HPLC测定有关物质和含量方法验证小结
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HPLC法检测匹可硫酸钠的有关物质
目录摘要 (4)Abstract (4)引言 (5)1. 仪器与试剂 (6)仪器 (6)试剂 (6)2. 检测方式 (6)色谱条件 (6)测定方式 (7)供试品溶液配制 (7)样品的测定 (7)实验结果 (7)3. 方式学验证 (7)方式专属性 (8)目的 (8)操作方式 (8)可同意标准 (8)方式专属性测试结果 (8)样品图谱如下 (9)系统适应性实验 (10)目的 (11)操作方式 (11)可同意标准 (11)实验结果 (11)检测限测试 (11)目的 (11)操作方式 (12)可同意标准 (12)实验结果 (12)最小定量限测试 (12)目的 (12)操作方式 (12)可同意标准 (12)实验结果 (12)验证范围的线性 (13)目的 (13)操作方式 (13)可同意标准 (13)线性数据 (13)验证范围内的方式周密度 (14)目的 (14)操作方式 (15)可同意标准 (15)方式周密度测试数据 (15)4.讨论 (15)检测波长的确信 (15)色谱柱的选择 (16)流动相的选择 (16)5.结论 (16)参考文献 (16)致谢.............................................................................................................................. 错误!未定义书签。
HPLC法检测匹可硫酸钠的有关物质摘要目的：确保匹可硫酸钠有关物质检测方式准确、重现并耐用，为成立查验操作程序提供依据。
方式：采纳高效液相色谱法( HPLC)测定匹克硫酸钠有关物质，以Boston C18柱(250mm×，5μm）作为分析色谱柱，以乙腈为流动相A,以mol·L-1磷酸盐溶液（用NaOH调PH值至）为流动相B;流速为·min-1，进样量20μL，检测波长为263nm，柱温30℃；结果：该方式重复性较好，周密度高，匹可硫酸钠有关物质4，4-（2-吡啶亚甲基）双酚浓度在μg·mL-1 ～294μg·mL-1范围内线性良好（r=）；结论：本文所成立的高效液相色谱法检测匹可硫酸钠有关物质，方式简捷、省时，结果准确靠得住，可成为匹可硫酸钠更科学的的质量操纵依据。
HPLC测定蛋白质含量方法验证
A：0.1%三氟乙酸的水溶液
B： 0.1%三氟乙酸的乙腈溶液
含量计算公式
供试品蛋白质含量（ug/ml)= CR×AX×nX
AR×nR
式中 CR为复溶所得标准品溶液的蛋白质含量， ug/ml； AR为标准品溶液的平均峰面积； AX为供试品溶液的平均峰面积；
nR为标准品溶液的稀释倍数；
nX为供试品溶液的倍数；
/
/ 原液批2 成品批4 成品批5
标准品
标准品 供试品 供试品 供试品
150
300 300 300 150
3715.15 3722.89
3478.19 3500.13 3424.81 3434.33 4513.68 4538.38 4273.84 4333.33
1.27
0.93 1.84 1.28 1.26
25.511
25.537 25.561
25.534
25.567 25.581
0.032
0.077 0.062
0.056
0.061 0.033
原液批2
成品批3 成品批4 成品批5
供试品
供试品 供试品 供试品
300
300 150 75
25.554
25.538 25.579 25.564
25.544
25.536 25.667 25.818
方法比较（lowry与HPLC）
批序号
原液批1 原液批2 原液批3 原液批4 原液批5 原液批6 原液批7 原液批8
lowry法（ug/ml)
1477 1393 1432 1466 1389 1456 1395 1428
HPLC法(ug/ml)
1417 1358 1379 1413 1327 1415 1352 1386
含量和有关物质方法验证
对照液1份；本底供试液1份；
供试液3份
每份2针；
每份2针；
每份3针
