特殊培养条件。

3. 准备细胞悬液：将处理后的细胞样品转移到离心管中，并加入适量的培养基或缓冲液，制备细胞悬液。

悬液中细胞应保持单细胞状态。

4. 染色：根据实验要求，选择适当的染料对细胞进行染色。

常用的凋亡染色方法包括荧光染色和酶标法。

5. 流式细胞仪检测：将染色后的细胞悬液通过流式细胞仪进行检测。

流式细胞仪可以检测和分析细胞中的荧光强度或酶标信号，进而评估细胞凋亡程度。

6. 数据分析：根据流式细胞仪检测到的数据，进行数据分析，计算细胞凋亡率或凋亡指数等参数。

大学生物实验教案：细胞凋亡检测方法1. 引言在生物学研究中，细胞凋亡是一个重要的研究领域。

凋亡指的是一种正常的细胞死亡过程，与坏死不同，它是有调控性且高度可逆的。

本实验教案旨在介绍几种常见的细胞凋亡检测方法，帮助学生更好地理解和操作这些技术。

2. 背景知识在深入了解各种细胞凋亡检测方法之前，首先需要对细胞凋亡有一定的了解。

这包括细胞凋亡的定义、机制和相关的分子标志物等内容。

2.1 细胞凋亡的定义细胞凋亡是一种程序性、自我调节性的死亡过程，通常是由于内部或外部信号引起某些基因表达改变而触发。

它涉及到一系列形态学和生化方面的变化，如核DNA断裂、磷脂外翻、线粒体功能障碍等。

2.2 细胞凋亡机制细胞凋亡的机制非常复杂，涉及到众多信号通路和调控分子。

关键的信号通路包括线粒体途径、死亡受体途径和内质网应激等。

这些通路会导致特定的分子事件，如半胱氨酸蛋白酶活化、Bcl-2家族调控、caspase家族激活等。

2.3 细胞凋亡的标志物在研究中常用的细胞凋亡标志物有许多，其中包括DNA断裂检测、磷脂外翻检测、线粒体功能评估和caspase活性测定等。

3. 细胞凋亡检测方法本节将介绍一些常见的细胞凋亡检测方法，以供学生参考。

3.1 DNA断裂检测通过DNA断裂检测可以间接地评估细胞凋亡程度。

该方法利用凝胶电泳分析DNA断裂情况。

在细胞凋亡过程中，DNA会发生断裂并产生“DNA ladders”。

3.2 Annexin V/PI染色法Annexin V/PI染色法是一种常用的细胞凋亡检测方法。

它利用流式细胞仪检测细胞上磷脂外翻与细胞膜完整性的变化。

Annexin V能特异性结合在磷脂外翻表面，而PI则可标记因正常死亡或损伤而破裂的细胞。

3.3 MitoTracker染色法MitoTracker是一种线粒体特异性染料，可以用于评估细胞凋亡过程中线粒体功能的变化。

该方法通过显微镜观察线粒体的形态和荧光强度变化来判断凋亡程度。

细胞凋亡实验报告细胞凋亡实验报告引言：细胞凋亡是一种重要的细胞死亡方式，它在维持生物体内部平衡和发育过程中起着关键作用。

本次实验旨在通过细胞凋亡实验，探究不同因素对细胞凋亡的影响，从而进一步了解细胞凋亡的机制和调控。

材料与方法：1. 细胞系：使用人类肺癌细胞系A549作为实验对象。

2. 药物：选择化学药物紫杉醇（Paclitaxel）作为细胞凋亡诱导剂。

3. 细胞培养条件：将A549细胞系在含有DMEM培养基和10%胎牛血清的培养皿中培养，保持在37℃、5% CO2的恒温培养箱中。

实验步骤：1. 细胞培养：将A549细胞系接种于培养皿中，培养至细胞密度达到80%左右。

2. 细胞处理：将培养皿中的培养基抽取，加入不同浓度的紫杉醇处理液，分为高、中、低三个浓度组，每组设置相应的对照组。

3. 细胞观察：将处理后的细胞培养皿放回恒温培养箱中，培养24小时后观察细胞形态和数量的变化。

4. 细胞计数：使用显微镜观察细胞数目，并通过计数室内的细胞数目，计算细胞存活率。

5. 细胞凋亡检测：使用流式细胞仪检测细胞凋亡率，采用荧光染料标记细胞并进行分析。

结果与讨论：在本次实验中，我们观察到不同浓度的紫杉醇处理后，A549细胞的形态和数量发生了明显变化。

在高浓度组，细胞数量明显减少，细胞形态发生变化，出现细胞收缩和凋亡体的形成。

而在低浓度组，细胞数量减少较少，细胞形态变化不明显。

对照组中，细胞数量和形态均与处理组相似。

通过细胞计数的结果，我们计算出了细胞存活率，并发现随着紫杉醇浓度的增加，细胞存活率逐渐降低。

这说明紫杉醇可以诱导A549细胞发生凋亡，并且凋亡率与药物浓度呈正相关。

进一步使用流式细胞仪检测细胞凋亡率，我们发现在高浓度组中，细胞凋亡率明显增加，而在低浓度组和对照组中，细胞凋亡率相对较低。

这与细胞存活率的结果相一致，进一步验证了紫杉醇可以诱导A549细胞发生凋亡的能力。

细胞凋亡是一种高度调控的细胞死亡过程，它在生物体内部平衡和发育过程中发挥着重要作用。

细胞凋亡检测,细胞凋亡实验步骤,检测方法一、定性和定量研究只定性的研究方法：常规琼脂糖凝胶电泳、脉冲场倒转琼脂糖凝胶电泳、形态学观察普通光学显微镜、透射电镜、荧光显微镜进行定量或半定量的研究方法：各种流式细胞仪方法、原位末端标记法、ELISA定量琼脂糖凝胶电泳;二、区分凋亡和坏死可将二者区分开的方法：琼脂糖凝胶电泳,形态学观察透射电镜是是区分凋亡和坏死最可靠的方法,Hoechst33342/PI双染色法流式细胞仪检测,AnnexinV/PI 双染色法流式细胞仪检测等;不能将二者区分开的方法：原位末端标记法、PI单染色法流式细胞仪检测等;三、样品来源不同选择组织：主要用形态学方法HE染色,透射电镜、石蜡包埋组织切片进行原位末端标记,ELISA或将组织碾碎消化做琼脂糖凝胶电泳;四、细胞凋亡检测1、早期检测:1 PS磷脂酰丝氨酸在细胞外膜上的检测2细胞内氧化还原状态改变的检测3细胞色素C的定位检测4 线粒体膜电位变化的检测2、晚期检测：细胞凋亡晚期中,核酸内切酶在核小体之间剪切核DNA,产生大量长度在180-200 bp 的DNA片段;对于晚期检测通常有以下方法：1 TUNEL末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记2 LM-PCR Ladder 连接介导的PCR检测3 Telemerase Detection 端粒酶检测3、生化检测：1典型的生化特征：DNA 片段化2检测方法主要有：琼脂糖凝胶电泳、原位末端标记TUNEL等3TUNEL末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记4通过DNA末端转移酶将带标记的dNTP 