水稻转基因实验操作手册整理

水稻转基因组织培养步骤农杆菌介导的转化一．试剂1 6-BA (6-BenzylaminoPurine) Sigma Cat No. B-58982 KT (Kinetin) Sigma Cat No. K-07533 NAA (Napthalene acetic acid) Sigma Cat N-06404 IAA (Indole-3-acetic acid) Sigma Cat No. I-51485 2,4-D (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid) Sigma Cat No. D-84076 Kanamycin USB Cat No. 179247 CH (Casein Enzymatic Hydrolysate) Sigma Cat No. C-72908 Hn (hygromycin B) GiBco BRL Cat No. 10687-0109 Cn (Carbenicillin) 国产分装10 Nicotinic acid Sigma Cat No. N-076511 Pyridoxine HCl Sigma Cat No. P-866612 Thiamine HCl Sigma Cat No. T-390213 Inositol Sigma Cat No. I-301114 Phytagel Sigma Cat No. P-816915 Dimethyl Sulfoxide-DMSO Sigma Cat No. D-587916 X-gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactoside) Sigma Cat No. B-378317 AS (Acetosringone) Aldrich chem., CO 01531 EG二．溶液1.MS maxNH4NO316.5gKNO319.0gKH2PO4 1.7gMgSO4?7H2O 3.7gCaCl2?2H2O 4.4g 或CaCl2 3.32g逐一溶解药品后，加dH2O定容到1000ml。

水稻转基因实验技术手册遗传工程实验室Genetic Engineering Laboratory Discipline of Crop Genetics and BreedingFujian agricultural and Forestry University目录第一章DNA提取与纯化第二章引物设计与PCR第三章感受态细胞制备与转化（E. coli & 农杆菌）第四章电泳技术、琼脂糖凝胶DNA回收第五章质粒回收第六章RT-PCR第七章构建载体互补实验过量表达GFPGUSRNAi第八章水稻组织培养第九章原位杂交第十章石蜡切片技术第十一章扫描电子显微镜附录：第一章SDS-DNA微量提取法1、取新鲜叶片5cm 左右于1.5ml 离心管中，加入液氮研磨（电钻）。

2、加入700μl 预热至65℃的SDS 抽提液，迅速搅匀后置于65℃水浴30min 。

3、加入200μl 5M KAc ，颠倒混匀，-20℃冰浴30min 后，10,000rpm 离心5min ，将上清夜倒入另一新的1.5ml 离心管中。

注：若溶液中仍有植物组织，可进行二次离心。

4、加入等体积的异丙醇（700 μl ），-20℃冰浴30min ，11,000rpm 离心5min 。

5、弃上清，加入70%乙醇清洗液晾干。

6、将风干的DNA 溶于100 μl TE 溶液中，55℃水浴溶解1h ，再室温放置1d 。

实验准备：溶液配制：SDS-抽提液：1M Tris-HCl ：100ml 5M NaCl ：100ml 0.5M EDTA ：100ml 10% SDS ：125mlTE （pH8.0）：1M Tris-HCl （pH8.0）：5ml 0.5M EDTA （pH8.0）：1ml第二章 PCR定容至1000ml定容至500mlPrimeSTAR HS DNA Polymerase with GC Buffer & TaKaRa LA Taq with GC BufferPCR体系和程序第四章琼脂糖凝胶DNA回收*第一次使用前请先在15ml漂洗液WB中加入60ml无水乙醇1、在长波紫外下，用干净刀片将所需回收的DNA条带切下，尽力切除不含DNA的凝胶，得到凝胶体积越小越好。

水稻、玉米、油菜转基因产品内标准基因检测方法及标准化下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。

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转基因水稻Bt汕优63外源插入结构验证和定量检测方法建立一、背景介绍Bt汕优63是一种经过基因工程技术改造的转基因水稻品种，通过引入Bt基因，使其具备抗虫特性，有效减少农药使用，保障粮食安全。

