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如何测量RNA的纯度和含量

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问题：
假如你有一份RNA样品，体积为10µL，需要测其样品的浓度和纯度，应该如何做？请写出测定的原理和方法。

【原理】
使用光密度测定法测量其浓度，RNA在260nm处有一很高的吸收峰，利用这个原理我们测其OD
260，再推算出其浓度。

使用DNA/RNA浓度测定仪，测定样品A260和
A280值。

根据A260/ A280比值，估测RNA质量。

一般A260/ A280比值在
1.8-
2.0之间，可以满足实验要求。

在100µl RNA原液中取1μl稀释至250μl（DEPC处理的水），测定样品的A260和A280的值，按下列公式计算其浓度：
RNA原液浓度=A260×稀释倍数×40（n g/μl）
【仪器】
分光光度计(紫外可见光两用)。

【试剂】
水、RNA溶液
【方法步骤】
测定RNA浓度按以下步骤进行操作：
⑴在10μl的RNA原液取1μl ，放在
0.5mlEP管中，加入249μl dd H2O，用移液枪反复混匀。

⑵用dd H2O为空白对照，调节A260零点。

⑶倒掉比色杯中的水，加入稀释并混合均匀的RNA样液，测定A260值。

倒掉比色杯中的RNA样液，用dd H2O冲洗比色杯，再调节A280零点。

⑷倒掉比色杯中的水，加入稀释并混合均匀的RNA样液，测定A280值。

计算A260/ A280比值，比值≥
1.8，满足实验要求。

⑸ RNA原液浓度=A260×稀释倍数×40（n g/μl）
测定RNA纯度按以下步骤进行操作：
(1)取4ulRNA样品加水到1ml。

(2)用1ml水做空白。

(3)把样品杯放在分光光度计比色槽上。

(4)每µl中RNA浓度(ug)将是OD值的10倍，例如稀释后样品在260nm处OD值为
0.2，则原RNA样品浓度为2ug／µl。

(5)再测一次280nm处OD值，计算二者的比率，若比率接近2，则说明样品中核酸比较纯。

若比率小于
1.6，则说明蛋白或其它吸收此波长的杂质在其中，再用酚／氯仿抽提继以乙醇沉淀以除去杂质。

(6)如果想检测样品中是否残存酚等有机杂质，那么还要测定一次230nm处OD值。

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总RNA 的提取电泳检测及浓度和纯度的测定

总RNA 的提取电泳检测及浓度和纯度的测定

总RNA 的提取、电泳检测及浓度和纯度的测定撰写人：黄晶一、实验原理1、总RNA的提取见分子克隆（第三版）上册P522 “用一步法从细胞和组织中同时制备DNA、RNA和蛋白质”2、RNA的电泳见分子克隆（第三版）上册P540 “按大小分离RNA: 在含有甲醛的琼脂糖凝胶上进行的RNA电泳”3、RNA的浓度及纯度测定见分子克隆（第三版）下册P1695 “DNA或RNA的分光光度法测定”二、实验准备1、配制0.1%的DEPC水，37℃培养箱内放置过夜，之后灭菌两次。

2、准备大、中、小进口枪头各一盒，1.5ml进口离心管、0.2ml 进口PCR管各一瓶，灭菌两次（公用）3、准备研钵（n）、勺子（n+1）、50ml、100ml量筒各一个，180℃烤4小时以上（n=提取RNA的个数）4、10×MOPS缓冲液、甲醛、30％双氧水、胶布、氯仿（sigma）、异丙醇（sigma）、75％乙醇（以上试剂及物品公用，实验前请确定其是否齐备）三、实验步骤（一）总RNA的提取1．液氮研磨组织，取100mg组织，加入1ml Trizol，室温放置5min2．加入200ul氯仿，剧烈振荡混匀，室温放置3min，之后4℃，12000g,离心15min 3．上清移入新管，加入1/5体积的氯仿，剧烈振荡混匀，室温放置3min, 之后4℃，12000g,离心15min4．上清移入新管，加入等体积的异丙醇，混匀，室温放置10min,之后4℃，12000g,离心15min5．弃上清，加入1ml 75%乙醇，振荡，4℃，7500g,离心5min6．弃上清，室温晾干，之后加入40ul DEPC水溶解（RNA不要完全干燥，否则不利于溶解）（二）RNA的电泳1．用3％-30％的双氧水浸泡RNA专用的电泳槽及胶板、梳子10分钟以上2．之后用0.1%的DEPC水洗涤3．配制1.2%的含有甲醛的琼脂糖凝胶1）称取0.36g RNA专用的琼脂糖，加入24ml DEPC水，熔化后冷却到60℃2）加入3ml 10×MOPS，混匀后再加入3ml甲醛，之后再加入3ul EB4．用DEPC水配制1×MOPS 100ml作为电泳缓冲液，55V 预电泳30-40min5. RNA电泳样品的制备1）将6ul RNA样品、1ul 10×MOPS、1ul甲醛、2ul RNA上样缓冲液混匀2）65℃加热10min,之后冰浴2min,短暂离心后可上样6．60V 电泳30-40min7．紫外检测（三）RNA浓度及纯度的测定1. 运行分光光度计中测定RNA的程序2. 200ul DEPC水作为空白, 5ul RNA样品+295ul DEPC水作为测量样品3. 测量的RNA样品的OD260/280应在1.8-2.0之间4. RNA样品的实际浓度等于分光光度计显示浓度ｘ60四、注意事项1. 整个实验过程中要戴口罩、一次性手套，一次性手套应经常更换，防止污染RNase2. 实验试剂及物品大多数为公用，请养成良好的实验习惯，用毕放回原处，试剂或物品用完或快用完，告知负责人，及时补充3．烤箱不能过夜工作，以免发生火灾4．DEPC为疑似致癌物，操作时应戴口罩、手套，小心吸取，避免污染实验台及物品注：10×MOPS的配制方法0.627g MOPS溶于12ml DEPC水中，加入1.2ml 1M NaAc (DEPC水配制)，用2M NaOH 调pH 7.0, 加入0.75ml 0.2M EDTA, 之后加入DEPC水定容为15ml。