多为dUTP间接或直接接到DNA片段的3’-OH端,再通过酶联显色或荧光检测定量分析结果;可做细胞悬液、福尔马林固定或石蜡处理的组织、细胞培养物等多种样本的检测;4、LM-PCR Ladder 连接介导的PCR检测当凋亡细胞比例较小以及检测样品量很少如活体组织切片时,直接琼脂糖电泳可能观察不到核DNA的变化;通过LM-PCR,连上特异性接头,专一性地扩增梯度片段,从而灵敏地检测凋亡时产生梯度片段;此外,LM-PCR 检测是半定量的,因此相同凋亡程度的不同样品可进行比较;如果细胞量很少,还可在分离提纯DNA后,用32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶TdT使DNA标记,然后进行电泳和放射自显影,观察凋亡细胞中DNA ladder的形成;上述两种方法都针对细胞凋亡晚期核DNA断裂这一特征,但细胞受到其它损伤如机械损伤,紫外线等也会产生这一现象,因此它对细胞凋亡的检测会受到其它原因的干扰;需结合其它的方法来检测细胞凋亡;其它方法：1Telemerase Detection 端粒酶检测端粒酶是由RNA和蛋白组成,它可以自身RNA为模板逆转录合成端粒区重复序列,使细胞获得“永生化”;正常体细胞是没有端粒酶活性的,每分裂一次,染色体的端粒会缩短,这可能作为有丝分裂的一种时钟,表明细胞年龄、复制衰老或细胞凋亡的信号;研究发现,90%以上的癌细胞或凋亡细胞都具有端粒酶的活性;2mRNA水平的检测研究者们发现了很多在细胞凋亡时表达异常的基因,检测这些特异基因的表达水平也成为检测细胞凋亡的一种常用方法;据报道,Fas 蛋白结合受体后能诱导癌细胞中的细胞毒性T细胞cytotoxic T cells 等靶细胞;Bcl-2 和bcl-X 长的作为抗凋亡bcl-2 和bcl-X的调节物,它们的表达水平比例决定了细胞是凋亡还是存活;用荧光定量PCR技术来检测基因表达水平无疑比之前者更快更准确;通过检测fas, bax-alpha 和bcl-X 长的基因的mRNA表达水平来进行细胞凋亡的检测; 5、细胞内氧化还原状态改变的检测：正常状态下,谷光苷肽GSH作为细胞的一种重要的氧化还原缓冲剂;细胞内有毒的氧化物通过被GSH还原而定期去除,氧化型的GSH又可被GSH还原酶迅速还原;这一反应在线粒体中尤为重要,许多呼吸作用中副产物的氧化损伤将由此被去除;当细胞内GSH的排除非常活跃时,细胞液就由还原环境转为氧化环境,这可能导致了凋亡早期细胞线粒体膜电位的降低,从而使细胞色素C三羧酸循环中的重要组分从线粒体内转移到细胞液中,启动凋亡效应器caspase的级联反应;6、细胞色素C的定位检测细胞色素C作为一种信号物质,在细胞凋亡中发挥着重要的作用;正常情况下,它存在于线粒体内膜和外膜之间的腔中,凋亡信号刺激使其从线粒体释放至细胞浆,结合Apaf-1 apoptotic protease activating factor-1后启动caspase级联反应：细胞色素C/Apaf-1复合物激活caspase-9,后者再激活caspase-3和其它下游caspase; 7、线粒体膜电位变化的检测：1线粒体跨膜电位的耗散与细胞凋亡有密切关系2近年来陆续有报道说明线粒体跨膜电位的耗散早于核酸酶的激活,也早于磷酯酰丝氨酸暴露于细胞表面;而一旦线粒体跨膜电位耗散,细胞就会进入不可逆的凋亡过程;3在细胞凋亡过程中线粒体跨膜电位的耗散主要是由于线粒体内膜的通透性转变,这是由于生成了动态的由多个蛋白质组成的位于线粒体内膜与外膜接触位点的通透性转变孔道PT孔道能稳定线粒体跨膜电位就能防止细胞凋亡;线粒体在细胞凋亡作用中的进一步证据：1若将纯化的正常的线粒体与纯化的细胞核在一起保温,并不导致细胞核的变化;但若将诱导生成PT 孔道的线粒体与纯化的细胞核一同保温,细胞核即开始凋亡变化;2形态学观察,看到细胞数目有限,统计学上的准确性受影响；3凝胶电泳检测DNA破坏了细胞的完整性也不能测出凋亡细胞占总细胞的比例；4流式细胞术可检测细胞、亚细胞及分子水平的特征性变化;用于流式细胞仪检测的染料：PI、Hoechst、EB、DAPI、丫啶橙等,其中PI、Hoechst 最常用;PI和Hoechst33342双标：PI、Hoechst33342均可与细胞核DNA或RNA结合;但是PI不能通过正常的细胞膜,Hoechst则为膜通透性的荧光染料,故细胞在处于坏死或晚期调亡时细胞膜被破坏,这时可为PI着红色;正常细胞和中早期调亡细胞均可被Hoechst着色,但是正常细胞核的Hoechst着色的形态呈圆形,淡兰色,内有较深的兰色颗粒；而调亡细胞的核由于浓集而呈亮兰色,或核呈分叶,碎片状,边集; 故PI着色为坏死细胞；亮兰色,或核呈分叶状,边集的Hoechst着色的为调亡细胞;PI和Annexin-V双标：磷脂酰丝氨酸PS正常位于细胞膜的内侧,但在细胞凋亡的早期或细胞损伤时PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面,暴露在细胞外环境中; Annexin-Vgreen可以和磷脂酰丝氨酸PS特异性结合;因此细胞处于调亡或坏死时,Annexin-V可为阳性早期的坏死细胞可能为阴性;但是只有坏死的细胞PI是阳性五、形态学观察1、普通光学显微镜观察2、透射电子显微镜观察3、荧光显微镜观察1、普通光镜下观察：1用苏木素-伊红HE染色：细胞核固缩碎裂、呈蓝黑色、胞浆呈淡红色凋亡细胞,正常细胞核呈均匀淡蓝色或蓝色,坏死细胞核呈很淡的蓝色或蓝色消失2Giemsa染色法、瑞氏染色法等,正常细胞核的色泽均一,凋亡细胞染色变深,坏死细胞染色浅或没染上颜色直接用倒置显微镜观察：1细胞体积变小,全面皱缩；2凋亡小体为数个圆形小体围绕在细胞周围;2、透射电子显微镜观察凋亡细胞体积变小,细胞质浓缩;细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状或呈折缝样,部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体;3、荧光显微镜常用的荧光染料：丫啶橙、PI 