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分子生物学技术在瘤胃细菌多样性研究中的应用

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分子生物学技术在瘤 胃细菌多样性研究 中的应用
李积 兰 ， 刘 书杰 ， 孙 璐 ， 崔 占鸿 。 （ １ ． 青 海 大 学 生 态环 境 工 程 学 院 ， 西宁， ８ １ ０ ０ １ ６ ； ２ ． 青 海 大 学 畜牧 兽 医科 学 院 ， 西宁。 ８ １ ０ ０ １ ６ ） 摘 要： 反 刍 动 物 的 瘤 胃是 一 个 复 杂 的厌 氧 微 生 态 发 酵 系统 ， 研 究 其 瘤 胃微 生 物 区系 组 成 与 功 能 已 成 为 反 刍 动 物 营养 学 的重 要 内 容 ， 分 子 生 物 学技 术 是 开 展 瘤 胃微 生 物 研 究 的 重 要 技术 手 段 。本 文 就 变 性梯 度凝 胶 电 泳 （ Ｄ Ｇ Ｇ Ｅ ） 技术 、 １ ６ Ｓ ｒ Ｄ Ｎ Ａ 序列 分析 、 宏 基 因 组技 术 、 Ｄ Ｎ Ａ芯 片技 术 等 在瘤 胃细 菌 多 样 性 研 究 中 的 应 用 情 况 进 行 了 总 结 与 归 纳 ， 为 今 后 开 展 此 方 面 研 究 工作 提 供 技术 参 考 。 关键词 ： 分 子 生 物学 技 术 ； 瘤 胃； 细菌 ； 多 样 性 中 图分 类号 ： ￥ ８ １ ８ ． ９ 文献 标 识 码 ： Ａ 文章 编 号 ： １ ０ ０ ３ － ７ ９ ５ ０ （ ２ ０ １ ５ ） ０ ３ － ０ ｏ ４ ５ — ０ ２
了必 需 的 养 料 和 能 量 来 源 。 因此 ， 瘤 胃 微生 物 态 区 系组 成 及 调 控 研 究 一 直 是 反 刍动 物 营养 学 工 作 的 重 点 。近 年 来 ， 分 子 生 物 学技术快 速发展 ， 如 变性 梯 度 凝 胶 电泳 （ Ｄ Ｇ Ｇ Ｅ） 技术 、 １ ６ ｓ ｒ Ｄ Ｎ Ａ 序列分析 、 宏 基 因组 技 术 、 Ｄ Ｎ Ａ 芯 片 技 术 等 的 相 继 出现 ， 为瘤 胃 微 生 物 组 成 、分 离 及 鉴 定 等 研 究 工 作 提 供 了先 进 的 技 术 手 段 ， 本 文 就 分 子 生 物 学 技 术 在 反 刍 动 物 瘤 胃细 菌 多 样 性 研 究 中 的 应 用情况进行了综述。 １ 变 性 梯 度 凝 胶 电泳 （ Ｄ Ｇ ＧＥ） 技 术 从 Ｍｕ ｙ ｚ ｅ ｒ 等 …首 次 运 用 Ｄ Ｇ ＧＥ技 术 研 究 土 壤 环 境 的 微 生 物 区 系 以后 ，该 技术 已迅 速用 于 动 物 胃肠 道 微 生 物 的 研 究 ， 其 中 在 瘤 胃微 生 物 研 究 中 应 用也 更 加 广 泛 。 Ｋ ｏ ｃ ｈ ｅ ｒ ｇ ｉ ｎ ｓ ｋ ａ ｙ ａ 等【 ２ 利 用 Ｐ Ｃ Ｒ扩 增 １ ６ Ｓ ｒ Ｄ Ｎ Ａ，再 用 Ｄ Ｇ Ｇ Ｅ技 术 对 ８头 饲 喂 两 种 不 同 日粮 的 去 势 公 牛 进 行 研 究 。