为确保Bt汕优63中外源基因插入结构的稳定性和表达量，本研究旨在建立一套针对其外源插入结构的验证和定量检测方法。

二、外源插入结构验证方法1. DNA提取从Bt汕优63植株中提取基因组DNA，作为后续实验的模板。

2. PCR扩增设计特异性引物，针对Bt基因及其侧翼序列进行PCR扩增。

通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，验证Bt基因是否成功插入水稻基因组。

3. 序列分析将PCR扩增产物进行测序，与预期序列进行比对，确认插入位点和序列的正确性。

三、定量检测方法建立1. 实时荧光定量PCR（qPCR）以Bt基因为目标，设计特异性引物和探针，建立qPCR检测体系。

通过标准曲线法对Bt基因在水稻基因组中的表达量进行定量分析。

2. qPCR实验步骤（1）制备cDNA：以提取的RNA为模板，反转录合成cDNA。

（2）配制qPCR反应体系：包括cDNA模板、引物、探针、dNTPs、Taq酶等。

（3）设置qPCR反应程序：包括预变性、变性、退火、延伸等步骤。

（4）数据分析：采用软件分析Ct值，根据标准曲线计算Bt基因的相对表达量。

四、方法优化与验证1. 优化实验条件：对qPCR反应体系中的引物浓度、探针浓度、退火温度等进行优化，确保检测体系的灵敏度和特异性。

2. 重复性实验：进行多次独立实验，验证检测方法的重复性。

3. 线性范围验证：通过制备不同浓度的标准品，构建标准曲线，验证检测方法的线性范围。

本研究成功建立了Bt汕优63外源插入结构的验证和定量检测方法，为后续转基因水稻的监管、研究和应用提供了有力的技术支持。

通过这些方法，可以确保Bt汕优63中外源基因的稳定性和表达量，为我国转基因作物的发展和安全提供保障。

六、实验操作注意事项1. DNA提取过程中的注意事项确保实验过程中使用的器械和容器无菌，避免DNA污染。

说明使用表型观察,pcr法鉴定转基因水稻的条件(一)说明使用表型观察、PCR法鉴定转基因水稻的条件1. 引言转基因技术的广泛应用使得转基因作物的鉴定成为农业领域中的重要任务之一。

其中，转基因水稻鉴定对于保障粮食安全、推动农业可持续发展具有重要意义。

本文将针对使用表型观察和PCR法鉴定转基因水稻进行详细介绍。

2. 表型观察鉴定转基因水稻的条件转基因水稻的表型观察鉴定通常需要以下条件：•生长环境：转基因水稻和非转基因水稻应在相同的生长环境下进行观察，包括温度、湿度、光照等因素。

