三种脆性X综合征细胞模型的比较

三种脆性X综合征细胞模型的比较张红琴1,陈瑶2,陈红武3,姚英民3(1.南方医科大学南方医院新生儿科研究生;2.南方医科大学生物技术学院;3.南方医科大学南方医院新生儿科,广东广州510515)摘要:目的比较三种细胞在建立脆性X综合征细胞模型中的差异,为脆性X综合征的实验研究提供有效,便利的细胞模型。

方法利用硝普钠可通过产生NO诱导脆性X智力低下一号基因(frag il e X m enta l reta rda ti on-1gene,F M R1)启动子区Cp G岛甲基化的原理,建立脆性X综合征细胞模型;采用人类新鲜的外周血单个核细胞(PM BC),大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12),人类慢性髓源性白血病细胞系(K-562),比较三种细胞模型,在硝普钠用药浓度,封闭持续时间及用腺苷酸环化酶激活剂弗司可林(forsko li n,FSK)诱导封闭基因重新表达持续时间等方面的特点,通过逆转录PCR 检测FMR1基因封闭或开启的效果。

结果三种细胞模型在硝普钠用药浓度,封闭持续时间及弗斯可林诱导重新表达持续的时间方面都不完全相同。

结论三种脆性X综合征细胞模型各有其优缺点,可根据不同地研究方向选用不同的细胞模型。

关键词:硝普钠;脆性X综合征;细胞模型中图分类号:R394文献标识码:A文章编号:1006-9534(2010)12-0028-03脆性X综合征是最常见的遗传性智力低下性疾病之一,在X连锁智力低下患者中占40%,目前尚无有效的治疗方法。

目前认为F ra(X)致病机制主要是由于脆性X智力低下一号基因(frag ile X m enta l re tardati on-1gene,FM R1)启动子区内(CGG)n三核苷酸重复序列的不稳定扩增及其上游的Cp G岛的异常甲基化,使FMR1基因转录及翻译终止,目前一般认为,CpG岛有无异常甲基化比C GG重复数对表型的影响更为重要。

国外多采用转基因和FM R1基因敲除制作动物模型,但是这些动物模型的制作技术复杂,国内尚未有类似报道。

因此,本研究采用硝普钠体外甲基化封闭F M R1基因的方法,制作F ra(X)人类新鲜的外周血单个核细胞(PM BC),大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12),人类慢性髓源性白血病细胞系(K-562)细胞模型,比较三种细胞在建立脆性X综合征细胞模型的差异与优缺点。

试图为Fra(X)的实验研究提供一种有效,便利的细胞模型,为下一步药物活化该基因的研究奠定基础。

资料与方法1.材料(1)试剂:淋巴细胞分离液(上海恒信化学试剂有限公司);R P M I-1640细胞基础营养液(G i bco);RPM I-DM E M 细胞基础营养液(H y clone);马血清(H y clone);新生牛血清(PPA);胰酶(G i bco);硝普钠(S i gm a);弗司可林(forsko li n, FS K)(S i gma);T r izo l试剂(takala公司);RT-PCR试剂管(pro m ega公司);琼脂糖(电泳级)。

(2)引物:FM R1基因引物(上游引物:5c-GACATG-C A CTTT CGGAGTCTGCGCAC-3c;下游引物:5c-TTCT-GGGGCATT AGGTCC AA CCCTTG-3c)[1];甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因引物(上游引物:5c-TGATGACAT-C AAGAAGGTG GTG AAG-3c;下游引物:5c-T CCTTGGAG-GCCATGTAGGCCAT-3c)[2]。

通讯作者:姚英民2.方法(1)细胞培养:外周血单核细胞(PM BC)的分离采用密度梯度离心法,PM BC细胞用R P M I-1640完全培养液加20%的新生牛血清培养;PC12细胞用RPM I-DM E M完全培养液加5%的新生牛血清及15%的马血清培养;K-562细胞用RP M I-1640完全培养液加10%的新生牛血清培养;3种细胞均在温度37e和5%CO2饱和湿度的培养箱中进行传代培养。

上述细胞培养过程中除正常组外,其他各组均需避光培养。

(2)硝普钠体外封闭F M R1基因建立脆性X综合征细胞模型见参考文献[3]¹硝普钠用量比较:PM BC细胞组分为正常组,S N P 100L m ol/L组,S N P500L m o l/L组;PC12细胞组分为正常组, SNP500L m o l/L组,SNP1000L mo l/L组;K-562细胞组分为正常组,SNP500L mo l/L组,S N P800L m o l/L组,S N P 1000L m o l/L组。

正常组均只加相应完全培养基,其他S N P 组均在加相应完全培养基基础上再加相应浓度(终浓度)的SNP。

各组均于培养24h后收集细胞并提取RNA(TR IZOL 法),作RT-PCR验证FM R1基因的封闭效果。

ºF M R1基因封闭维持时间比较:PM BC、PC12、K-562细胞均分为正常组,SNP组。

S N P组均在加入相应浓度的SNP(分别是500L m o l/L、1000L m o l/L、1000L m ol/L)后12h, 24h,及之后每隔24h收集细胞直至RT-PCR结果显示目的基因的扩增片段重新出现,收集后的细胞均提取RNA(TR-IZOL法),作RT-PCR验证FM R1基因的封闭效果。