平均回收率均应在80%-120%之间，9个回收率RSD＜10%
检测限与定量限
均指试样中的被分析物能够被检测到的最低量；检测限不一定要准确定量；定量限测定结果应具有一定的准确度和精密度
1%对照检测限、定量限
基线1针；
检测限2针；
定量限6针
仪器精密度
在同样的操作条件下，在较短时间间隔内，由同一分析人员测定所得结果的精密度
1%对照液仪器精密度
进6针
峰面积Rபைடு நூலகம்D≤2.0%
供试液仪器精密度
进6针（同系统适用性）
峰面积RSD≤2.0%，保留时间RSD≤1.0%
方法精密度
供试液6份
每份1针
杂质含量RSD≤15%
中间精密度
同一实验室，由于实验室内部条件改变，如时间、分析人员、仪器设备、测定结果的精密度
含量方法学验证主要包括：
系统适用性、方法专属性、精密度（仪器精密度、方法精密度和中间精密度）、线性、准确度、溶液稳定性和耐用性。
试验内容
概念
溶液配制份数
进样针数
评定标准
系统适用性
系统适用性是对分析设备、电子仪器与实验操作、测试样品等整个系统进行评估的指标
供试液1份
进6针
主峰峰面积RSD≤2.0%，主峰保留时间RSD≤1.0%
仪器精密度（同系统适用性）
在同样的操作条件下，在较短时间间隔内，由同一分析人员测定所得结果的精密度
供试液1份
进6针
6份供试液峰面积RSD≤2.0%
方法精密度
供试液6份
每份1针
6份供试液响应因子RSD≤2.0%
供试液3份
每份2针；
每份2针；
每份3针
平均回收率均应在80%-120%之间，9个回收率RSD＜10%
检测限与定量限
均指试样中的被分析物能够被检测到的最低量；检测限不一定要准确定量；定量限测定结果应具有一定的准确度和精密度
1%对照检测限、定量限
基线1针；
检测限2针；
定量限6针
仪器精密度
在同样的操作条件下，在较短时间间隔内，由同一分析人员测定所得结果的精密度
1%对照液仪器精密度
进6针
峰面积Rபைடு நூலகம்D≤2.0%
供试液仪器精密度
进6针（同系统适用性）
峰面积RSD≤2.0%，保留时间RSD≤1.0%
方法精密度
供试液6份
每份1针
杂质含量RSD≤15%
中间精密度
同一实验室，由于实验室内部条件改变，如时间、分析人员、仪器设备、测定结果的精密度
含量方法学验证主要包括：
系统适用性、方法专属性、精密度（仪器精密度、方法精密度和中间精密度）、线性、准确度、溶液稳定性和耐用性。
试验内容
概念
溶液配制份数
进样针数
评定标准
系统适用性
系统适用性是对分析设备、电子仪器与实验操作、测试样品等整个系统进行评估的指标
供试液1份
进6针
主峰峰面积RSD≤2.0%，主峰保留时间RSD≤1.0%
仪器精密度（同系统适用性）
在同样的操作条件下，在较短时间间隔内，由同一分析人员测定所得结果的精密度
供试液1份
进6针
6份供试液峰面积RSD≤2.0%
方法精密度
供试液6份
每份1针
6份供试液响应因子RSD≤2.0%
有关物质方法验证
有关物质方法验证有关物质方法验证（以hplc法为例）（1）系统适用性试验系统适应性试验主要就是实地考察主成分与杂质的拆分情况以及主峰参数信息，例如理论塔板数、拖尾因子、拆分度等，均应当合乎测量建议。
空白溶液、自身对照溶液、供试品溶液各进1针。
系统精密度自身对照溶液已连续进样6次，峰面积rsd不大于2%，留存时间rsd不大于1%。
（2）专属性专属性系指在其它成分可能将并存的情况下，使用的方法能够精确测量出来被测杂质的特性。
对于原料药，可以根据其制备工艺，使用各步反应的中间体（尤其就是后3步反应的中间体）、非对映异构体、特定杂质、粗品等做为测试Fanjeaux展开系统适用性研究，实地考察产品中各杂质峰及主成分峰相互间的拆分度与否符合要求，从而检验分析方法对工艺杂质的拆分能力。
对于制剂，重点掌控水解杂质。
专属性试验（用二极管阵列检测器）1、原料药溶剂自身对照供试品起始原料合成中间体特定杂质（可能会与初始原料和制备中间体重复）混合样：将起始原料、合成中间体、特定杂质加到供试品溶液中。
特定杂质的浓度一般同限度浓度，起始原料和合成中间体的浓度一般同自身对照的浓度（如果浓度过高，可能会有杂质峰干扰）。