、DAPI、Hoechst33258 和Hoechst33342、EB等Hoechst 33342、Hoechst 33258、DAPI三种染料与DNA的结合是非嵌入式的,主要结合在DNA的A-T碱基区;紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光;1PI双染色法基本原理Hoechst是与DNA特异结合的活性染料,能进入正常细胞膜而对细胞没有太大得细胞毒作用;Hoechst 33342在凋亡细胞中的荧光强度要比正常细胞中要高;DAPI为半通透性,用于常规固定细胞的染色;碘化丙啶PI是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,但在凋亡中晚期的细胞和死细胞,PI能够透过细胞膜而将细胞核染红;因此将Annexin-V与PI匹配使用,就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来;注意事项：细胞凋亡时,其DNA可染性降低被认为是凋亡细胞的标志之一,但这种DNA可染性降低也可能是因为DNA含量的降低,或者是因为DNA结构的改变使其与染料结合的能力发生改变所致;在分析结果时应该注意;六、细胞凋亡的分子生物学检测方法:细胞凋亡中染色体DNA的断裂是个渐进的分阶段的过程,染色体DNA首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300kb的大片段;然后大约30 ﹪的染色体DNA在Ca ²+和Mg²+依赖的核酸内切酶作用下,在核小体单位之间被随机切断,形成180～200bp核小体DNA多聚体;DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3’-OH末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶TdT的作用下,将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3’-末端,从而可进行凋亡细胞的检测,这类方法一般称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法TUNEL;由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂,因而没有3’-OH形成,很少能够被染色;低分子量的DNA分离后,也可使用DNA聚合酶进行缺口翻译nick translation,使低分子量的DNA标记或染色,然后分析凋亡细胞;TUNEL或缺口翻译法实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法,对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色,能准确的反应细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征,可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞凋亡测定,并可检测出极少量的凋亡细胞,灵敏度远比一般的组织化学和生物化学测定法要高,因而在细胞凋亡的研究中已被广泛采用;过氧化物酶标记测定法原理：脱氧核糖核苷酸衍生物地高辛digoxigenin-11-dUTP在TdT酶的作用下,可以掺入到凋亡细胞双链或单链DNA的3-OH末端,与dATP形成异多聚体,并可与连接了报告酶过氧化物酶或碱性磷酸酶的抗地高辛抗体结合;在适合底物存在下,过氧化物酶可产生很强的颜色反应,特异准确的定位出正在凋亡的细胞,因而可在普通光学显微镜下进行观察;毛地黄植物是地高辛的唯一来源;在所有动物组织中几乎不存在能与抗地高辛杭体结合的配体,因而非特异性反应很低;抗地高辛的特异性抗体与脊椎动物甾体激素的交叉反应不到1％,若此抗体的Fc部分通过蛋白酶水解的方法除去后,则可完全排除细胞Fc受体非特异性的吸附作用;本方法可以用于福尔马林固定的石蜡包埋的组织切片、冰冻切片和培养的或从组织中分离的细胞凋亡测定;一试剂配制1、磷酸缓冲液PBS：磷酸钠盐50mM,NaCl 200mM;2、蛋白酶K200μg/ml,：蛋白酶K 0.02g；PBS 100ml;3、含2%H2O2的PBS缓冲液：H2O2 ；PBS缓冲液;4、TdT酶缓冲液新鲜配：Trlzma碱3.63g用HCl调节pH至,加ddH2O定容到1000ml；再加入二甲砷酸钠29．96g和氯化钴0.238g;5、TdT酶反应液：TdT酶32μl；TdT酶缓冲液76μl,混匀,置于冰上备用;6、洗涤与终止反应缓冲液：氯化钠17. 4g；柠檬酸钠8.82g；ddH2O 1000ml7、％二氨基联苯DAB溶液：DAB 5mg；PBS 10ml,, 临用前过滤后,加过氧化氢至%;8、％甲基绿：甲基绿0.5g；0.1M乙酸钠100ml;9、100％丁醇,100％、95％、90％、80％和70％乙醇,二甲苯,10％中性甲醛溶液,乙酸,松香水等;10、过氧化物酶标记的抗地高辛抗体ONCOR二实验步骤1、标本预处理：1石蜡包埋的组织切片预处理：将组织切片置于染色缸中,用二甲苯洗两次,每次5min;用无水乙醇洗两次,每次3min;用95％和75％乙醇各洗一次,每次3min;用PBS洗5min 加入蛋白酶K溶液20ug／ml,于室温水解15min,去除组织蛋白;用蒸馏水洗4次,每次2min,然后按下述步骤2进行操作;2冰冻组织切片预处理：将冰冻组织切片置10％中性甲醛中,于室温固定10min后,去除多余液体;用PBS洗两次,每次5min;置乙醇：乙酸2：1的溶液中,于-20℃处理5min,去除多余液体;用PBS洗两次,每次5min,然后按下述步骤2进行操作;3培养的或从组织分离的细胞的预处理：将约5 × 107个/ml细胞于4％中性甲醛室温中固定10min;在载玻片上滴加50～100μl细胞悬液并使之干燥;用PBS洗两次,每次5min,然后按下述步骤2进行操作;2、色缸中加入含2％过氧化氢的PBS,于室温反应5min;用PBS洗两次,每次5min;3、用滤纸小心吸去载玻片上组织周围的多余液体,立即在切片上加2滴TdT酶缓冲液,置室温1～5min;4、用滤纸小心吸去切片周围的多余液体,立即在切片上滴加54μl