»FSK诱导三种细胞模型FM R1基因封闭后重新表达效果比较:PM BC、PC12、K-562细胞均分为正常组与F S K 组。

FS K组均在加入相应浓度的S N P(同上)培养满12h后再加入FSK(50L m o l/L),然后继续培养12h,24h,48h,72h后收集细胞并提取RNA(TR IZOL法),用RT-PCR验证F M R1基因的表达效果。

上述RT-PCR步骤均为:1)c-DNA合成:RNA(1L g)加DEPC水使总体积达10L ,l 然后70e ,5m in ,之后立即冰裕2m i n ,之后加入1L l AM V,4L l 5@AM V buffer ,1L l o ligdt ,015L l RNA 酶抑制剂,1L l 的d NTP (10L m o l/L )然后95e 5m i n ,42e 1h 。

2)PCR 反应体系均为:总体积25L ,l cDNA 2L ,l 上下游引物各015L ,l 10@Extaq buff e r 2.5L ,l Extaq 013L ,l 1L l 的dNTP (2.5L m o l/L )用dd H 2O 补足至25L l 。

扩增条件为:94e 5m i n ,94e 1m i n ,55e 30s ,72e 30s ,40个循环;72e 10m in ,取8L l 目的基因扩增产物和4L lGAPDH 扩增产物在1%的琼脂糖凝胶上进行电泳。

3.用RT -PCR 钓取的正常对照组FM R1基因与甲基化封闭后被弗斯科林重新活化的基因片段均送公司测序,并将结果在PU B M ED 数据库中进行比对。

结果1.封闭效果与硝普钠用量比较如图所示S N P 能使P M BC 、K -562、PC12三种细胞内F M R 1基因封闭,但所需要的S N P 最低浓度有所不同。

P M-BC 细胞所需最低浓度较低为:500L m ol/L;K -562与PC12细胞所需浓度相同均为1000L mo l/L ,见图1(A 、B 、C)。

图1A:不同浓度SNP 对人P M BC 细胞 图1B :不同浓度S N P 对人PC12细胞 图1C :不同浓度S N P 对人K -562细胞F M R 1mRNA 表达的影响 FM R1mRNA 表达的影响 FMR 1mRNA表达的影响图2A 不同时间点S N P 对人PB M C 细胞 图2B 不同时间点SNP 对PC12细胞 图2C:不同时间点SNP 对人K -562细胞F M R 1mRNA 表达的影响 FM R1mRNA 表达的影响 FMR 1mRNA表达的影响图3A 不同时间点FS K 对人PB M C 细胞 图3B 不同时间点FSK 对PC12细胞 图3C 不同时间点FSK 对人k-562细胞F M R 1mRNA 表达的影响 FM R1mRNA 表达的影响 FMR 1mRNA 表达的影响(上述图片中电泳结果约500bp 的为F M R I 基因扩增片段;约250bp 的为内参照GAPD H 扩增片段) 2.封闭维持时间比较如图所示对于PM BC 、K -562、PC12三种细胞,一次加用适宜浓度SNP 后可达到满意基因封闭效果,封闭时限K -562细胞可长达96h ,P M BC 与PC12细胞均可达72h 。

但三种细胞SNP 起效均从24h 开始,见图2。

另外我们还在RT -PCR 结果显示目的基因的扩增片段重新出现之前24h ,更换重新加入相应浓度的SNP 新鲜培养基,之后继续培养24h 收集细胞。

结果显示换液后FM R1基因可持续封闭,见图2(A 、B 、C )。

3.FS K 诱导3种细胞模型FMR 1基因封闭后重新表达效果比较如图所示FSK 可使P M BC 、K -562、PC12三种细胞内封闭的FMR 1基因重新启动,起效时限均在24h ,但持续时间有所不同PM BC 、PC12细胞达72h ,K -562细胞较短仅48h ,见图3(A 、B 、C)。

4.PCR 产物测序结果:经PU B M ED 数据库比对,与F M R 1基因的相似度达100%。

讨论F M R1基因上游启动子区有一个CpG 岛,内含一段M SE序列,该序列具有增强转录活性的作用。

如果该序列发生甲基化,则可阻断其与转录因子的结合,从而终止转录。

在启动子和一号外显子之间有三核苷酸重复序列,即(CGG )n ,如果n 扩增至大于200,转录无法进行,称为完全突变,从而表现为F ra(X )。

有关(CGG )n 的扩增与Cp G 岛异常甲基化二者之间的具体关系尚未明确。

但P ietrobono R 发现在无DNA 甲基化的情况下,CGG 重复序列的扩增本身并不阻止FMR 1的翻译以及F M RP 的产生。

已有病例报道,患者FMR 1基因(C GG )n 已扩增至完全突变,但由于Cp G 岛未甲基化,F M RP 仍能正常表达,所以智力表现正常。

从而提示异常甲基化也许是使F M R1基因转录沉默和相应蛋白表达缺如的主要原因[4]。

真核细胞基因的甲基化水平主要与DNA 甲基转移酶(DNA M eT ase)的活性有关,S N P 为经典的一氧化氮(NO )供体,可通过产生的NO 活化DNA M eT ase ,使F M R1启动子区CpG 岛的M SE 中的胞嘧啶发生高度甲基化,阻断了转录因子与启动子的结合,从而抑制了FMR1mRNA的转录,所以F M R1封闭后RT-PCR产物中无目的条带出现。