以上样品各入一针，主要实地考察色谱条件能够无法有效率验出杂质，以及各个峰之间的拆分情况，特别就是主峰和特定杂质峰与相连杂质峰的拆分情况。
注：在现有标准的色谱条件下，如果有的起始原料和合成中间体的峰与主峰的拆分度不符合要求或者留存时间过长，只要初始原料和制备中间体不是水解产物，可以用其它最合适的色谱条件单独掌控，如果粗品中未验出，以后可以无此掌控。
破坏试验酸、碱、高温、光照、水解、金属离子（Suippes。
通常用铁离子，因为最有可能碰触至）。
为了易于比较，同时进未毁坏的样品。
空白：酸碱空白、氧化空白，处理过程与样品的最终破坏条件相同。
热破坏：一般将样品溶液水浴加热或固体样品高温放置。
光照毁坏：如果已经搞过影响因素试验，需用光照10天的图谱替代。
HPLC法测定福多司坦口服液的含量和有关物质
ｉｎｎ），５岬）；流
ｔｏｏｌ・
１０
ｌｎｌ量瓶中，加水稀释至刻度，得储备液②。精密量取储备
动相：乙腈：水（含０．０２５ ｍｏｌ・Ｌ“辛烷磺酸钠和０．Ｏｌ ｎｍ；流速：１．０ ｍｌ：ｍｉｎ～；柱温：室温。
液①ｌ，２，５ ｍｌ置ｌＯ ｍｌ量瓶中，加水稀释到刻度；精密量取 储备液②０．５，１，５ ｍｌ置１０“量瓶中，加水稀释至刻度。量 取不同浓度的对照品溶液２０斗ｌ注入液相色谱仪，按上述色 谱条件测定，以浓度（Ｃ）为横坐标，以峰面积（Ａ）为纵坐标， 进行线性回归，回归方程为Ａ＝５．００５５Ｃ＋７．５３２３（ｒ＝０．９９９
ｍｏｌ・
９，ｎ＝６）。结果表明福多司坦在５．００—５００．１０嵋・ｍｌ“之
间时，峰面积与浓度呈良好的线性关系。 ２．５精密度试验 精密量取线性项下浓度为１００．０２ ｐ，ｇ・ｍｌ“的对照品溶 液２０一连续进样６次，计算峰面积的ＲＳＤ为０．８７％。 ２．６最低检测限和最低定量限 取对照品溶液，不断稀释并取样检测，按信噪比法得出， 其检测限为４ ｎｇ，定量限为２０ ２．７回收率试验 分别精密称取福多司坦对照品约３２０，４００，４８０ ｎａｇ（各３ 份），置５ ｍｌ量瓶中，按处方量加入辅料，加水溶解并稀释至 刻度，摇匀得溶液①，精密吸取溶液①３ ｍｌ置２５“量瓶中， 加水溶解并稀释至刻度得溶液②。再精密移取溶液②ｌ Ｉｎｌ置
ｍｎ）×４．６
５ １０ １５ Ｄ ２０ ２５ ５ １０ １５ Ｅ ２０ ２５ ５ １０ １５ Ｆ ２０ ２５ ｔ／ｍｉｎ
ｄｂ彳；；千＝；Ｆ；亓；彳
５ １０ １５ ＾ ２０ ２５ ５ １０ １５ Ｂ ２０ ２５ ５ １０ １５ ２０ ２５ ｔ／ｒａｉｎ
Ｃ
Ａ．空白辅料Ｂ．未破坏样品Ｃ．酸破坏 Ｄ．碱破坏Ｅ．氧化破坏Ｆ．高温破坏 圈１ ＨＰＬＣ色谱圈
含量与有关物质分析方法验证可接受标准
含量与有关物质分析方法 验证可接受标准
耐用性
• 有关物质： 分别考察流动相比例变化±5％、流动相pH
值变化±0.2、柱温变化±5℃、检测波长变化 ±5nm、流速相对值变化±20％以及采用三根不同 批号的色谱柱进行测定时，仪器色谱行为的变化， 每个条件下各测试两次。可接受的标准为：各杂 质峰的拖尾因子不得大于2.0，杂质峰与其他成分 峰必须达到基线分离；各条件下的杂质含量数据 （n=6）的相对标准差应不大于2.0%，杂质含量 的绝对值在±0.1％以内。
含量与有关物质分析方法 验证可接受标准
准确度
• 有关物质： 验证时一般要求根据有关物质的定量限与 质量标准中该杂质的限度分别配制三个浓 度的供试品溶液各三份（例如某杂质的限 度为0.2%，则可分别配制该杂质浓度为0.1 ％、0.2％和0.3％的杂质溶液），分别测定 其含量，将实测值与理论值比较，计算回 收率，并计算9个回收率数据的RSD。
1.准确度
含量： • 该指标主要是通过回收率来反映。验证时
一般要求分别配制浓度为80％、100％和 120％的供试品溶液各三份，分别测定其含 量，将实测值与理论值比较，计算回收率。
可接受的标准为：各浓度下的平均回收 率均应在98.0%-102.0%之间，9个回收率数 据的相对标准差（RSD）应不大于2.0%。
含量与有关物质分析方法 验证可接受标准
8.系统适用性
• 含量： 配制6份相同浓度的供试品溶液进行分
析，主峰峰面积的相对标准差应不大于 2.0%，主峰保留时间的相对标准差应不大 于1.0%。另外，主峰的拖尾因子不得大于 2.0，主峰与杂质峰必须达到基线分离，主 峰的理论塔板数应符合质量标准的规定。
