毛细管电泳出现问题分析

SSR标记荧光毛细管电泳在种子检测中常见问题分析李巧英（山西省种业发展中心，太原030006）摘要：SSR分子标记荧光毛细管电泳在农作物种子质量检测中常用于种子真实性检测、种子纯度鉴定和指纹数据库的构建。

试验过程中模板DNA浓度、特异峰型的统计分析以及仪器设备运行和维护、试验结果与指纹数据库的比对等关键环节都直接影响待测样品的结果判定。

就检测中遇到的问题进行分析，并提出相应的解决方法，以期为农作物种子质量检测荧光毛细管电泳技术平台提供参考。

关键词：SSR标记；荧光毛细管电泳；种子检测；问题；分析分子标记技术是近年来发展较快的基因检测技术，随着新标记方法的开发和试验技术的改进，在基因水平上检测农作物种子信息逐渐成为监控种子质量的一个重要手段。

由于分子标记法不受自然条件和表现性状的约束，实现了种子品种遗传信息室内快速检测，受到大家的青睐。

SSR作为第2代分子标记方法，是一种共显性标记，具有重复性好、等位变异多、数据分析简便、易操作等优点，在农作物种子质量检测中被广泛使用。

荧光毛细管电泳技术将荧光检测的高灵敏度和毛细管电泳的高效性结合，利用电泳和电渗流的电动力学原理，在毛细管中灌满胶分离PCR产物，检测荧光信号，数据软件分析系统将其转化成峰图，显示试验结果。

该技术自动化程度高，检测通量高，试验操作简单，数据统计程序化，避免人为估算的主观性，结果精确到1bp[1]，直接显示扩增产物片段的大小，实现了指纹图谱与碱基序列长短之间的对应转换，易于实验室间结果比对，常用GeneMapper 和GeneMarker分析SSR扩增片段[2]。

本文就试验中遇到的荧光信号强度、特异峰型的统计分析以及毛细管电泳仪运行和维护、试验结果与数据库比对等问题进行分析，为SSR分子标记荧光毛细管电泳检测农作物种子质量试验技术标准化提供参考。

拟，为所有专业方提供可控管、无破坏性、性价比高、低风险并允许反复运用的可行性方法。

BIM技术可以有效地提高施工技术水准，预防施工事故，减少施工成本浪费并缩短时程，强化施工过程中决策、控管能力。

一、无样品峰出现A、检查电流是否稳定：①没有电流。

可能原因——毛细管堵塞或断裂。

解决方法——用水冲洗毛细管，并观察是否有水流出，若无水流出请拆下卡盒检查毛细管两端和窗口是否断裂；毛细管没有断裂的话可以用水反向高压冲洗以试图解决此问题。

缓冲溶液需要过滤，将样品过滤或者离心去除其中的颗粒。

②电流波动很大，直至几乎消失。

可能原因——缓冲溶液中有气泡产生或者区带中样品析出。

解决方法——将缓冲溶液超声脱气，如果还有此现象发生，则可能是样品区带有析出，可以通过降低样品浓度/延长ramptime来试图解决这一问题；对于在缓冲溶液中溶解度不高的样品则需要在缓冲溶液中加入添加剂以解决此问题。

③电流初始值较小，后逐渐增大。

可能原因——样品进样量过大。

解决方法——减少进样量，通常进样参数设置在0.5psi,5sec 左右。

④电流正常。

可能原因：a样品浓度过低：使用高浓度样品测试，如果无法解决则有可能是以下其他原因。

b检测波长设置不正确：请确认被分析物的特征吸收，检查方法中的检测波长设置。

c分离极性错误：对于蛋白样品，请注意蛋白在分离条件下其PI及所带电荷；对于核酸样品，通常条件下会带负电荷。

d样品在毛细管内壁吸附：对于蛋白及核酸样品应尽量采用涂层毛细管分离，或采用极端pH条件或动态涂层防止样品吸附。

e光学检测器或光纤损坏：进行标准样品的测试，如果没有对应的结果出现，则有可能存在硬件问题，请联系工程师。

B、检查毛细管窗口，是否有透明窗口：可能原因——忘记开毛细管窗口或窗口位置不正。

解决方法——重新开毛细管检测窗口，或将窗口调整到正确位置。

二、样品峰出现拖尾可能原因——样品在毛细管内壁吸附。

解决方法——对于蛋白及核酸样品应尽量采用涂层毛细管分离，或采用极端pH条件或动态涂层防止样品吸附。

三、样品峰形不对称A、检查毛细管入口：可能原因——毛细管入口切口不平齐。

解决方法——重新切割毛细管入口，注意毛细管切割方法，不可以用力过猛或反复刮擦。

电泳中断原因分析毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）又称高效毛细管电泳（high perform ance capillary electrophoresis，HPCE），是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术。

