测定抗氧化的六种方法是

抗氧化物活性测定方法总结抗氧化物活性测定方法是通过对样品中的抗氧化物质含量和抗氧化活性进行定量分析，评估其对自由基的清除能力和抗氧化能力。

随着抗氧化研究的不断深入，测定方法也逐渐完善。

以下是对常见的抗氧化物活性测定方法的总结。

1. ORAC法（氧化应激反应活性测定法）：该方法通过测定样品清除自由基的能力来评估其抗氧化活性。

实验中，将样品与荧光试剂（如2,2'-azobis(2,4-dimethylvaleronitrile)）共同作用，观察其清除自由基的能力，并通过建立标准曲线计算样品的ORAC值。

2.DPPH法（1,1-二苯基-2-苦味基-苦味酸磷）：该方法是一种常用的快速测定抗氧化活性的方法。

实验中，将样品与DPPH稳定自由基共同作用，通过比色反应观察DPPH自由基被样品清除的程度，从而评估抗氧化活性。

3.ABTS法（2,2'-联氮双5-苯砜酸）：该方法通过ABTS离子自由基的生成和清除反应来测定样品的抗氧化活性。

实验中，ABTS与过氧化氢反应生成ABTS离子自由基，通过观察样品对其的清除能力来评估抗氧化活性。

4.FRAP法（亚铁离子还原能力）：该方法基于样品对人造抗坏血酸（Fe3+）的还原能力，通过测量还原后的Fe2+离子的生成量来评估抗氧化活性。

实验中，将样品与Fe3+离子反应生成Fe2+离子，通过比色反应来测定Fe2+的含量。

5. 碘标法（Iodine value）：该方法用于测定油脂、脂肪等样品的抗氧化活性。

实验中，将已知量的碘与样品中的不饱和化合物反应，在光反应下观察反应终点的颜色变化，并根据标准曲线计算样品的抗氧化活性。

6. 硝酸盐法（Nitrite method）：该方法用于测定样品中亚硝酸盐的含量，从而评估其抗氧化活性。

实验中，样品经过还原反应生成亚硝酸盐，然后与DANO（N-乙基-N-（2-苯基乙基）-对硝基苯胺）反应生成稳定的偶氮染料，通过比色测定反应终点的吸光度来计算样品中亚硝酸盐的含量。

抗氧化活性测定方法的比较人体衰老和多种疾病均与自由基有关，寻找天然抗氧化剂具有重要意义。

黄酮、多糖、多肽、酚类等生物活性成分均具有抗氧化活性，抗氧化活性的筛选方法可分为体外和体内2种测试体系。

体外：抗氧化活性可以用在特定条件下，样品对检测体系中自由基的清除能力、抗油脂过氧化能力及样品的还原能力、总抗氧化能力等来衡量和表征。

常用的方法有羟基自由基（·OH）清除能力法、1,1-二苯基苦基苯肼（DPPH法）、2,2-联氮基-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨盐（ABTS法）、超氧阴离子自由基法（O2-·）、邻苯三酚自氧化法、β-胡萝卜素漂白法、硫代巴比妥酸法、铁离子还原能力测定（FRAP法）、总酚测定法、ORAC法等方法。

体内：主要有DNA氧化损伤法、蛋白质氧化损伤法、线粒体氧化损伤法。

其中DPPH法和ABTS法操作较简单便捷，不需要特殊的检测设备，只在需固定时间下记下其紫外分光光度测量值后计算其自由基清除率，缺点是不同物质具有组成和结构的差异，与DPPH·、ABTS+·的反应速率不同，反应到达平衡的时间不同，将反应时间固定在某一值时，可能对抗氧化剂的抗氧化性评价带来错误的判断，且DPPH自由基会和其他自由基发生反应。