含量与有关物质分析方法 验证可接受标准
含量与有关物质分析方法 验证可接受标准
耐用性
• 有关物质： 分别考察流动相比例变化±5％、流动相pH
值变化±0.2、柱温变化±5℃、检测波长变化 ±5nm、流速相对值变化±20％以及采用三根不同 批号的色谱柱进行测定时，仪器色谱行为的变化， 每个条件下各测试两次。可接受的标准为：各杂 质峰的拖尾因子不得大于2.0，杂质峰与其他成分 峰必须达到基线分离；各条件下的杂质含量数据 （n=6）的相对标准差应不大于2.0%，杂质含量 的绝对值在±0.1％以内。
含量与有关物质分析方法 验证可接受标准
准确度
• 有关物质： 验证时一般要求根据有关物质的定量限与 质量标准中该杂质的限度分别配制三个浓 度的供试品溶液各三份（例如某杂质的限 度为0.2%，则可分别配制该杂质浓度为0.1 ％、0.2％和0.3％的杂质溶液），分别测定 其含量，将实测值与理论值比较，计算回 收率，并计算9个回收率数据的RSD。
1.准确度
含量： • 该指标主要是通过回收率来反映。验证时
一般要求分别配制浓度为80％、100％和 120％的供试品溶液各三份，分别测定其含 量，将实测值与理论值比较，计算回收率。
可接受的标准为：各浓度下的平均回收 率均应在98.0%-102.0%之间，9个回收率数 据的相对标准差（RSD）应不大于2.0%。
含量与有关物质分析方法 验证可接受标准
8.系统适用性
• 含量： 配制6份相同浓度的供试品溶液进行分
析，主峰峰面积的相对标准差应不大于 2.0%，主峰保留时间的相对标准差应不大 于1.0%。另外，主峰的拖尾因子不得大于 2.0，主峰与杂质峰必须达到基线分离，主 峰的理论塔板数应符合质量标准的规定。
含量与有关物质分析方法 验证可接受标准
含量与有关物质分析方法 验证可接受标准
含量及有关物质分析方法验证的可接受标准
有关物质： 杂质峰与噪音峰信号的强度比应不得小于3。
6.定量限
含量： 主峰与噪音峰信号的强度比应不得小于10。 另外，配制6份最低定量限浓度的溶液，所测6份 溶液主峰的保留时间的相对标准差应不大于2.0%。 有关物质： 杂质峰与噪音峰信号的强度比应不得小于10。 另外，配制6份最低定量限浓度的溶液，所测6份 溶液杂质峰保留时间的相对标准差应不大于2.0%， 峰面积的相对标准差应不大于5.0%。
8.系统适用性
含量： 配制6份相同浓度的供试品溶液进行分析， 主峰峰面积的相对标准差应不大于2.0%，主 峰保留时间的相对标准差应不大于1.0%。另 外，主峰的拖尾因子不得大于2.0，主峰与杂 质峰必须达到基线分离，主峰的理论塔板数应 符合质量标准的规定。
系统适用性
有关物质： 配制6份相同浓度的杂质溶液进行分析， 该杂质峰峰面积的相对标准差应不大于2.0%， 保留时间的相对标准差应不大于1.0%。另外， 杂质峰的拖尾因子不得大于2.0，理论塔板数 应符合质量标准的规定。
准确度
有关物质： 验证时一般要求根据有关物质的定量限与质 量标准中该杂质的限度分别配制三个浓度的供 试品溶液各三份（例如某杂质的限度为0.2%， 则可分别配制该杂质浓度为0.1％、0.2％和0.3 ％的杂质溶液），分别测定其含量，将实测值 与理论值比较，计算回收率，并计算9个回收 率数据的RSD。
线性
可接受的标准为：回归线的相关系数（R）不 得小于0.998，Y轴截距应在100％响应值的2 ％以内，响应因子的相对标准差应不大于 2.0%。
线性
有关物质： 在定量限至一定的浓度范围内配制6份浓 度不同的供试液，分别测定该杂质峰的面积， 计算相应的含量。以含量为横坐标（X），峰 面积为纵坐标（Y），进行线性回归分析。 可接受的标准为：相关系数（R）不得小 于0.990，Y轴截距应在100％响应值的25％以 内，响应因子的相对标准差应不大于10%。
HPLC法测定对乙酰氨基酚含量验证方案
按上述色谱条件进样，计算回收率及回收率平均值和相对标准偏差。
结果要求：平均回收率在95.0%-102.0%，RSD≦1.0%。
（五）样品含量测定