确保生长环境的一致性有助于排除其他环境因素对水稻表型的影响。

•对照品种：选择与待鉴定水稻表型相似的非转基因水稻对照品种，用于对照比较观察结果。

这有助于辨别转基因水稻的特异表型特征。

•观察时间点：需要在适当的生长阶段进行观察，以确保转基因水稻的表型特征能够明显表现出来。

通常，在水稻植株出苗、分蘖、开花等关键生长阶段进行观察效果较好。

•观察指标：通过观察转基因水稻在相关生长阶段的形态特征、生理指标等来判断其是否为转基因品种。

例如，观察水稻株高、叶片形态、穗长等指标的变化情况。

3. PCR法鉴定转基因水稻的条件PCR法是一种常用的转基因鉴定方法，也可用于转基因水稻的鉴定。

下面是鉴定转基因水稻所需的条件：•提取基因组DNA：利用合适的DNA提取方法，从待鉴定水稻样品中提取基因组DNA。

确保提取的DNA质量和浓度适宜，以保证PCR反应的准确性和可靠性。

•选择适当的引物：根据需要鉴定的转基因特征，选择适当的引物。

这些引物应与目标转基因序列具有特异性，以确保可靠的扩增结果。

•反应体系设计：根据引物设计PCR反应体系，包括适当的引物浓度、Mg2+浓度、模板DNA浓度等。

并设置负对照和阳性对照，以确保实验的准确性和可靠性。

•PCR反应条件：设置合适的PCR反应条件，包括反应温度、反应时间、循环次数等。

根据引物的特性和PCR仪的要求进行合理调节，确保PCR反应能够成功扩增目标序列。

农杆菌介导的转化一．试剂1 6-BA (6-BenzylaminoPurine) Sigma Cat No. B-58982 KT (Kinetin) Sigma Cat No. K-07533 NAA (Napthalene acetic acid) Sigma Cat N-06404 IAA (Indole-3-acetic acid) Sigma Cat No. I-51485 2,4-D (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid) Sigma Cat No. D-84076 Kanamycin USB Cat No. 179247 CH (Casein Enzymatic Hydrolysate) Sigma Cat No. C-72908 Hn (hygromycin B) GiBco BRL Cat No. 10687-0109 Cn (Carbenicillin) 国产分装10 Nicotinic acid Sigma Cat No. N-076511 Pyridoxine HCl Sigma Cat No. P-866612 Thiamine HCl Sigma Cat No. T-390213 Inositol Sigma Cat No. I-301114 Phytagel Sigma Cat No. P-816915 Dimethyl Sulfoxide-DMSO Sigma Cat No. D-587916 X-gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactoside) Sigma Cat No. B-378317 AS (Acetosringone) Aldrich chem., CO 01531 EG二．溶液1.MS maxNH4NO316.5gKNO319.0gKH2PO4 1.7gMgSO4∙7H2O 3.7gCaCl2∙2H2O 4.4g 或CaCl2 3.32g逐一溶解药品后，加dH2O定容到1000ml。

水稻转基因实验操作一、水稻愈伤组织的诱导（以水稻成熟胚为试材诱导愈伤组织）1．消毒：取水稻成熟种子，人工或者机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子，按以下步骤消毒：1）将种子放入100ml无菌三角瓶中，倒入70%酒精消毒1分钟；2）倒去酒精，加入100ml 3 %次氯酸钠（NaClO）溶液（次氯酸钠：水（V/V）=9:21），放入摇床振荡60分钟；3) 倒去次氯酸钠溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5遍，最后一遍浸泡30分钟。

2．诱导与继代培养：（以下步骤需无菌操作）1）种子放在无菌滤纸上吸干，置成熟胚于诱导培养基中，每皿10颗；2）操作完毕用封口膜封好培养皿，在26℃培养箱，（光）暗培养10-15天；3）在超净工作台上打开培养皿，用镊子挑取自然散落的胚性愈伤组织（淡黄色，致密呈球状），在26℃光（暗）培养箱，继代培养2周（继代两次）。

(没有脱落的可在原培养基上继续培养7天，次数多了效果会减弱)二、预培养将继代两次的状态较好的愈伤颗粒，接种到预培养基26℃暗培养4天。

预培养基碳源为20克蔗糖+20ml 50% 葡萄糖（115度灭菌30min）。

乙酰丁香酮（AS）浓度为100 μM (每毫升培养液中加入100 mM的AS 1微升)三、农杆菌（工程菌）培养把-70℃保存的菌种首先用含125 mg/L壮观霉素、50 mg/L利福平的YEB液体培养基，在26-28℃，150 r/min振荡培养16-18 h，活化转入打靶载体的农杆菌。

在预培养的第2天，用含125 mg/L壮观霉素、50 mg/L利福平的YEB固体培养基划线接种农杆菌菌株，28 ℃静止培养2-3 d。

3 d后将单菌落农杆菌刮入农杆菌悬浮液体培养基或者AAM培养基，28 ℃振荡培养3～4 h。

分光光度计测定菌液浓度，并将其浓度调至0.5-1.0 OD600四、感菌与共培养1）将预培养后的愈伤组织接入100 mL三角瓶,中，加入调制好的农杆菌悬浮液侵染30分钟，期间摇动数次；2）倒去菌液，将愈伤组织取出，置于无菌的滤纸上吸干表面菌液（30-40分钟）；3）将愈伤组织置于共培养基上(共培养基上面垫上一层9cm无菌滤纸)。