邻苯三酚自氧化法缺点是检测波长、缓冲液的组成及ｐＨ值、邻苯三酚浓度等关键测定条件存在着较大差异。

β-胡萝卜素漂白法的缺点是β-胡萝卜素本身有抗氧化活性，对样品活性的测定结果有影响。

FRAP法主要用于食品业，优点是简单易操作、可以重复，缺点是无法测定硫醇化合物的还原能力。

ORAC法是国际上通用的评价食品氧化的标准方法，缺点是仪器成分较复杂，检测成本较高。

目前普遍使用的体外抗氧化活性指标一般都采用分光光度法，使用分光光度计测量各种颜色成分含量的变化。

分光光度法操作较简单、便捷，不需要特殊的检测设备，只在需固定时间下记下其紫外-可见分光光度测量值后计算其活性大小，具有成本低、效率高、样品量少等优点。

抗氧化酶活性测定方法抗氧化酶是一类对抗氧化反应具有重要作用的酶。

其主要功能是清除体内的自由基，抑制过氧化物形成和脂质氧化反应，从而保护细胞免受氧化应激的伤害。

测定抗氧化酶活性有助于评估生物体内的氧化应激水平，为疾病的诊断和治疗提供重要的指导。

本文将介绍几种常见的抗氧化酶活性测定方法。

1.超氧化物歧化酶（SOD）活性测定方法：SOD能够催化超氧阴离子（O2-）的还原反应，将其转化为较为稳定的氧气和过氧化氢。

常见的SOD活性测定方法有：-标准醛缩法：根据SOD催化的还原反应，利用NBT（硝基蓝盐）和醛缩剂的变色反应来测定SOD活性。

-自动化测定法：利用包含其中一种还原物质和pH染料的较为稳定的底物，通过测定底物的氧化程度来确定SOD活性。

-XTT法和WST-1法：由于SOD具有还原型的性质，可以通过测定细胞培养基中的还原型琼脂糖（XTT）或水溶性四硝基噻唑盐（WST-1）的还原动力学来测定其活性。

2.过氧化氢酶（CAT）活性测定方法：CAT主要参与还原过氧化氢（H2O2），将其转化为氧和水。

常见的CAT活性测定方法有：-色素法：利用黄曲霉素作为还原剂，观察黄曲霉素的消费量来测定CAT活性。

-光度法：通过测定样品中H2O2浓度的下降程度来间接测定CAT活性。

-氧化还原电极法：通过测定样品中H2O2浓度的下降速度来测定CAT活性。

3.过氧化物酶（POD）活性测定方法：POD主要参与氧气与还原型供体之间的氧化还原反应，转化为过氧化物（ROO-）。

常见的POD活性测定方法有：-色谱法：利用酚类底物的氧化反应，测定产生的醌类产物的含量来测定POD活性。

-酶标法：POD催化氧化反应会形成有色产物，通过测定产物的吸光度来测定POD活性。

4.谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）活性测定方法：GPx主要参与还原过氧化物，将其转化为相对稳定的醇和水。

常见的GPx活性测定方法有：-碳酸盐法：根据GPx还原底物中的碳酸盐，观察样品溶液pH值的变化来测定GPx活性。

抗氧化功能评价方法
一、化学方法
1.自由基清除能力测定法：常见的方法有DPPH自由基清除法、ABTS 自由基清除法和超氧阴离子清除法。

这些方法通过测定样品对自由基的清除能力，间接反映了其抗氧化能力。

2.过氧化氢清除能力测定法：该方法通过测定样品对过氧化氢的清除能力，评价其抗氧化能力。

3.金属螯合能力测定法：该方法测定样品与金属离子的结合能力，反映了样品的抗氧化能力。

4.过氧化物酶活性测定法：该方法测定样品中过氧化物酶的活性，评价其抗氧化能力。

二、生物学方法
1.细胞实验法：该方法通过将样品加入细胞培养基中，观察其对细胞的保护作用，评价其抗氧化能力。

2.动物模型实验法：将样品通过灌胃、注射等方式给予动物，观察其对动物体内氧化损伤的保护作用，评价其抗氧化能力。

3.人体试验法：将样品通过口服、注射等方式给予人体，观察其对人体内氧化损伤的保护作用，评价其抗氧化能力。

三、综合方法
1.多指标评价法：综合考虑样品在化学方法和生物学方法中的多个指标，给予综合评分，评价其抗氧化能力。

2.生物传感器法：利用生物传感器对样品进行检测，通过测定信号的变化来评价其抗氧化能力。

3.分子生物学方法：通过测定样品中相关基因的表达水平和蛋白质的表达水平，评价其抗氧化能力。

以上仅为抗氧化功能评价方法的一部分，不同方法的选择应根据具体的研究目的和样品类型来确定。

在实际应用中，常常需要结合多个方法进行综合评价，以获得更准确的结果。

一、试验方法1、DPPH自由基清除率的测定本实验采用1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl(DPPH)法测定样品清除自由基活性。