结 果 表 明 ， 饲 喂 黄 豆 秆 公 牛 瘤 胃微 生物用不 同的 Ｐ Ｃ Ｒ程 序 扩 增 Ｖ ３区 ， 得 到 图谱 极 其 相 似 ， Ｄ Ｇ Ｇ Ｅ 分析显示至少有 ｌ ６个 条 带 ， 其 中有 ５个 为 明显 优 势 条 带 ； 饲 喂 混 合 料 公 牛 瘤 胃微 生 物 Ｖ ３扩 增 区 和 饲 喂 黄 豆 秆 的 有 显 著 差 异， Ｄ Ｇ Ｇ Ｅ分 析 显 示 饲 喂 混 合料 的公 牛 瘤 胃微 生 物 也 具 相 似 性 ， 但存在 个体 差异 ， 至 少 有 ８个 微 弱 可 分 辨 条 带 ， 有４ － － ５个 优 势 条 带 。 姚 文 等 Ｊ 通过 Ｄ Ｇ Ｇ Ｅ以 及 １ ６ Ｓ ｒ Ｄ Ｎ Ａ序列分析 ， 研 究 土 种 山 羊 瘤 胃细 菌 的 多 样 性 ， 及 饲 喂大 豆 黄 酮 所 引 起 的 瘤 胃细 菌 组 成的变化 。结果表明 ， 饲 喂基 础 １ ３粮 的 ３头 山羊 瘤 胃 内容 物 的 Ｄ Ｇ Ｇ Ｅ图 谱 有 一 定 的 相 似性 ４ ３ ％一 ５ ５ ％； 饲 料 中 添 加 大 豆 黄酮 一 定 程 度 上 影 响 了 瘤 胃细 菌 的 组 成 ， Ｄ Ｇ Ｇ Ｅ谱 带 变 化 程 度 分 别 为 １号 ３ ６ ％、 ２号 ４ ６ ％、 ３号 ３ ０ ％ 。基 因序 列 分 析 表 明 ， Ｄ Ｇ Ｇ Ｅ图 谱 中优势 条带 的 １ ６ Ｓ ｒ Ｄ Ｎ Ａ基 因 序 列 中有 ５个 基 因 序 列 与 基 因数 据库登 录的相关 序列的相似性大于 ９ ７ ％， ８个 基 因序 列 的相 似 性在 ９ Ｏ ％～ ９ ６ ％， 余 下 的低 于 ９ ０ ％。 相似性大于 ９ ７ ％的 ５个 克 隆４ ５ 卷 ３期
Ｖｏ １ ． ４ ５ ， Ｎ ｏ ． ３
３ ／ ２ ０ １ ５
Ｃ ｈ ｉ ｎ ｅ ｓ ｅ Ｑ ｉ ｎ ｇ ｈ ａ ｉ Ｊ ｏ ｕ ｎａ ｒ ｌ ｏ ｆ Ａ ｎ ｉ ｍ ａ ｌ ａ ｎ ｄ Ｖ ｅ ｔ ｅ ｒ ｉ ｎ ａ ｒ ｙ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ｓ
木
瘤 胃是 反 刍 动 物 特 有 的 一 个 生 物 发 酵 罐 ， 主 要 是 依 靠 其 含 有的细菌 、 真菌 、 原 虫 和 噬 菌 体 等 微 生 物 的 共 同发 挥 作 用 ， 瘤胃 内的 微 生 物 数 量 是 机 体 细 胞 的 １ Ｏ倍 之 多 。瘤 胃微 生 物 与 反 刍 动物 之间是 互惠 的共生关 系 ， 反 刍动 物 吃 进 的 大 量 草 料 ， 以 及 瘤 胃 中 的恒 定 温 度 和 厌 氧 环 境 ， 为 瘤 胃微 生 物 提 供 了生 长 繁 殖 的有利 条件 ； 瘤 胃微生物将动物不能利用 的复杂有机物 分解 成 葡萄糖 、 有机酸 ， 瘤 胃细 菌 的菌 体 蛋 白 、 维 生 素 等 均 为 动 物 提 供