TdT酶反应液,置湿盒中于37C反应1hr注意：阴性染色对照,加不含TdT酶的反应液;5、将切片置于染色缸中,加入已预热到37℃的洗涤与终止反应缓冲液,于37℃保温30min,每10min将载玻片轻轻提起和放下一次,使液体轻微搅动;6、组织切片用PBS洗3次,每次5min后,直接在切片上滴加两滴过氧化物酶标记的抗地高辛抗体,于湿盒中室温反应30min;7、用PBS洗4次,每次5min;8、在组织切片上直接滴加新鲜配制的％DAB溶液,室温显色3～6min;9、用蒸馏水洗4次,前3次每次1min,最后1次5min;10、于室温用甲基绿进行复染10min;用蒸馏水洗3次,前两次将载玻片提起放下10次,最后1次静置30s;依同样方法再用100％正丁醇洗三次;11、用二甲苯脱水3次,每次2min,封片、干燥后,在光学显微镜下观察并记录实验结果;三注意事项一定要设立阳性和阴性细胞对照;阳性对照的切片可使用DNaseI部分降解的标本,阳性细胞对照可使用地塞米松1μM处理3-4hr的大、小鼠胸腺细胞或人外周血淋巴细胞;阴性对照不加TdT酶,其余步骤与实验组相同;一、吖啶橙简称AO荧光染色法原理：吖啶橙Acridine Orange是吖啶的衍生物之一;它是一种荧光染料,激发峰492nm,荧光发射峰530nmDNA,640nmRNA,它与双链DNA的结合方式是嵌入双链之间,而与单链DNA和RNA则由静电吸引堆积在其磷酸根上;在蓝光给502nm激发下,细胞核发亮绿色荧光约530nm,核仁和胞质RNA发桔红色荧光＞580nm;吖啶橙的阳离子也可以结合在蛋白质、多糖和膜上而发荧光,但细胞固定阻抑了这种结合,从而主要显示DNA、RNA两种核酸;1试剂AO贮备液：AO 50mg分析纯蒸馏水 50ml4℃冰箱保存4个月;Tris缓冲液：Tris 50mmol/LMgCl2 LKCl 25mmol/LAO工作液：将AO贮备液10:1用蒸馏水稀释,再用Tris缓冲液将AO稀释到μg/ml的终浓度;2操作步骤①取乙醇固定的细胞悬液,浓度为107/ml,1500r/min,5分钟,弃乙醇;②加入2ml AO工作液,室温染10分钟;③滴在载玻片上,加缓冲甘油封片;④在荧光显微镜下用吸收波长405nm,发射波长530-640nm观察;结果：活细胞核呈黄绿色荧光,胞质呈红色荧光;凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧,可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体;二、Hoechst33258染色Hoechst33258为特异性DNA染料,,与A-T键结合,但在环境下则优先与RNA 结合,染色DNA时应调整染液的pH至,这种染料不溶于磷酸缓冲液；所以配制时必须先以蒸馏水溶解配成储存液在4℃中避光保存;本方法是用于培养细胞、细胞涂片或细胞甩片;试剂及配制1Hoechst33258贮存液：称取Hoechst33258试剂1mg,用20ml蒸馏水溶解后,滤过,4℃避光保存;用时蒸馏水10倍稀释成染色液;2 ,;3封片液：20mmol/L柠檬酸,50mmol/L 磷酸氢二钠,50%甘油;4细胞固定液：甲醇/冰乙酸3:1,现配;操作方法1原代细胞培养、细胞学涂片或细胞甩片机制制备的单细胞片;2细胞固定液4℃固定5min;3蒸馏水稍洗后,点加Hoechst33258染色液,10min;4蒸馏水洗片后,用滤纸沾去多余液体;5封片剂封片后荧光显微镜观察;结果：在荧光显微镜下,活细胞核呈弥散、均匀荧光,坏死细胞不被Hoechst 染色;出现细胞凋亡时,细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒块状蓝色荧光及明显核形态变化,如果见到3个或3个以上的DNA荧光碎片被认为是凋亡细胞;三、甲基绿-派诺宁染色法一原理细胞凋亡和细胞坏死均可表现为细胞核固缩等细胞死亡形态,但两者发生机制不同;细胞凋亡是一种细胞主动死亡过程,需要有细胞内蛋白酶的激活,细胞质内常有mRNA表达的增强;而细胞坏死是一种被动的细胞死亡过程,细胞质内常有RNA的损失;根据这一特点,可应用试剂甲基绿对DNA染色的特异性和派诺宁对RNA的亲和性,使甲基绿对固缩细胞核内的脱氧核糖核酸着染,如果细胞质内核糖核酸呈派诺宁阳性染色者为凋亡细胞,呈阴性染色者为坏死细胞;二试剂及配制1. 组织固定液无水乙醇 600ml氯仿 300ml冰醋酸 100ml2.甲基绿纯化新购买的甲基绿需用氯仿进行纯化处理以去除甲基紫;方法是将2％甲基绿水溶液20ml倾入洁净分液漏斗,加入氯仿20ml充分,使其内的甲基溶于氯仿中而呈紫红色;旋动分液漏斗下部的砂塞,慢慢把下沉带比红色的氯仿移去,再加入新的氯仿10ml,如此反复更换氯仿,直到无紫红色为止;该液作为贮存液,4℃保存;3.染色液甲基绿贮存液 5ml5%派诺宁水溶液 1ml蒸馏水 12mlL乙酸钠 18ml临用前配制,滤纸过滤;三操作方法1.新鲜取材组织置固定液中4℃固定3-6h或培养细胞、细胞学甩片固定10min;2.直接转入95%乙醇脱水和无水乙醇脱水,二甲苯透明,石蜡包埋;3.切片经二甲苯脱蜡,梯度乙醇水化至蒸馏水;细胞学涂片不用梯度酒精4.置染色液中室温下染色约1h;5.取出切片,不经水洗,用滤纸吸干多余染液;6.插入丙酮中迅速分化;7.转入丙酮二甲苯1:1稍洗;8.二甲苯透明2-3次;9.中性树胶封固;四结果光学显微镜下凋亡细胞固缩,细胞核呈绿色或绿蓝色着染,胞质呈红紫色着染,坏死细胞只有固缩细胞核呈绿色着染;观察时可用凋亡指数进行计数,即随机选择约10-20个视野每张切片约1000-2500个细胞,计数凋亡细胞百分率;四、TdT介导的dUTP缺口末端标记技术TUNEL原理：在机体内部随时都在发生着细胞的死亡;传统上用显微镜来观察细胞的死亡,其特征为核染色质的浓缩及碎片的形成;但是这种现象出现的很晚,时间也很短暂;凋亡的特征是内源性核酸内切酶被激活,细胞自身的染色质或DNA被切割,出现单链或双链缺口,并产生与DNA断点数目相同的3ˉ-OH 末端;末端脱氧核糖核酸转移酶Terminal deoxynucleotidyl Transferase TdT可以将地高辛标记的dUTPDIG-dUTP标记至3’-OH末端,DIG-dUTP核苷酸结合在DNA断点部位,可以通过生物标记的抗地高辛抗体Anti-DIG-Biotin反应后,再结合链酶亲和素-过氧化物酶SABC,然后加入显色底物DAB予以显示;凋亡的细胞核呈棕黄色,从而可以在显微镜下观察到着色的凋亡细胞;试剂1.