RNA纯度的测定

RNA纯度的测定

1）检测RNA溶液的吸光度280、320、230、260nm下的吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度）、盐浓度和蛋白等有机物的值。

一般的，我们只看OD260/OD280（Ratio，R）。

~时，我们认为RNA中蛋白或者时其他有机物的污染是可以容忍的，不过要注意，当你用Tris 作为缓冲液检测吸光度时，R值可能会大于2（一般应该是<的）。

当R<时，溶液中蛋白或者时其他有机物的污染比较明显，你可以根据自己的需要决定这份RNA的命运。

当R>时，说明RNA已经水解成单核酸了。

如果RNA的量够，可在260nm（A260）用分光光度法测定RNA的得率，1个单位等于40ug/mlssRNA。

纯RNA的A260/A280的比值为。

A260/A230的比值还表明RNA的纯度，其值小于表明裂解液中有亚硫氰胍和belta-巰基乙醇残留，其值大于，需用乙酸盐，乙醇沉淀RNA。

2）RNA的电泳图谱一般的，RNA的电泳都是用变性胶进行的，但是根据我的经验，如果你仅仅是为了检测RNA 的质量是没有必要进行如此麻烦的实验的，用普通的琼脂糖胶就可以了。

电泳的目的是在于检测28S和18S条带的完整性和他们的比值，或者是mRNA smear的完整性。

一般的，如果28S和18S条带明亮、清晰、条带锐利（指条带的边缘清晰），并且28S 的亮度在18S条带的两倍以上，我们认为RNA的质量是好的（见下图）。

以上是我们常用的两种方法，但是这两种方法都无法明确的告诉我们RNA溶液中有没有残留的RNA酶。

如果溶液中有非常微量的RNA酶，用以上方法我们很难察觉，但是大部分后续的酶学反应都是在37度以上并且是长时间进行的。

这样，如果RNA溶液中有非常微量的RNA 酶，那么在后续的实验中就会有非常适合的环境和时间发挥它们的作用了，当然这时你的实验也就完了。

下面，我们介绍一个可以确认RNA溶液中有没有残留的RNA酶的方法。

3）保温试验方法很简单的，按照样品浓度，从RNA溶液中吸取两份1000 ng的RNA加入至 ml的离心管中,并且用的Tris缓冲液补充到10 ul的总体积，然后密闭管盖。

总RNA 的提取电泳检测及浓度和纯度的测定

总RNA 的提取电泳检测及浓度和纯度的测定

总RNA 的提取、电泳检测及浓度和纯度的测定撰写人：黄晶一、实验原理1、总RNA的提取见分子克隆（第三版）上册P522 “用一步法从细胞和组织中同时制备DNA、RNA和蛋白质”2、RNA的电泳见分子克隆（第三版）上册P540 “按大小分离RNA: 在含有甲醛的琼脂糖凝胶上进行的RNA电泳”3、RNA的浓度及纯度测定见分子克隆（第三版）下册P1695 “DNA或RNA的分光光度法测定”二、实验准备1、配制0.1%的DEPC水，37℃培养箱内放置过夜，之后灭菌两次。