毛细管电泳实际上包含电泳、色谱及其交叉内容，它使分析化学得以从微升水平进入纳升水平，并使单细胞分析，乃至单分子分析成为可能。

毛细管电泳技术的不断发展，毛细管电泳仪也越来越多的得到了大家的认同，但往往我们在试验的过程中经常会遇到一些问题，如样品的重现性，运行时的电流波动，阻碍电泳进一步发展的重要问题，及时的解决电泳的相关问题，对电泳的发展乃是分析化学的未来有这重要的现实意义。

毛细管电泳是在高压的作用下，以毛细管为分离通道，柱子中充满着缓冲溶液，毛细管两端浸泡在缓冲溶液的小瓶中，如图1所示，这样就构成了回流，对应的回流也就有了电流，但往往在试验的过成中电流并不像我们想的那样稳定，甚至有断流的现象，接下我们分析一下产生这种现象可能的原因。

图1 毛细管电泳仪示意图可能导致断流的原因：1、毛细管电泳柱子1.1柱子断裂毛细管柱子外壁涂有聚亚酰胺涂层，有很好的韧性，一段这层涂层脱落，毛细管柱子将失去原有的韧性，变得很脆，很容易折断。

取毛细管柱子时千万不要用利器划柱子，否则柱子很容易在划痕处断开。

毛细管柱子断裂后，缓冲溶液从断裂处流出色谱柱子，进而不能构成回路，从而导致电流迅速下降，致使电流中断，分离分析中断。

解决方法：更换柱子（平时更换柱子特别注意，不要用利器划到柱子）图2 断了柱子的毛细管电泳示意图1.2毛细管电泳柱子堵了常用的毛细管电泳柱子内径有50微米、75微米及100微米，内径很小，如果我们在试验的过场中不注意缓冲溶液及样品的纯度，或是使用了粘度很大的缓冲溶液，很容易堵死毛细管柱子，造成电流的中断。

图3柱子被堵后毛细管电泳示意图解决方法：压力反向冲洗柱子、样品及缓冲溶液使用前过滤2、气泡问题2.1缓冲溶液中的气泡我们在配置缓冲溶液时，所选用的水及在配置的过程中会使缓冲溶液溶解少量的气体，当这部分缓冲溶液进入到毛细管柱子内部时，两端加高压，运行一段时间会是缓冲溶液中的气体溢出，使柱子内产生气泡，从而使电流中断。

毛细管电泳实验报告（含预习报告）
系别____________ 学号 ________ 姓名 _________
组别 ____ 同组姓名 ___________________
实验日期年月日星期____ 得分____
1 实验目的
2 实验原理
3 预习报告
3.1请试回答以下问题
试列举影响电渗流(大小和/或方向)的几个主要因素：___________________；
决定离子电泳淌度的参数：，，。

3.2 查找下列物质的pKa值，并初步判断出峰顺序
苯甲醇：，苯甲酸：，水杨酸：，对氨基苯甲酸：
预测出峰顺序：
3.3进样前使用三种溶液对毛细管冲洗的目的分别是什么？
3.4 试列举毛细血管电泳的主要优势和劣势。

4 实验仪器及条件
仪器型号：
毛细管总长：毛细管有效长度：检测波长：
分析电压：进样压力：进样时间：
5 实验内容
6 数据处理
6.1 数据记录
6.2 各组分浓度计算(单点外标定量法)
计算公式：
6.3 各组分淌度计算
表观淌度计算公式：
有效淌度计算公式：
7 结论及讨论
（试讨论：1.判断在另外两种缓冲液下，各个峰的归属，并对各个组分迁移时间的变化做出合理分析和讨论;2. 判断哪个组分可以作为电渗流标记物，并试根据淌度结果说明之)
8 参考文献
（附：电泳谱图）。

综 述影响毛细管电泳分离生物大分子的因素刘　勇1,2　王　荣1,2　高　岚2　贾正平1,2　辛晓婷2　谢　华1　马　骏1(1.兰州军区兰州总医院临床药理基地,兰州,730050;2.兰州大学生命科学学院,兰州,730000) 摘　要　目前毛细管电泳在分离方面的应用越来越广泛,但重复性一直是制约其应用的主要问题。