标记缓冲液Labeling Buffer5×浓度的TdT反应缓冲液,含有以下成分：500mmol/L二甲胂酸钾;10mmol/L CoCl2 氯化钴1mmol/L DTT二硫苏糖醇2.末端脱氧核糖核酸转移酶TdT,×20×204.封闭液Blocking Reagent5.生物素化抗地高辛抗体×100×100×2008.抗体稀释液9. 多聚赖氨酸或APES;10. 0.01M TBS,配法：1L双蒸馏水中加入8.5克氯化钠,1.2克Tris和纯乙酸;11. DAB显色试剂;操作步骤1.样品处理1玻片预先用多聚赖氨酸或APES进行处理;2细胞涂片和冰冻切片：最重要的是及时固定;用4%多聚甲醛/0.01M PBS室温下固定30-60分钟;0.01M PBS洗2分钟×2次;蒸馏水洗涤2分钟×2次; 3组织：有条件时应及时固定;常规4%多聚甲醛/0.01M PBS或10%中性缓冲福尔马林固定4小时以上,石蜡包埋;切片常规脱蜡入水脱蜡务必干净;2.新鲜配制3%H2O2,室温处理10分钟;蒸馏水洗涤2分钟×3次;3.标本片加0.01M TBS1:200新鲜稀释Proteinase K37℃消化5-15分钟,0.01M TBS洗2分钟×3次;细胞涂片和冰冻切片一般不消化或消化10-60秒钟;新鲜石蜡切片消化5-10分钟;陈旧石蜡切片消化10-30分钟;4.标本片加标记缓冲液Labeling Buffer20μl/片,以保持切片湿润;按每张切片取TdT和DIG-d-UTP各1μl,加入18μl标记缓冲液中,混匀;甩去切片上多余液体后加标记液,20μl/片;置样品于湿盒中,37℃标记2小时;5.0.01M TBS洗2分钟×3次;6.加封闭液50μl/片,室温30分钟,甩掉封闭液,不洗;7.用抗体稀释液1:100稀释生物素化抗地高辛抗体：取1ml抗体稀释液加生物素化抗地高辛抗体10μl,混匀后50μl/片加至标本片上;置样品于湿盒中,37℃反应30分钟;0.01M TBS洗2分钟×3次;8.用抗体稀释液1:100稀释SABC：取1ml抗体稀释液加SABC10μl,混匀后50μl/片加至切片;37℃反应30分钟;0.01M TBS洗5分钟×4次;显色;10.苏木素轻度复染;脱水,透明,封片;显微镜观察;结果判定细胞核固缩有的呈碎片状,不规则,大小不一致,呈棕黄色颗粒者为阳性细胞; 即凋亡的细胞TUNEL改良方法在细胞凋亡检测中的应用.0M枸橼酸盐缓冲液、通透液%Triton-100、枸橼酸钠、标记缓冲液：二甲胂酸钠100mmol/L标记、二巯基苏糖醇L,氯化钴coci;TdT反应液；标记缓冲液中加TdT酶100U/ml,biotin-dUTP；链霉菌素标记的辣根过氧化物酶,蛋白酶K20μg/ml;显色剂氨乙基咔唑amino ethyl carbazole,AEC的配制AEC 20mg二甲酰胺DMF0.05M醋酸缓冲液 50ml%H2O2实验步骤1切片用冷风吹干后为防止冰冻切片脱片用1%火棉胶封片1分钟,PBS漂洗3×5分钟；23%H2O2阻断10分钟后PBS洗3×5分钟；3组织切片浸泡于盛有L枸橼酸盐缓冲液的烧杯中,置于微波炉内,在650W,辐射时间15min的条件下进行组织处理;冷却至室温;4放在通透液%Triton -100溶于%枸橼酸钠溶液中室温20分钟,PBS漂洗3×5分钟；5滴加50μl TdT反应液37℃1h,PBS漂洗3×5分钟；6滴加50μl biotin-dUTP,反应液37℃1h,PBS漂洗3×5分钟；7滴加50μl链霉菌标记辣根过氧化物酶液37℃孵育30分钟,8PBS漂洗3×5分钟, AEC-H2O2显色10-15分钟,苏木素复染用1%的酸性水分化,水洗、水溶性封片;阳性对照dTd 反应前用20μg/ml蛋白酶K处理切片;阴性对照用PBS代替dTd反应液; 结果判断及标准改良的方法：凋亡细胞核呈红色固缩,有白边集或碎列,细胞膜皱褶,有的卷曲和出泡,在计数时避开坏死区域,以避免假阳性;计数500个细胞中的凋亡细胞数目,得出凋亡百分率;凋亡染色分度如下：每个高倍视野平均1-3个为Ⅰ级；3-6个为Ⅱ级；6-10个为Ⅲ级；>10个者为IV级;阳性对照：经在dTd反应认前用20μg/ml蛋白酶,处理切片30分钟的切片同改良方法基本相同,但红色较浅;阴性对照：切片无棕色反应;评价正常的或正在增殖的细胞没有DNA的断裂,没有3’-OH末端被标记,因此镜下无显色的物质;这种分子生物学与形态学相结合的方法,可以对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行标记,准确反应细胞凋亡最典型的生物化学与形态学特征,灵敏度远远高于一般的组织化学和生物化学方法;在检测过程中,可设阴性对照不加TdT阳性对照已知的阳性标本;注意:AEC孵育切片,反应产物为红色;可用苏木精对衬染色,反应产物是纯酒精溶性的,因此;可用酸性水溶液分化,然后用水溶性封固剂封片;五、凋亡细胞：凝胶电泳检测前已提及凋亡细胞的突出特征是由于内源性核酸内切酶的激活而导致细胞核DNA的断裂;典型的细胞凋亡,在核内形成大量200bp大小及其倍体的核苷酸片段,而非典型的凋亡细胞,由于核内的DNA降解不完全,仅形成300~50kb的DNA大片;利用这一特性,可通过DNA凝胶电泳来判定凋亡的发生和发展情况;试剂1. PBS缓冲液2. 消化液的配制：100mmol/L NaCl10mmol/L Tris-HCL25mmol/L EDTA%SDSml蛋白酶K3. 酚：氯仿：异戊醇混合液按25:24:1比例配制;4. 氯仿：异戊醇混合液按24:1比例配制;5. 醋酸铵,L;6. 100%和70%的乙醇;7. TE 缓冲液：100mmol/L Tris-HCL,5mmol/L EDTA;8. TBE缓冲液;9. 电泳仪;。