取对乙酰氨基酚供试品适量，精密称定，按“供试品溶液的制备”项下制备供试品溶液和“对照品溶液的制备”项下制备对照品溶液，按“色谱条件”项下的条件进行进样测定，记录色谱图，按外标法计算含量。
根据《中国药典》二部规定，按干燥品计算，含对乙酰氨基酚应为98.0%-102%。
四、设计小结
高效液相色谱法测定对乙酰氨基酚的含量，在检测的过程中方法简单便于操作，且测定方准确度高，稳定性较好。
本设计方案运用高效液相色谱法测定对乙酰氨基酚的含量，HPLC 法专属性强，重现性较好、稳定性较好，准确度和回收率较高，可以作为对乙酰氨基酚片的质量控制方法，用来提高对乙酰氨基酚的质量标准。
利用甲醇-水溶液的配比作为流动相进行检测，再利用试液进样前应用0.22μm微孔滤膜过滤，以除去流动相中的微小杂质，这样可以较大提升试验的准确性。
五、附件材料
图1高效液相色谱仪图2 分析天平
六、参考资料。
HPLC法测定原料药磷酸芦可替尼的含量和有关物质
Tech Company with the use of Inertsil ODS -3 250 L ×4. 6 mm 5 μm, the mobile phase was methanol -water (6040) ,
the flow rate was 1. 0 mL · min -1 , detecting wavelength was 220 nm. The results showed the calibration curve of
色谱柱。
1. 2 试 药
磷酸芦可替尼对照品 (201812001R) 、 杂质对照品 B、 C、
第一作者: 沈红梅(1970-) , 女, 高级工程师, 主要从事药学研究和应用。
D、 E 及三批样品(20190101、 20190102、 20190402) 均由科伦药
供参考。
1 仪器与试药
1. 1 仪 器
Aglient 1260 液 相 色 谱 仪, 二 极 管 阵 列 SPD - 10MAVP
( DAD) 检 测 器 及 Aglient 1260 紫 外 检 测 器, 定 量 进 样 阀,
Aglient 1260 色谱工作站; Inertsil ODS-3 250 L×4. 6 mm, 5 μm
量, 加稀释剂溶解并稀释制成每 1 mL 中约含磷酸芦可替尼及
杂质 B、 C、 D、 E 均为 50 μg 的溶液, 作为线性贮备液; 分别
精密量取该 溶 液 0. 5、 1. 0、 2. 0、 3. 0、 5. 0 置 50 mL 量 瓶 中,
加稀释剂稀释至刻度, 摇匀, 分别取 10 μL 注入液相色谱仪,
1. 18
杂质 B / % 杂质 D / % 总杂质 / %
the flow rate was 1. 0 mL · min -1 , detecting wavelength was 220 nm. The results showed the calibration curve of
色谱柱。
1. 2 试 药
磷酸芦可替尼对照品 (201812001R) 、 杂质对照品 B、 C、
第一作者: 沈红梅(1970-) , 女, 高级工程师, 主要从事药学研究和应用。
D、 E 及三批样品(20190101、 20190102、 20190402) 均由科伦药
供参考。
1 仪器与试药
1. 1 仪 器
Aglient 1260 液 相 色 谱 仪, 二 极 管 阵 列 SPD - 10MAVP
( DAD) 检 测 器 及 Aglient 1260 紫 外 检 测 器, 定 量 进 样 阀,
Aglient 1260 色谱工作站; Inertsil ODS-3 250 L×4. 6 mm, 5 μm
量, 加稀释剂溶解并稀释制成每 1 mL 中约含磷酸芦可替尼及
杂质 B、 C、 D、 E 均为 50 μg 的溶液, 作为线性贮备液; 分别
精密量取该 溶 液 0. 5、 1. 0、 2. 0、 3. 0、 5. 0 置 50 mL 量 瓶 中,
加稀释剂稀释至刻度, 摇匀, 分别取 10 μL 注入液相色谱仪,
1. 18
杂质 B / % 杂质 D / % 总杂质 / %
HPLC测定有关物质和含量方法验证