1.1实验原理1,1-二苯基-2-苦肼基（1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl(DPPH)）是一种稳定的以氮为中心的自由基，其乙醇溶液显紫色，最大吸收波长为517nm。

当DPPH 溶液中加入自由基清除剂时，其孤对电子被配对时，吸收消失或减弱，导致溶液颜色变浅，显黄色或淡黄色，在517nm处的吸光度变小，其变化程度与自由基清除程度呈线性关系，故该法可用清除率表示，清除率越大，表明该物质清除能力越强。

1.2溶液的配制0.08mmol/L DPPH溶液的配制：精密称取DPPH8.0mg，用无水乙醇溶解并定容至200ml棕色容量瓶中，得浓度为0.004%的DPPH溶液，避光保存，备用。

1.3实验步骤：分别取不同浓度的各样品溶液（0.24,0.48,0.72,0.96,1.20mg/ml）1.0ml，置10ml离心管中，加入3.0ml的DPPH溶液，室温避光反应30min，同时以无水乙醇为空白，于517nm波长处测定吸光值。

按下列公式计算DPPH自由基清除率。

DPPH自由基清除率（%）= A0-(A s-A c)/ A0×100%公式中，A0—1.0ml蒸馏水+3.0mlDPPH溶液的吸光度值A s—1.0ml样品溶液+3.0mlDPPH溶液的吸光度值A c—1.0ml样品溶液+3.0ml无水乙醇的吸光度值将实验重复三次，求得清除率的平均值。

2、总的抗氧化活性的测定总的抗氧化活性实验采用改良后的Prieto法。

2.1实验原理：磷钼络合物测定方法的原理是Mo(VI)被抗氧化物质还原成绿色的Mo(V)络合物，其最大吸收波长为695nm。

抗氧化物质活性越强，测定的吸光度值越大。

此方法操作简单，所用试剂低廉、方法重现性好，非常适合抗氧化性的测定。

抗氧化物活性测定方法（倾向于考虑DPPH法和ORAC法）1.FRAP法:铁离子还原抗氧化能力测定法[1]FRAP(ferric ion reducing antioxidant power)方法，在低pH值的溶液中，Fe3+-TPTz(Fe3+-三吡啶三嗪)被抗氧化剂还原成有色的Fe2+-TPTZ。

反应的结果常以Fe2+当量或标准物质的抗氧化能力表示。

该法快速简便、易于操作、重复性好，但FRAP反应属于电子转移(SET)反应，因此FRAP方法不能够测定氢转移反应(HAT)起作用的物质。

而且该法实际测定的是待测生物活性物质将Fe3+还原为Fe2+的能力，因此没有抗氧化能力的生物学相关性。

2.TEAC法(trolox equivalent antioxidant capacity)ABTS(2,2'-amino-di(2-ethyl-benzothiazoline sulphonic acid-6)ammonium salt,2,2'氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐)与过氧化物酶和氢过氧化物在一起形成ABTS+阳离子自由基。

在抗氧化剂存在时，这种自由基混合物的光吸收值下降，下降程度取决于抗氧化剂的抗氧化能力，测得的结果以TEAC表示，即被测抗氧化剂清除ABTS·+的能力(吸光度大小的变化)与标准抗氧化剂trolox(VE的水溶性类似物)清除ABTS·+的能力的比值。

TEAC法十分简单，适用于大量样品的分析检测。

但是，ABTS·+并非生理自由基，缺乏生理相关性，而且与FRAP方法相似，ABTS·+与不同抗氧化剂问的氧化反应时间不同，因此，只能定性不能定量评价样品的抗氧化能力。

3.DPPH法[2，3](2，2-diphenyt-l-picrylhydrazyl radical scavenging capacity)DPPH·(二苯代苦味肼基自由基)法是较常用的方法之一。