竭诚为您提供优质文档/双击可除细胞凋亡实验报告篇一：实验14细胞凋亡的诱导和检测实验14细胞凋亡的诱导和检测20世纪60年代人们注意到细胞存在着两种不同形式的死亡方式：凋亡（apoptosis）和坏死（necrosis）。

细胞坏死指病理情况下细胞的意外死亡，坏死过程细胞膜通透性增高，细胞肿胀，核碎裂，继而溶酶体、细胞膜破坏，细胞内容物溢出，细胞坏死常引起炎症反应。

细胞凋亡apoptosis一词来源于古希腊语，意思是花瓣或树叶凋落，意味着生命走到了尽头，细胞到了一定时期会像树叶那样自然死亡。

凋亡是细胞在一定生理或病理条件下遵守自身程序的主动死亡过程。

凋亡时细胞皱缩，表面微绒毛消失，染色质凝集并呈新月形或块状靠近核膜边缘，继而核裂解，由细胞膜包裹着核碎片或其他细胞器形成小球状凋亡小体凸出于细胞表面，最后凋亡小体脱落被吞噬细胞或邻周细胞吞噬。

凋亡过程中溶酶体及细胞膜保持完整，不引起炎症反应。

细胞凋亡时的生化变化特征是核酸内切酶被激活，染色体DnA被降解，断裂为50～300kb长的DnA片段，再进一步断裂成180～200bp整倍数的寡核苷酸片断，在琼脂糖凝胶电泳上呈现“梯状”电泳图谱(DnALadder)。

细胞凋亡在个体正常发育、紫稳态维持、免疫耐受形成、肿瘤监控和抵御各种外界因素干扰等方面都起着关键性的作用。

1．细胞凋亡的检测方法凋亡细胞具有一些列不同于坏死细胞的形态特征和生化特征，据此可以鉴别细胞的死亡形式。

细胞凋亡的机制十分复杂，一般采用多种方法综合加以判断，同时不同类型细胞的凋亡分析方法有所不同，方法选择依赖于具体的研究体系和研究目的（表？）。

表凋亡的检测方法（引自DL斯佩克特等，20XX）形态学观察方法：利用各种染色法可观察到凋亡细胞的各种形态学特征：（1）DApI时常用的一种与DnA结合的荧光染料。

借助于DApI染色，可以观察细胞核的形态变化。

（2）giemsa染色法可以观察到染色质固缩、趋边、凋亡小体形成等形态。

细胞凋亡检测方法和实验标准常用的细胞凋亡检测方法1. DNA片段化检测DNA片段化是细胞凋亡的一个明显特征。

常用的DNA片段化检测方法包括：- 凝胶电泳：将凋亡细胞的DNA提取出来，通过凝胶电泳可以观察到DNA片段化的特征。

- TUNEL（末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP接头标记）：使用TUNEL试剂可以标记凋亡细胞的DNA断裂端，通过显微镜观察可以检测到凋亡细胞的存在。

2. 细胞色素c释放检测细胞凋亡时，线粒体内的细胞色素c会释放出来。

常用的细胞色素c释放检测方法包括：- 免疫荧光染色：使用特定抗体标记细胞色素c，通过荧光显微镜观察可以检测到细胞色素c的释放情况。

- Western blotting：使用特定抗体检测细胞色素c的蛋白表达水平，可以间接判断细胞色素c的释放。

3. 细胞内和细胞外凋亡标志物检测细胞凋亡过程中会产生一些特定的标志物，可以用于凋亡检测。

常用的细胞内和细胞外凋亡标志物包括：- 单克隆抗体检测：使用特定抗体识别和检测细胞内和细胞外的凋亡相关标志物，如凋亡相关蛋白、凋亡相关受体等。

- 酶标记法：利用特定的酶标记物标记凋亡相关标志物，通过酶标仪测量酶的活性来判断凋亡的发生。

实验标准为了保证细胞凋亡检测的可靠性和精确性，在进行实验时应遵守以下标准：1. 样本准备：样本的准备应严格遵循实验方案，包括细胞培养、药物处理、提取样本等步骤。

同时，应采用质量控制措施，确保样本的一致性和可比性。

2. 试剂选择：选择具有高灵敏度和特异性的试剂，确保能够准确检测细胞凋亡的发生。

3. 方法验证：在进行细胞凋亡检测之前，应先进行方法验证和优化，确保所选择的方法可以准确、可重复地检测细胞凋亡。

4. 阳性和阴性对照：在每个实验中都应包括阳性和阴性对照，以确认实验结果的准确性和可靠性。

5. 数据分析：对实验结果进行准确的数据分析和统计处理，确保结果的可解释性和可靠性。

6. 结果报告：结果应准确、清晰地呈现，包括实验方法、样本信息、数据分析和统计结果等信息。

细胞凋亡检测方法中的技术注意事项细胞凋亡是一种重要的细胞死亡方式，对于生物体的发育、组织修复和免疫调节具有重要作用。

因此，准确、可靠地检测细胞凋亡是细胞生物学和医学研究中的关键问题之一。

本文将探讨细胞凋亡检测方法中的技术注意事项。

首先，选择合适的细胞凋亡检测方法至关重要。

目前常用的细胞凋亡检测方法包括荧光染料法、DNA断裂法、细胞膜破裂法等。

在选择方法时，需要根据实验目的、细胞类型和实验条件等因素进行综合考虑。

例如，如果需要定量分析细胞凋亡率，荧光染料法是一个较好的选择；如果需要观察细胞凋亡的形态学变化，DNA断裂法可以提供更直观的结果。

此外，还需要注意染料的选择，一些染料对于不同细胞类型有不同的亲和性，因此需要根据实验需求选择合适的染料。

其次，合理设计实验方案是确保细胞凋亡检测结果可靠的关键。

在实验设计中，需要考虑到实验组和对照组的设置，以及相应的实验条件控制。

对于细胞凋亡检测来说，对照组通常包括阳性对照和阴性对照。

阳性对照是指已知存在细胞凋亡的样本，用于验证实验方法的可行性和敏感性；阴性对照是指不存在细胞凋亡的样本，用于排除假阳性结果。

此外，实验条件的控制也非常重要，包括培养基的配方、温度、湿度、CO2浓度等因素，这些因素都可能对细胞凋亡的检测结果产生影响。

第三，注意样本处理过程中的技术细节。

细胞凋亡检测的样本处理过程包括细胞的收集、固定和染色等步骤。

在细胞收集过程中，需要注意避免细胞凋亡的人为干扰，例如避免机械刺激、避免长时间暴露在室温下等。

在细胞固定和染色过程中，需要选择合适的固定剂和染料，并严格按照说明书的操作步骤进行操作。

此外，还需要注意染色的时间和温度控制，以避免过度染色或染色不充分导致的结果误差。

最后，数据分析和结果解读也是细胞凋亡检测中需要注意的关键环节。

在数据分析时，需要选择合适的统计方法，并根据实验设计进行数据的处理和比较。

对于定量分析结果，可以使用均值±标准差或均值±标准误等方式进行表示。

一、实验背景细胞凋亡，又称程序性细胞死亡，是一种由基因调控的细胞自主性死亡过程。

细胞凋亡在生物体的发育、免疫、代谢等生理过程中具有重要作用。

近年来，细胞凋亡与多种疾病的发生、发展及治疗密切相关，因此，研究细胞凋亡的机制具有重要意义。

本实验旨在通过检测细胞凋亡相关指标，探讨细胞凋亡在特定细胞类型中的作用。

二、实验材料与试剂1. 细胞：实验用细胞为正常细胞系A和肿瘤细胞系B。

2. 试剂：Annexin V-FITC/PI双染试剂盒、RNA提取试剂盒、PCR试剂盒、DNA提取试剂盒、Trizol试剂、DEPC水、无血清培养基、胎牛血清、胰蛋白酶等。