HPLC测定有关物质和含量方法验证1．有关物质（适用于API，制剂，也适用于起始物料，中间体）有关物质方法验证的前提条件：1.各杂质与主峰的混合溶液能用拟定的分析方法有效分离2.根据混合溶液中各峰的紫外吸收波长（或单独测定各组分紫外吸收），选择合适的检测波长。
多波长检测（如有）则分别考察。
3.在检测波长下，选择峰高最小的，计算S/N，预估主成分浓度4.各杂质纯度已知5.根据合成跟踪检测，合理制定各杂质的限度6.供试品溶解方法和提取方法得到合理证明1.1专属性：1.1.1概念在其他成分（如其他杂质，辅料，溶剂）可能存在的情况下，拟定的分析方法能正确测定被检测物的能力。
1.1.2试验方法1.1.2.1定位试验：A.目的对各已知杂质和主峰进行定位B.试验方法：a．配制一定浓度（能够显示出峰纯度，一般为0.1mg/ml）的各已知杂质溶液、拟检测浓度的主成分作为定位溶液b．配制限度浓度各已知杂质与检测浓度的主成分的混合溶液作为分离度试验溶液c．使用拟定分析方法分别进行定位。
C.试验要求：a．空白应不干扰各杂质的测定：如杂质附近有空白峰，二者分离度应大于1.5；杂质峰保留时间处不得为梯度峰拐点b．定位溶液中，已知杂质与主峰的峰纯度应符合规定c．分离度试验溶液中，主峰与相邻杂质的分离度应大于2.0（至少1.5）；各已知杂质之间的分离度应大于1.5（至少1.2）；1.1.2.2强制降解试验A.目的一是通过考察药品在一系列剧烈条件下的稳定性，了解该药品内在的稳定特性及其降解途径与降解产物。
其二，这些试验也能在一定程度上对有关物质分析方法用于检查降解产物的专属性进行验证。
B.试验方法对于高温、光照、强酸、强碱及强氧化剂的浓度及时间、取样方式等没有明确的规定。
具体品种具体模索，初步试验了解样品对影响的因素（高温、光照、酸、碱、氧化）等条件基本稳定情况后，进一步调整破坏试验条件，只要使主药有一定量的降解，并对可能的降解途径和降解机制进行分析，保证实验的意义即可。
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本贴的目的：讨论目前审评尺度下，药品研发过程中，分析方法的验证项目及目的，试验方法，试验要求本帖仅仅针对于HPLC方法进行讨论方法开发的内容不在本帖讨论范围内1．有关物质（适用于API，制剂，也适用于起始物料，中间体）有关物质方法验证的前提条件：1.各杂质与主峰的混合溶液能用拟定的分析方法有效分离2.根据混合溶液中各峰的紫外吸收波长（或单独测定各组分紫外吸收），选择合适的检测波长。
多波长检测（如有）则分别考察。
3.在检测波长下，选择峰高最小的，计算S/N，预估主成分浓度4.各杂质纯度已知5.根据合成跟踪检测，合理制定各杂质的限度6.供试品溶解方法和提取方法得到合理证明1.1专属性：1.1.1概念在其他成分（如其他杂质，辅料，溶剂）可能存在的情况下，拟定的分析方法能正确测定被检测物的能力。
1.1.2试验方法1.1.2.1定位试验：A.目的对各已知杂质和主峰进行定位B.试验方法：a．配制一定浓度（能够显示出峰纯度，一般为0.1mg/ml）的各已知杂质溶液、拟检测浓度的主成分作为定位溶液b．配制限度浓度各已知杂质与检测浓度的主成分的混合溶液作为分离度试验溶液c．使用拟定分析方法分别进行定位。
C.试验要求：a．空白应不干扰各杂质的测定：如杂质附近有空白峰，二者分离度应大于1.5；杂质峰保留时间处不得为梯度峰拐点b．定位溶液中，已知杂质与主峰的峰纯度应符合规定c．分离度试验溶液中，主峰与相邻杂质的分离度应大于2.0（至少1.5）；各已知杂质之间的分离度应大于1.5（至少1.2）；1.1.2.2强制降解试验A.目的一是通过考察药品在一系列剧烈条件下的稳定性，了解该药品内在的稳定特性及其降解途径与降解产物。
其二，这些试验也能在一定程度上对有关物质分析方法用于检查降解产物的专属性进行验证。
B.试验方法对于高温、光照、强酸、强碱及强氧化剂的浓度及时间、取样方式等没有明确的规定。
具体品种具体模索，初步试验了解样品对影响的因素（高温、光照、酸、碱、氧化）等条件基本稳定情况后，进一步调整破坏试验条件，只要使主药有一定量的降解，并对可能的降解途径和降解机制进行分析，保证实验的意义即可。