3种抗氧化活性测定方法抗氧化活性是指物质对氧化过程的抑制作用，能够减缓或阻断自由基对细胞和组织的损害。

目前，常用的抗氧化活性测定方法主要包括DPPH 自由基清除法、ABTS自由基清除法和铁还原能力测定法。

以下将对这三种方法进行详细介绍。

1.DPPH自由基清除法：DPPH（2,2-二苯基-1-若氧基-苯基-π-苦味噁唑）自由基清除法是一种常用的抗氧化活性测定方法。

该方法是通过测定样品对DPPH自由基的清除能力来评估其抗氧化活性。

DPPH自由基是一种紫色稳定的自由基，在接触到氢供体（抗氧化剂）后，会发生颜色变化从紫色转变为黄色。

可以通过测定样品溶液的吸光度来评估其抗氧化能力。

吸光度的降低表明样品对DPPH自由基的清除能力较强。

2.ABTS自由基清除法：ABTS（2,2'-联氨基双（3-乙基苯并噻唑））自由基清除法也是一种常用的抗氧化活性测定方法。

ABTS自由基是一种无色可溶性自由基，其生成主要通过氧化剂与ABTS反应而产生。

测定方法是将ABTS与过氧化氢反应，生成蓝色自由基溶液，然后将样品加入到溶液中，通过测定吸光度的变化来评估样品的抗氧化活性。

吸光度的降低表明样品对ABTS自由基的清除能力较强。

3.铁还原能力测定法：铁还原能力测定法是一种评估抗氧化活性的常用方法，通过测定样品对Fe3+还原为Fe2+的能力来评估其抗氧化能力。

在这个方法中，还原剂（如抗氧化剂）会与Fe3+反应，生成Fe2+，并且Fe2+的浓度可以通过测量其吸光度来确定。

浓度越高，吸光度越高，表明样品的抗氧化能力越强。

这三种抗氧化活性测定方法各有其优势和适用范围。

DPPH自由基清除法适用于评估样品对自由基的清除能力，但其结果受其他化合物的影响较大；ABTS自由基清除法对于水溶性和脂溶性样品均适用，但其结果也受其他化合物的影响；铁还原能力测定法适用于样品中还原型物质的测定，可评估样品对金属离子的还原能力。

因此，在实际应用中，可以根据需要选择适合的方法来评估样品的抗氧化活性。

一、抗氧化测定1．DPPH:a)样品溶液浓度初测定，（0~4℃）储藏。

b)称4mg，加无水甲醇溶解于烧杯，转移至100mL容量瓶定容。

浓度为0.04mg/mL。

避光（0~4℃）储藏。

i.5ml离心管（2mlDPPH·溶液+2ml无水甲醇）混合后充分振摇，反映稳定，40min后测定。

以无水甲醇为对照分光检测λ=517nm。

平行测定2次。

A1ii.5ml离心管（2ml待测样+2mL无水甲醇）混合后充分振摇，反映稳定，40min后测定。

以无水甲醇为对照分光检测λ=517nm。

A2iii.5ml离心管（2mlDPPH·溶液+2ml待测样）混合后充分振摇，反映稳定，40min后测定。

以无水甲醇为对照分光检测λ=517nm。

A3清除率（Y）=[1-（A3-A2）/A1]∙100%。

平行测定3次，取平均值。

分别以试样质量浓度和清除率做显形回归方程并计算清除率为50%时，代测样品的浓度值，即半抑制浓度IC50。

自由基清除能力，AE=1/IC50。

根据AE大小判断待测样品清除自由基能力的大小，AE越大清除能力越强。

2．·OHa)PBS制配：磷酸二氢钠31.2g 1000ml蒸馏水定容，磷酸氢二钠71.6g1000ml蒸馏水定容。

移液管移液磷酸二氢钠190ml、磷酸氢二钠810ml 于1000ml 烧杯，pH 计调7.4。

b) 邻二氮菲：148mg 蒸馏水定容100ml 。

c) 硫酸亚铁：208.5mg 蒸馏水定容100ml 。

d) 100ml30%双蒸馏水定容300ml 。

封口。

i. 10ml 离心管（0.5ml 邻二氮菲溶液+1mlPBS 混匀后+0.5ml 硫酸亚铁混匀后+0.5ml 22O H +双蒸馏水定容10ml ）37℃水浴1h 后分光λ=536nm 。

A1ii. 10ml 离心管（0.5ml 邻二氮菲溶液+1mlPBS 混匀后+0.5ml 硫酸亚铁混匀后+双蒸馏水定容10ml ）37℃水浴1h 后分光λ=536nm.A2 iii. 10ml 离心管（0.5ml 邻二氮菲溶液+1mlPBS 混匀后+0.5ml 待测样+0.5ml 硫酸亚铁混匀后+0.5ml 22O H +双蒸馏水定容10ml ）37℃水浴1h 后分光λ=536nm.A3iv. 10ml 离心管（1mlPBS+双蒸馏水定容10ml ）37℃水浴1h 后分光λ=536nm.A 空。