三、实验方法1. 细胞培养：将正常细胞系A和肿瘤细胞系B分别接种于培养瓶中，置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。

2. 细胞凋亡检测：将正常细胞系A和肿瘤细胞系B分别分为实验组和对照组。

实验组加入凋亡诱导剂，对照组加入等量无血清培养基。

培养一定时间后，按照Annexin V-FITC/PI双染试剂盒说明书进行细胞凋亡检测。

3. RNA提取：将实验组和对照组细胞收集于离心管中，按照RNA提取试剂盒说明书提取细胞总RNA。

4. PCR检测：将提取的RNA进行逆转录，得到cDNA。

以cDNA为模板，进行凋亡相关基因的PCR扩增。

5. DNA提取：将实验组和对照组细胞收集于离心管中，按照DNA提取试剂盒说明书提取细胞DNA。

6.琼脂糖凝胶电泳：将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察条带。

四、实验结果1. 细胞凋亡检测：实验组细胞凋亡率显著高于对照组（P<0.05），说明凋亡诱导剂成功诱导细胞凋亡。

2. RNA提取：成功提取实验组和对照组细胞总RNA。

3. PCR检测：实验组凋亡相关基因表达水平显著高于对照组（P<0.05），说明凋亡诱导剂上调凋亡相关基因表达。

4. 琼脂糖凝胶电泳：实验组凋亡相关基因PCR产物条带较对照组明显，说明凋亡相关基因在实验组中表达上调。

流式细胞仪检测细胞凋亡实验步骤流式细胞仪是一种用于检测和分析细胞的仪器，可以通过测量细胞的荧光和散射特性来了解细胞的生理状态和功能。

在细胞生物学研究中，流式细胞仪广泛应用于细胞凋亡实验。

细胞凋亡是一种重要的细胞程序性死亡方式，正常情况下是一种维持生态平衡的重要机制，而在疾病发生时，细胞凋亡的失控会导致一系列疾病的发生。

因此，对细胞凋亡的检测和研究具有重要意义。

本文将介绍流式细胞仪检测细胞凋亡的实验步骤。

实验材料和仪器流式细胞仪细胞培养物凋亡诱导剂PBS缓冲液1×绑定缓冲液1×洗涤缓冲液荧光标记的抗体PI（胰岛素脱羧酶）Annexin V-FITC套装实验步骤1.细胞处理首先，将培养好的细胞分到不同的培养皿中，添加凋亡诱导剂，以诱导细胞凋亡。

凋亡诱导剂的种类和浓度应根据实验的需要来确定。

通常可选择小分子化合物、放射线等方式来诱导细胞凋亡。

2.收集细胞处理好的细胞经过一定时间的培养后，使用离心机将细胞沉淀下来，并用PBS缓冲液洗涤细胞，以去除培养基和凋亡诱导剂等杂质。

然后使用1×绑定缓冲液将细胞重悬。

3.细胞计数将细胞悬液加入细胞计数板中，用显微镜或自动细胞计数器计算细胞密度，并将细胞密度调整到合适的浓度。

4.细胞染色将调整好浓度的细胞悬液分到不同的离心管中，添加荧光标记的抗体和PI荧光染料。

荧光标记的抗体通常选择Annexin V-FITC，它可以与凋亡细胞膜表面磷脂酰丝氨酸结合，从而可以用于检测凋亡细胞；PI荧光染料用于检测坏死细胞。

5.混匀和孵育将离心管中的细胞悬液混匀均匀，然后在室温下孵育一定时间，通常为15-30分钟。

期间可以轻轻摇晃管子以保证充分的染色反应。

6.流式细胞仪检测染色反应结束后，将细胞悬液加入流式细胞仪的样品管中，通过流式细胞仪的激光和光电探测器，可以分辨出细胞的荧光和散射信号，从而获得细胞凋亡的信息。

使用流式细胞仪之前需要对仪器进行标定和调试，以确保获得准确和可靠的数据。

细胞凋亡检测(Annexin-V-FITC 单染法)(Assay of CellApoptosis)2010-05-25 20:06:41 来源：易生物实验浏览次数：197 网友评论0 条细胞凋亡或称程序性细胞死亡（Programmed Cell Death ,PCD）是细胞的生命现象之一，它在机体的胚胎发育、组织修复及自身反应性T淋巴细胞的清除等方面起着十分重要的作用。

细胞凋亡调节的失控可导致临床各种疾病的发生。

如老年性痴呆与神经细胞凋亡过度有关，自身免疫性疾病和肿瘤与细胞凋亡的抑制有关。

细胞凋亡有别于细胞坏死，它有一系列的细胞形态学和生物化学的改变，包括出现染色质浓缩、DNA降解、凋亡小体形成等。

关键词：细胞检测单染法细胞凋亡检测Annexin-V-FITCAssayCellApoptosis一、实验原理细胞凋亡或称程序性细胞死亡（Programmed Cell Death ,PCD）是细胞的生命现象之一，它在机体的胚胎发育、组织修复及自身反应性T淋巴细胞的清除等方面起着十分重要的作用。

细胞凋亡调节的失控可导致临床各种疾病的发生。

如老年性痴呆与神经细胞凋亡过度有关，自身免疫性疾病和肿瘤与细胞凋亡的抑制有关。

细胞凋亡有别于细胞坏死，它有一系列的细胞形态学和生物化学的改变，包括出现染色质浓缩、DNA降解、凋亡小体形成等。

在正常的活细胞，磷脂酰丝氨酸（phosphotidylserine，PS）位于细胞膜的内侧，但在凋亡的细胞，PS 从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。

Annexin-Ⅴ（膜联蛋白-V）是一种分子量为35-36KD的Ca2+ 依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合。

因此将Annexin-Ⅴ进行荧光素（如FITC、PE）或生物素（Biotin）标记，以标记了的Annexin-Ⅴ作为探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。

二、实验仪器和材料Annexin V-FITC（膜联蛋白-V-FITC）500μl/250μl 20μg/ml标记缓冲液（Binding Buffe）r 40/20 mlPBS（1×）60/30 ml20μl , 200μl , and 1000μl 移液器和吸头微量离心管可调速离心机载玻片（用于荧光显微镜观察）盖玻片（用于荧光显微镜观察）去离子水冰块流式细胞仪或荧光显微镜三、实验方法1．凋亡细胞的制备：小鼠腹腔注射地塞米松25mg/kg体重，10h后解剖取胸腺，分离胸腺细胞。