随着毛细管电泳技术的发展,影响毛细管电泳结果的因素也发生着变化。

本文对影响毛细管电泳分离生物大分子的因素进行综述,希望对使用毛细管电泳的使用者者有所帮助。

关键词　毛细管电泳　分离　影响因素基金项目:国家自然科学基金项目(No .20775089)。

作者简介:刘勇,男,1984年6月出生,硕士,辽宁抚顺人,主要从事毛细泳和分子生物学研究工作。

E -mail :liuy .8406@ 毛细管电泳(CE )现在已经广泛应用于分子生物学、分子医学和生命科学等领域,近年来在生物大分子分离方面应用更为突出。

CE 顾名思义,就是在一根毛细管中完成电泳过程,这种方法的灵敏度是非常高的,但就是这种高灵敏性对于条件的改变特别敏感,影响了重复性。

如果对其条件进行严格控制并仔细操作的话,CE 确实是一种非常高效、快速、简易的检测方法。

本文查阅20年来毛细管电泳相关文献,对影响CE 结果的因素进行综述,以期对毛细管电泳的使用者有所帮助。

1　检测器检测器是毛细管电泳仪的关键部件之一,它的作用是将毛细管柱流出物中样品组分的含量随时间的变化转化成易测量的电信号。

用记录仪记录电信号,得到样品组分的电泳图。

根据组分峰的位置、大小和形状进行定性、定量分析,以及分离优劣的判断。

目前使用最广的两种检测器为紫外检测器和荧光检测器。

紫外吸收检测器是毛细管电泳最早选用的检测器,它因结构简单、操作方便、灵敏度适中而应用广泛。

但其最大缺点是检测光程短,难以进一步提高检测的灵敏度,最低检测限一般在10-5～10-6m ol /L 之间。

荧光检测器特别是激光诱导的荧光检测器(LIFD ),是在普通荧光检测器的基础上发展起来的,从1987年开始才有应用于毛细管电泳的报道[1],因其灵敏度极高、性能可靠、易操作、使用成本低而迅速得到广泛的应用[2],尤其适合应用于氨基酸、DNA 片段等生化样品的检测。

高效毛细管电泳仪实验过程中常见问题解答序号现象可能原因纠正措施1电源开启后毫无反应1.电源没接通2.保险丝已断将仪器插头从电源插座中取出，确认插座里有电，检查保险丝，更换电源线。

2 电流指示为零电极断掉，弯曲或没有插对更换、校正、重插。

3仪器实验过程中电流不稳或电流指示远底于正常值，但电压值正常1.毛细管堵塞2.毛细管中无缓冲溶液3.毛细管破裂4.电压未加5.仪器参数设定错误6.柱内有大气泡7.用水做溶剂配样，在压力进样时将一部分水压入缓冲溶液中重新用HCl、NaOH清洗毛细管或剪去进样端小段毛细管，如果仍旧不能清洗，更换毛细管。

检查毛细管是否浸在缓冲溶液中。

更换毛细管。

检查电压值。

重新设定仪器参数。

重新注入缓冲溶液。

用稀释的运行缓冲溶液代替水配样。

4 电流指示过高毛细管柱过热用干净缓冲溶液冲洗毛细管柱，使之冷却。

5电流指示不断变化1.毛细管内有许多小气泡2.环境温度过高或过底，通风不好重新注入缓冲液。

调整环境温度，最好使用控温装置。

6恒压操作时电压显示值闪动电流设置过底重新设置电流值。

7电泳谱图上没有出现峰1.样品浓度太低或体积太小2.样品被管壁严重吸附3.毛细管检测窗与检测器光路未对准4.信号线连接错误增加样品浓度或样品体积。

对毛细管壁进行修饰处理。

取出毛细管，重新安装。

检查信号线连接情况。

8基线漂移或噪声较大1.毛细管被污染或未清洗2.毛细管柱的光学窗口被污染3.有小气泡4.操作电压太高5.缓冲溶液浓度太大6.缓冲溶液或样品中有小颗粒物质7.毛细管有很小裂缝8.检测器灯源老化9.接地问题10.检测器参数设定错误11.数据系统设定错误用0.5mol/LNaOH溶液、水、缓冲液清洗毛细管。

取下检测池，清洗光学透镜。

缓冲溶液脱气。

降低操作电压。

降低冲溶液浓度。

过滤缓冲溶液或样品溶液并检查缓冲溶液与样品是否发生作用。

更换毛细管。

更换灯源。

将检测仪和电泳仪连接在同一电源上。

检查检测器参数设定值。

重新设定数据处理参数。