抗氧化能力分析方法抗氧化能力分析方法是评估物质对氧化损伤的抵抗能力的一种方法。

氧化损伤是指由于自由基和其他氧化物质的作用而导致的细胞和组织的损伤，与许多疾病的发展有关。

抗氧化能力分析方法可以帮助我们了解物质的抗氧化能力，进而在食品、医药和化妆品等领域中的应用。

以下是几种常用的抗氧化能力分析方法：1.自由基清除能力分析法：自由基清除能力是物质对自由基的消除能力，常用的分析方法包括DPPH自由基清除法、ABTS自由基清除法和超氧阴离子自由基清除法等。

这些方法通过测定物质与自由基反应后的颜色变化来评估其抗氧化能力。

2.还原能力分析法：还原能力是物质还原氧化剂的能力，可以通过测定物质与还原剂反应后的颜色变化来评估。

常用的方法有铁还原能力法、铁螯合能力法和硫酸钼蓝法等。

3.抗氧化酶活性分析法：抗氧化酶是一类能够清除自由基和其他氧化物质的酶，包括超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）和谷胱甘肽还原酶（GR）等。

通过测定这些酶的活性，可以评估物质对氧化损伤的抵抗能力。

4.氧化指标分析法：氧化指标是反映物质氧化损伤程度的指标，通常通过测定脂质过氧化产物、蛋白质氧化产物和DNA氧化产物等来评估。

常用的方法有TBARS法、氧化还原电位法和免疫学方法等。

5.细胞实验分析法：细胞实验可以模拟体内环境，通过测定细胞对氧化损伤的抵抗能力来评估物质的抗氧化能力。

常用的方法有细胞存活率测定法、DNA损伤测定法和细胞色素C释放法等。

综上所述，抗氧化能力分析方法有多种不同的方法，可以通过测定自由基清除能力、还原能力、抗氧化酶活性、氧化指标和细胞实验等来评估物质的抗氧化能力。

这些方法在食品、医药和化妆品等领域中的应用，有助于筛选和评估具有抗氧化性能的物质，为开发新的抗氧化剂提供科学依据。

常见体外抗氧化实验方法(含原理、试剂配制、操作流程、实例分析、英文表述)- 2023-3①DPPH·自由基清除法 2 Array②ABTS·+自由基清除法 5③ FRAP法(铁还原法) 811④过氧自由基(超氧自由基，·O2-)清除法(连苯三酚自氧化法)⑤羟基自由基(·OH)清除法(脱氧核糖法) 14⑥PTIO·自由基清除法(水溶液中) 16⑦ CUPRAC法(铜还原法) 18⑧铁络合能力(Ferrozin法) 20⑨脂质过氧化清除法(亚油酸为底物) 23⑩抗氧化产物的预测26①DPPH·自由基清除法/DPPH法原理：DPPH·（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical）即α, α-二苯基-β-苦基肼基游离基，由于p-π共轭，所以，氮自由基能稳定存在[1]。

当DPPH自由基被某物质清除，其最大吸收波长519nm处的吸光度A值随之减小；相应地，某物质自由基清除活性增加，其体外抗氧化活性也增加。

实验操作[1]:1.1 DPPH测试液的配置（适用于酶标仪测量，总体积为100μL）取DPPH 2毫克溶于约40mL溶剂（乙醇、95乙醇或甲醇）中，超声5min，充分振摇，务使上下各部分均匀。

取DPPH溶液80μL加入到96孔板中，加95乙醇（或无水乙醇）20μL，稀释混合，测A值，使A＝0.20±0.01。

该DPPH溶液避光保存，4h内用完。

（注意：如果是用分光光度计．．．．．，则A＝0.6±0.02比较合适）1.2 样品液的配置样品用合适的溶剂溶解，为便于计算，可配成1mg/mL浓度。

溶剂根据样品的极性进行选择，首选95乙醇或无水乙醇，如不溶可用DMSO。

1.3 预试取DPPH溶液80μL，往其中加少量样品液，加样时，先少后多渐加，边加边混合，并观察溶液的褪色情况，当溶液颜色基本褪去时，记下样品的加样量。