一、前言在细胞生物学和分子生物学研究中，western blot（蛋白免疫印迹）是一种常用的技术，用于检测特定蛋白质在细胞或组织中的表达水平。

其中，检测凋亡蛋白是western blot中的重要应用之一。

本文将介绍western blot检测细胞凋亡蛋白的原理，以帮助读者更深入地理解该技术的工作机制。

二、细胞凋亡概述1.细胞凋亡的概念细胞凋亡是一种程序性逝去过程，又称为细胞自我杀死，是机体内原有的一种生理性消亡方式。

在凋亡过程中，受损或老化的细胞通过一系列分子信号通路最终导致细胞逝去，而不会引起周围组织的炎症或损伤。

2.凋亡与细胞凋亡蛋白细胞凋亡是由一系列蛋白质调控的复杂过程，其中包括凋亡抑制蛋白和凋亡诱导蛋白。

检测这些蛋白的表达水平有助于了解细胞凋亡的调控机制和相关疾病的发生。

三、western blot的基本原理1.western blot的步骤western blot技术主要分为蛋白样本制备、SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白、转膜、免疫印迹和膜显色等步骤。

其中，免疫印迹是最关键的步骤，用于检测目标蛋白的存在和表达水平。

2.细胞凋亡蛋白的western blot检测通过western blot技术可以检测凋亡相关蛋白，如Bcl-2家族、caspase家族和PARP等蛋白的表达水平。

主要流程包括：a) 细胞裂解并提取蛋白样本b) SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白c) 将分离的蛋白转膜到聚丙烯酸膜上d) 使用特异性抗体结合目标蛋白e) 使用辅助抗体结合一定的酶标记物f) 基于酶标记物的光学信号检测蛋白带四、western blot检测细胞凋亡蛋白的原理1.选择特异性抗体western blot的关键是选择特异性抗体，以保证目标蛋白的特异性检测。

通常可以通过文献资料或商业抗体公司获取针对目标蛋白的特异性抗体。

2.抗原和抗体结合在免疫印迹过程中，特异性抗体与其结合的抗原蛋白发生反应形成复合物。

这一步骤是确保检测凋亡蛋白的关键步骤，需要保证抗体的特异性和蛋白的完整性。

凋亡流式检测步骤引言：凋亡流式检测是一种用于检测细胞凋亡的分析方法，通过检测细胞内凋亡标志物的变化来评估细胞是否处于凋亡状态。

本文将介绍凋亡流式检测的步骤，并详细解释每个步骤的操作原理和注意事项。

一、样本制备在进行凋亡流式检测之前，需要准备细胞样本。

首先，将需要检测的细胞分离并洗涤，去除外部污染物。

然后，将细胞悬浮液转移至离心管中，并进行离心，去除上清液。

最后，重新悬浮细胞并加入合适的缓冲液，使细胞适应流式细胞仪的操作条件。

二、细胞固定将悬浮的细胞样本进行固定，以保持细胞的形态和结构。

常用的固定方法包括用乙醇或甲醛进行固定。

将固定液加入细胞悬液中，充分混合后静置一段时间，使细胞得到固定。

三、膜破损为了使细胞内的凋亡标志物暴露在细胞外，需要对细胞进行膜破损。

常用的方法是使用洗脱缓冲液，将固定的细胞进行洗涤，去除固定液中的残留物质。

四、孔隙形成在凋亡流式检测中，需要使用荧光标记的抗体或荧光探针来检测凋亡标志物。

为了使这些荧光标记的物质能够进入细胞内，需要在细胞膜上形成孔隙。

孔隙形成的方法有多种，如使用洗脱缓冲液中的成分或特定的酶。

五、荧光标记在细胞凋亡检测中，常用的荧光标记物有PI、Annexin V等。

将荧光标记物添加到细胞悬液中，与凋亡标志物结合。

不同的荧光标记物对应不同的凋亡标志物，根据需要选择合适的标记物进行检测。

六、流式细胞仪检测将荧光标记过的细胞样本装入流式细胞仪，通过激光束的照射，荧光标记物会发出特定波长的荧光信号。

流式细胞仪会对这些荧光信号进行检测和记录，并生成相应的数据。

七、数据分析通过流式细胞仪检测得到的数据可以进行进一步的分析。

可以通过设置荧光信号的阈值来划分细胞的凋亡状态，将细胞分为未凋亡、早期凋亡和晚期凋亡三个亚群。

也可以通过计算荧光信号的强度来评估细胞凋亡的程度。

八、结果解读根据数据分析的结果，可以判断细胞样本中凋亡细胞的比例和凋亡程度。

通过与对照组的比较，可以进一步评估样本中的异常情况。

细胞凋亡调控实验报告一、实验目的细胞凋亡是一种由基因控制的细胞自主有序的死亡方式，对于维持生物体的正常生理功能和发育过程具有重要意义。

本实验旨在探究不同因素对细胞凋亡的调控作用，深入了解细胞凋亡的分子机制。

二、实验原理细胞凋亡的发生涉及一系列复杂的信号转导通路和分子事件。

其中，线粒体途径、死亡受体途径以及内质网应激途径是常见的细胞凋亡调控途径。

通过使用特定的试剂和检测方法，可以观察细胞形态的变化、检测凋亡相关蛋白的表达水平以及测定细胞内活性氧（ROS）的含量等，从而评估细胞凋亡的程度。

三、实验材料与方法（一）实验材料1、细胞株：选用人肝癌细胞株 HepG2。

2、主要试剂：Annexin VFITC/PI 凋亡检测试剂盒、细胞裂解液、蛋白酶抑制剂、BCA 蛋白定量试剂盒、抗体（如抗caspase-3、抗Bcl-2 等）、二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFHDA）、细胞培养基、胎牛血清等。

3、实验仪器：流式细胞仪、荧光显微镜、酶标仪、离心机、移液器等。

（二）实验方法1、细胞培养将 HepG2 细胞接种于培养瓶中，加入含 10%胎牛血清的培养基，置于 37°C、5% CO2 培养箱中培养。

待细胞融合度达到 80%左右时，进行传代培养。

2、药物处理将处于对数生长期的 HepG2 细胞分为不同的处理组，分别加入不同浓度的凋亡诱导剂（如紫杉醇、顺铂等），同时设置对照组（仅加入培养基）。

处理一定时间后，收集细胞进行后续检测。

3、细胞凋亡检测（1）形态学观察通过Hoechst 33258 染色，在荧光显微镜下观察细胞核的形态变化，判断细胞是否发生凋亡。

凋亡细胞的细胞核呈现浓缩、碎裂等典型的凋亡特征。

（2）Annexin VFITC/PI 双染法收集处理后的细胞，用 PBS 洗涤两次，然后加入 Annexin VFITC和 PI 染液，避光孵育 15 分钟。

使用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

4、凋亡相关蛋白检测（1）蛋白提取收集处理后的细胞，加入细胞裂解液和蛋白酶抑制剂，冰上裂解 30 分钟。