水稻转化体系的构建（第三版，2015年3年10日）N6D 诱导愈伤，前培养2N6-AS 共培养N6DS 筛选MS-NK 再分化MS-HF 生根AB 农杆菌生长MSL 侵染N6D 1LChu N6 Basal Medium w/ Vitamins（PhytoTechnology Laboratories）3.99gMyo-inositol 0.1gProline 2.878gCasamino acid 0.3gSucrose 30g2.4-D 2mg/LGellan gum(Gelrite) 3g/L(分装)PH5.8120℃15min2N6-AS 1LChu N6 Basal Medium w/ Vitamins（PhytoTechnology Laboratories）3.99gMyo-inositol 0.1gCasamino acid 0.3gSucrose 30gGlucose 10g2.4-D 2mg/LGellan gum(Gelrite) 3g/L(分装)PH5.8120℃15min 冷却至50℃加1ml AS（200mg/L）不要吹的太干，该培养基要湿度高一些较好。

N6DS 1LChu N6Basal Medium w/ Vitamins（PhytoTechnology Laboratories）3.99gMyo-inositol 0.1gProline 2.878gCasamino acid 0.3gSucrose 30g2.4-D 2mg/LGellan gum(Gelrite) 3g/L(分装)PH5.8120℃15min 冷却至50℃加1ml cef(100mg/ml) 1ml hyg(50mg/ml)MS-NK 1LMS Basal Medium w/ Vitamins（PhytoTechnology Laboratories）4.43g （包含0.1g Myo-inositol ）Casamino acid 2gSucrose 30gSorbitol 30gNAA 0.02mg/LKinetin 2mg/LGellan gum(Gelrite) 3g/L(分装)PH5.8120℃15min 冷却至50℃加1ml cef(100mg/ml) 1ml hyg(50mg/ml)MS-HF 1LMS Basal Medium w/ Vitamins（PhytoTechnology Laboratories）4.43g （包含0.1g Myo-inositol ）Sucrose 30gGellan gum(Gelrite) 3g/L(分装)PH5.8120℃15min 冷却至50℃AB 200mlGlucose 1gAgrose 3gAB Buffer(20倍) 10mlAB Salt (20倍) 10mlddH2O 180ml120℃15min 冷却至50℃加相应的抗生素。

1.5 农杆菌介导的水稻快速转化1.5.1 各种培养基成分水稻快速转化的培养基成分如表2-1，N6D培养基用于愈伤组织诱导和筛选，2N6-AS 为共培养培养基，AAM 用于配制农杆菌浸染液，RE-III 为分化培养基，HF 为生根培养基，AB 培养基用于农杆菌的活化。

其中，配制固体培养基时，固定剂使用0.4%的Gerite。

1.5.2 种子的消毒（1）水稻成熟种子去壳；（2）置70%乙醇1min，弃乙醇，用无菌水清洗5 次；（3）在每50ml 的 2.5%次氯酸钠溶液中滴 1 滴吐温20 混匀，然后放入乙醇处理过的水稻种子，浸泡15min，无菌水清洗 5 次；（4）在 2.5%次氯酸钠溶液中再灭菌15min，无菌水清洗 5 次。

1.5.3 种子的接种和愈伤组织诱导将灭菌后的成熟种子平摆于诱导培养基上，在常光照、32℃条件下培养5-8d。

1.5.4 浸染液的制备（1）取出 1.4 中所保存的含有目标质粒的单克隆，吸取50μl 保菌液均匀涂布于固体AB培养基上，AB培养基中含50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平，28℃条件下培养2-3d；（2）刮取AB 培养基上的农杆菌，用AAM 重悬农杆菌，用AAM 稀释至OD600为0.1。

1.5.5 愈伤组织侵染和共培养（1）取出诱导5-8d 的水稻愈伤组织，切去胚乳和芽鞘；（2）将生长状态良好的愈伤组织置于浸染液中，浸泡5-8min；（3）取出愈伤组织，置灭菌滤纸上，吸取愈伤组织表面的侵染液；（4）在2N6-AS 培养基上铺一层无菌滤纸，并用AAM 浸湿；（5）将浸染后的愈伤组织均匀平放于2N6-AS 培养基；（6）在25℃、黑暗条件下共培养3d。