试验一般的范围为：强酸：0.1~5.0mol/L HCl溶液或视情况调节时间，温度，体积强碱：0.1~5.0mol/L NaOH溶液或视情况调节时间，温度，体积强氧化剂：30%的H2O2或视情况配制不同浓度的溶液或视情况调节时间，温度高温：固体状态下稳定的主药，可以考虑溶解后以液体状态进行试验光照：固体状态下稳定的主药，可以考虑溶解后以液体状态进行试验C.试验要求a.一般样品含量控制在85%—90%范围（归一化法），不一定要求每个条件都能降解出来。
b.在进行酸、碱、强氧化破坏试验时，每个试验最好都要做相应的空白（溶剂，空白辅料，复方制剂还包括除去某一主药的其他组分）破坏试验作为辅助。
c.主峰纯度符合规定，与相邻杂质分离度大于2.0（至少1.5），已知杂质与相邻杂质分离度大于1.2d.物料守恒，即未破坏主药的C/A与破坏后的C/A值相比，结果在0.9~1.1之间e.关于破坏试验，更多内容请参阅lyslinjiu版主在帖子【讨论】2013-专属性实验（强制降解试验）2013-专属性实验（强制降解试验）- 丁香园论坛f.在此处做梯度时间（如有）延长验证试验。
即将分析方法的梯度中，有机相比例最大的时长延长（建议延长时间为主峰保留时间或10~20min），考察是否降解出难以洗脱的物质在拟定方法的梯度周期内能有效检出。
进一步考察分析方法的合理性1.2定量限1.2.1概念样品中能被定量测定的最低量，有定量意义。
1.2.2验证方法A.目的考察杂质的能被定量的最低量，同时评判供试品浓度的选择是否合理B.试验方法配制限度浓度的各已知杂质与主成分的混合溶液作为贮备液，进样，逐步稀释至S/N约为10时，得定量限。
C.试验要求定量限浓度不得高（修正，原为低）于限度浓度的1/51.3检测限1.3.1概念样品中能被检测出的最低量，仅作为限度试验指标和定性鉴别的依据，没有定量意义。
1.3.2验证方法A.目的考察杂质的最低检出量，同时评判供试品浓度的选择是否合理B.试验方法配制限度浓度的各已知杂质与主成分的混合溶液作为贮备液，进样，逐步稀释至S/N约为3时，得检测限。
C.试验要求检测限浓度不得高（修正，原为低）于限度浓度的1/101.4溶液稳定性1.4.1目的考察被测各溶液在特定时间周期内的稳定性1.4.2试验方法a.配制系统适应性溶液、供试品溶液、对照品溶液，在室温条件下，分别在各时间点进样b.如不稳定，需考察在低温条件下的溶液稳定性c.时间范围根据试验需要来确定。
比如做回收率中需要至少连续测定9份供试品，是所有单个验证项目中最长的，选择这个时间点是可以的。
也有考虑到以后需要测定更多的样品，选择更长的时间范围。
1.4.3试验要求a.系统适应性溶液，各峰之间分离度应符合要求。
b.对照品溶液峰面积RSD应小于2.0%c.供试品溶液，杂质个数和杂质量应一致，峰面积RSD应小于5.0%；不得检出新增杂质d.如不稳定，需临用现配或低温保存1.5仪器精密度1.5.1概念同一溶液，连续进样6次，其tR和峰面积的精密度，考察仪器的进样精密度1.5.2试验方法配制限度浓度的各杂质和主成分的混合溶液，连续进样6次1.5.3试验要求a.tR的RSD小于2.0%b.各峰面积RSD小于2.0%1.6线性与校正因子1.6.1概念在设计的范围内，被测物浓度与峰面积的线性关系1.6.2试验方法配制各杂质和主成分的混合溶液，逐步稀释，浓度范围从定量限至限度浓度的120%以上，至少配制5份以上溶液。
由2人分别进行。
1.6..3试验要求a. 线性关系系数r大于0.990b.Y轴截距应在100％响应值的25％以内c. 响应因子的相对标准差应不大于10%d.2人测得斜率之比在0.98~1.02之间e.计算出来的校正因子应进行修约，在0.9~1.1范围内的，修约为1.0进行计算；0.2~5.0范围内的，按校正因子计算；0.2~5.0范围外的，按外标法计算。
1.7精密度1.7.1概念同一个均匀供试品，经多次取样测定结果之间的接近程度。
1.7.2重复性1.7.2.1试验方法由同一试验人员，取同一均匀供试品，平行配制6份供试品溶液，测定杂质百分含量。