2、准备大、中、小进口枪头各一盒，1.5ml进口离心管、0.2ml 进口PCR管各一瓶，灭菌两次（公用）3、准备研钵（n）、勺子（n+1）、50ml、100ml量筒各一个，180℃烤4小时以上（n=提取RNA的个数）4、10×MOPS缓冲液、甲醛、30％双氧水、胶布、氯仿（sigma）、异丙醇（sigma）、75％乙醇（以上试剂及物品公用，实验前请确定其是否齐备）三、实验步骤（一）总RNA的提取1．液氮研磨组织，取100mg组织，加入1ml Trizol，室温放置5min2．加入200ul氯仿，剧烈振荡混匀，室温放置3min，之后4℃，12000g,离心15min 3．上清移入新管，加入1/5体积的氯仿，剧烈振荡混匀，室温放置3min, 之后4℃，12000g,离心15min4．上清移入新管，加入等体积的异丙醇，混匀，室温放置10min,之后4℃，12000g,离心15min5．弃上清，加入1ml 75%乙醇，振荡，4℃，7500g,离心5min6．弃上清，室温晾干，之后加入40ul DEPC水溶解（RNA不要完全干燥，否则不利于溶解）（二）RNA的电泳1．用3％-30％的双氧水浸泡RNA专用的电泳槽及胶板、梳子10分钟以上2．之后用0.1%的DEPC水洗涤3．配制1.2%的含有甲醛的琼脂糖凝胶1）称取0.36g RNA专用的琼脂糖，加入24ml DEPC水，熔化后冷却到60℃2）加入3ml 10×MOPS，混匀后再加入3ml甲醛，之后再加入3ul EB4．用DEPC水配制1×MOPS 100ml作为电泳缓冲液，55V 预电泳30-40min5. RNA电泳样品的制备1）将6ul RNA样品、1ul 10×MOPS、1ul甲醛、2ul RNA上样缓冲液混匀2）65℃加热10min,之后冰浴2min,短暂离心后可上样6．60V 电泳30-40min7．紫外检测（三）RNA浓度及纯度的测定1. 运行分光光度计中测定RNA的程序2. 200ul DEPC水作为空白, 5ul RNA样品+295ul DEPC水作为测量样品3. 测量的RNA样品的OD260/280应在1.8-2.0之间4. RNA样品的实际浓度等于分光光度计显示浓度ｘ60四、注意事项1. 整个实验过程中要戴口罩、一次性手套，一次性手套应经常更换，防止污染RNase2. 实验试剂及物品大多数为公用，请养成良好的实验习惯，用毕放回原处，试剂或物品用完或快用完，告知负责人，及时补充3．烤箱不能过夜工作，以免发生火灾4．DEPC为疑似致癌物，操作时应戴口罩、手套，小心吸取，避免污染实验台及物品注：10×MOPS的配制方法0.627g MOPS溶于12ml DEPC水中，加入1.2ml 1M NaAc (DEPC水配制)，用2M NaOH 调pH 7.0, 加入0.75ml 0.2M EDTA, 之后加入DEPC水定容为15ml。

RNA含量测定

RNA含量测定

RNA的提取及含量测定班级：生科09级03班高山山学号：200900140024一）实验目的：1、掌握用紫外分光光度计法测定RNA的原理和方法。

2、掌握紫外分光光度计的用法及操作。

3、掌握稀碱法提取酵母RNA的原理和方法。

二）实验原理：酵母核算中RNA含量较多，DNA则少于2%。

RNA可溶于碱性溶液，当碱被中和后，可加乙醇使其沉淀，由此即可得到粗RNA制品。

（用碱液提取的RNA 有不同的降解）核酸在260nm的电磁波下，有最大的吸光度（0.022-0.024），是区别于其他有机物的重要物理性质，且其吸光度与浓度成正比。

利用此性质，可用RNA标准液绘制RNA吸光标准曲线，测定样品RNA浓度。

三）实验器材：1、粗制RNA（实验62所提取RNA）2、试管1.5×15cm（×12）3、吸管：2.0ml(×1)、5.0ml(×1)4、722型分光光度计5、RNA标准液6、NaOH溶液PH试纸7、干酵母粉8、电子天平9、2%NaOH溶液：2gNaOH溶于水。

10、苔黑粉-三氯化铁试剂四)实验操作：1、RNA的提取2、RNA样液的配制取粗RNA0.2200g，加入5mlNaOH溶液，搅拌，溶解。

再加入蒸馏水40ml，搅拌混匀，调PH至7.0后，放入100ml容量瓶中定容。

再分3次分别取2ml 定容后溶液与100ml容量瓶中定容待测。

3、RNA标准曲线的绘制表一溶液的配制编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 RNA标准液0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 2.4 2.8 3.2 0 0 0样液（ml）0 0 0 0 0 0 0 0 0 8 8 8蒸馏水（ml）8 7.6 7.2 6.8 6.4 6.0 5.6 5.2 4.8 0 0 0浓度（ug/ml）0 5 10 15 20 25 30 35 40 待测待测待测260nm五）实验结果：1、RNA提取结果：最终得到0.22g黄色块状固体。