1.5.6 抗性愈伤的筛选（1）共培养愈伤组织的洗涤：取出共培养的愈伤组织，放入含400mg/L 羧苄青霉素的抑菌液中清洗，共洗 5 次，每次浸泡6min左右；（2）倒去洗涤液，将愈伤组织移到无菌滤纸上，尽量蘸干愈伤组织表面的液体；（3）将愈伤组织均匀平放于N6D+培养基上，32℃、常光照条件下培养，直到新的愈伤组织长出，需两周左右。

根癌农杆菌介导的转化方法将水稻成熟种子去壳。

仔细剔除有霉菌点籽粒，取饱满清亮籽粒先用７０％乙醇浸泡（表面消毒）1min ，再用含2%活性氯含量的NaClO溶液（加1-3滴Tween20）浸泡30min以上（最长可至1小时左右），并不断摇动，然后用无菌水冲洗4-5次；将灭菌后的成熟种子置于无菌滤纸上吸干多余水分，直接接种于N2D6培养基上，于24-26ｏC暗培养7-10 天，诱导出初生愈伤组织；将上述从成熟胚诱导的初生愈伤组织直接用于与农杆菌的共培养转化；农杆菌的准备是在含有50mg/mL km的LB 平板上划线，培养含有重组质粒的农杆菌，28ｏC培养36h。

挑取活化的单个农杆菌菌落，在28ｏC于3mL 含km 的LB培养基中振荡培养过夜，第2天按1.5/50（V/V）接种量在AB液体培养基中培养，培养程度以稍早于生长对数期为宜（OD600约为0.6-0.8 ）。

离心回收新鲜培养的农杆菌，并重悬于约1/2-1/3体积的AAM（含100-400mol·L-1乙酰丁香酮）液体培养基中，至OD600约为0.8-1.0左右为宜；将愈伤组织切下，立即投入含农杆菌的AAM重悬液中，浸泡15-20分钟，并不断摇动。

将感染后的愈伤组织置于无菌滤纸上吸干多余的菌液，转入共培养基N6D2C上培养3天（26ｏC，暗培养）。

转入筛选培养基N6D2S1上与24-26ｏC 暗培养条件下筛选2周。

新鲜长出的抗性愈伤组织或不褐化的愈伤组织转入筛选培养基N6D2S2上，继续筛选培养2次，每次2周。

将抗性愈伤组织转入MSPR培养基上进行预分化处理14天，其中先在暗条件下培养7天，然后转入光条件下培养7天；经预分化处理的愈伤组织转入MSR培养基分化再生，在光下培养；再生的小苗在1/2MS0培养基上生根壮苗。

农杆菌介导转化水稻所用培养基-1-1 626蔗糖，2mg·L-1 2,4-D, 2.5g·L-1Phytagel( sigma) ,pH5.8N6D2S1N6D2，25mg·L-1潮霉素B（Roche），500mg·L-1头孢霉素（cefotaxime）N6D2S2N6D2，50mg·L-1潮霉素B，300mg/mL头孢霉素2424442 150mg·L-1KCl, 10mg·L-1CaCl2, 2.5mg·L-1FeSO4·7H2O, 5g·L-1葡萄糖，pH7.0AAM AA（Toriyama和Hinata，1985）盐分和氨基酸，MS（Murashige和Skoog 1962）维生素，0.5g·L-1酪蛋白水解物，36g·L-1葡萄糖，68.5g·L-1蔗糖，100-400µmol·L-1乙酰丁香酮，pH5.2N6D2C N6D2, 10g·L-1葡萄糖，100-400µmol·L-1乙酰丁香酮（用时现加），pH5.2预分化与分化再生MSPR MS（Murashige和Shog，1962）盐分和维生素，0.5g·L-1酪蛋白水解物，50g·L-1蔗糖，2mg·L-16-BA，1mg·L-1NAA, 5mg·L-1ABA ，3.0g·L-1Phytagel, pH 5.8，50mg·L-1潮霉素B，200mg·L-1头孢霉素。