1.7.2.2试验要求a.检出杂质个数，杂质相对保留时间，各杂质百分含量均应一致b.单个杂质的百分含量的极差应在其含量±10%以内c.杂质总量的RSD应小于5.0%1.7.3中间精密度1.7.3.1试验方法同一实验室，由不同试验人员在不同时间使用不同设备，平行配制6份供试品溶液，测定杂质百分含量。
1.7.3.2试验要求a.同1.7.2.2-a和bb.单个杂质和杂质总量的RSD应小于10.0%1.8回收率1.8.1概念用拟定分析方法所测得结果与真实值接近的程度。
1.8.2试验方法a.配制各杂质的混合贮备液b.称取供试品适量，精密加入混合杂质贮备液适量，配制成溶液，使供试品浓度为测定浓度，杂质浓度分别为限度浓度的50%，100%，150%。
各浓度均平行配制3份c.配制混合杂质对照品溶液和自身对照溶液1.8.3试验要求a.各浓度下的回收率应在90%~110%之间b.回收率（N=9）的RSD应小于10.0%c.用加校正因子的自身对照法计算结果应与杂质外标法计算结果一致1.9耐用性1.9.1概念在拟定的分析方法有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，为所建立的分析方法用于常规检测提供依据1.9.2试验方法a.分析方法中可变动的因素有：流动相组成比例，水相pH，柱温，色谱柱（同一品牌不同批次，不同品牌的常用色谱柱），流速，检测波长b.配制系统适应性溶液，供试品溶液，对照品溶液进行测定1.9.3试验要求a.系统适应性溶液应符合规定；如不符合规定，则需更严格控制所变化的因素，直至找到一个合适的范围；如指定色谱柱，严格控制pH等等b.检测杂质个数，杂质的相对保留时间应与精密度结果一致c.测得杂质量应与精密度结果一致2．含量测定（适用于API，制剂，也适用于单个杂质控制）含量测定方法验证的前提条件：1.空白（溶剂和辅料）和各杂质不干扰主峰的测定2.根据主成分的紫外吸收波长（复方需分别单独测定各组分紫外吸收），选择合适的检测波长。
多波长检测（如有）则分别考察。
3.在检测波长下，计算S/N，预估主成分浓度4.供试品溶解方法和提取方法得到合理证明2.1专属性：2.1.1概念在其他成分（如其他杂质，辅料，溶剂）可能存在的情况下，拟定的分析方法能正确测定主成分的能力。
2.1.2试验方法2.1.2.1定位试验：A. 目的同1.1.2.1-AB.试验方法同1.1.2.1-BC.试验要求：a．空白应和各杂质不得干扰主成分的测定，主峰保留时间处不得为梯度峰拐点（如有）b．定位溶液中，主峰的峰纯度应符合规定c．分离度试验溶液中，主峰与相邻杂质的分离度应大于2.02.1.2.2强制降解试验A.目的一是通过考察药品在一系列剧烈条件下的稳定性，了解该药品内在的稳定特性及其降解途径与降解产物。
其二，这些试验也能在一定程度上对含量测定分析方法用于检查主成分的专属性进行验证。
B.试验方法同1.1.2.2-BC.试验要求a.主峰纯度符合规定，与相邻杂质分离度大于2.0其他同1.1.2.2-C2.2定量限2.2.1概念样品中能被定量测定的最低量，有定量意义。
2.3.2验证方法A.目的考察主成分的能被定量的最低量，同时评判供试品浓度的选择是否合理B.试验方法配制检测浓度的主成分溶液，进样，逐步稀释至S/N约为10时，得定量限。
C.试验要求定量限浓度不得高（修正，原为低）于检测浓度的1/102.3溶液稳定性试验要求为主成分峰面积RSD小于2.0%如溶出检测方法同含量，建议考察一个溶出曲线周期内的溶液稳定性其他同1.4项下2.4仪器精密度试验要求为主成分峰面积RSD小于2.0%其他同1.5项下2.5线性与校正因子2.5.1概念在设计的范围内，被测物浓度与峰面积的线性关系2.5.2试验方法配制主成分贮备液，逐步稀释，浓度范围从检测浓度80%至120%，至少配制5份以上溶液。
由2人分别进行。
2.5.3试验要求同1.6.32.6精密度2.6.1概念同一个均匀供试品，经多次取样测定结果之间的接近程度。
2.6.2重复性2.6.2.1试验方法由同一试验人员，取同一均匀供试品，平行配制6份供试品溶液，测定主成分百分含量。
2.6.2.2试验要求6份供试品含量结果RSD应小于2.0%2.6.3中间精密度2.6.3.1试验方法同一实验室，由不同试验人员在不同时间使用不同设备，平行配制6份供试品溶液，测定主成分百分含量。