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瘤胃微生物类群的多样性及其综合发酵的研究进展

瘤胃微生物类群的多样性及其综合发酵的研究进展

青贮发酵与瘤胃发酵具有基本相同的可利用基质但青贮窖是一次装料发酵产物也不能移出乳酸菌产生乳酸的积累使ph值降低以便抑制竞争者并最终抑制了自身的生长与繁殖故只有简单的几类微生物生长其中纤维素降解菌及其酶的活性对ph值也相对敏感所以容易受到影响朱伟云2004而不能再正常生长纤维素也不能被有效分解vanhoutert1993认为瘤胃微生物达到最大生长速度的适宜ph值57以上
ｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ） 在瘤胃中常被检测到。如降解淀粉为主的 Ｒ． ｂｒｏｍｉｉ（ Ｋｒａｕｓｅ 等， １９９９） ； 降解纤维为主的 Ｒ． ｆｌａｖｅ－ ｆａｃｉｅｎｓ 在孙 云章 （ ２００５） 的 研 究 中 占 测 序 克 隆 子 中 比 例 为 ２．０８％； 在 Ｋｒａｕｓｅ 等 （ １９９９） 报 道 中 占 有 ２．２％的 比例， 是以粗饲为主的反刍动物瘤胃中的常在菌类。
狭义遗传多样性是指种内基因的变化， 包括种内 Ｓｕｎｄｓｅｔ 等 （ ２００７） 对 ｒｅｉｎｄｅｅｒ 瘤 胃 微 生 物 １６Ｓ ｒＲＮＡ
ｇｅｎｅ 的测序结果表明 Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ 的比例为
王梦芝 ， 扬 州 大 学 动 物 科 学 与 技 术 学 院 ， 博 士 ， ２２５００９， 江 苏省扬州市文汇路东路 １２ 号。
用于构建系统树的 １６Ｓ ｒＤＮＡ 序列 ６ ２０５ 个， 而随着 ｃｌｕｓｔｅｒｓ） （ Ｐｒｙｄｅ 等， ２００２） 。
研究的不断深入，还有新发现的序列不断上传，丰富瘤
瘤胃中除有种类繁多的革兰氏阳性菌外尚存在一
胃微生物的基因库，足以说明其遗传多样性的丰富。 定比例的同样种类繁多的革兰氏阴性菌（ 安登第，２００３） 。
和基因表达具有很大的差异。目前，据 １６Ｓ ｒＤＮＡ 序列 维二糖、蔗糖、淀粉和糖原等几种 ＣＨＯ， 主要产生或只 同源分析建立的核糖体小亚基 １６Ｓ ｒＤＮＡ 和 １８Ｓ ｒＤＮＡ 产生丁酸， 其 ＤＮＡ 的 Ｇ＋Ｃ 摩尔百分比是 ４２．３％。据
传统技术与现代分子生物学技术在瘤胃微生物多样性方面的研究进展

传统技术与现代分子生物学技术在瘤胃微生物多样性方面的研究进展


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& 此外 ! 运 用培 养技术 得 到的 已 知 菌种 可 能
不 完全 适合 或者 进 入 了 非 培 养 状 态 ! 而一些微生物
; ( 由 于缺 乏合 适的 方法 从未 培养 成 功 ’ & 目 前已 证 明
表 现型 还不 足以 明 确 分 类 ! 不同的生理特征或许掩 饰 了遗 传的 相似 性 ! 相似 的 生 理 特 征 和 形 态 或 许 掩 盖 了微 生物 遗传 的多 样性 ! 因此 ! 基 于表 型 分类 已 经 不 可行 ! 最好 的分 类方 法应 该反 映了 自然 进化 关
%( 作 者主 要从 事形 态 % 分类 的 研究 工作 ’ &! " 世纪 $ "
法
术 培养 ! 能培
养 的微 生物 只是 天然 微生物 中 的一 小 部分 ! 因 此! 瘤
’( 胃 微生 物的 多 样 性 被 严 重 低 估 ’ ! 目前瘤胃微生物 ’( 的种类 只有 真 实量 的 % "U # % ’U # 或 ’ U #
纯培养技术与分子生物学技术相结合由于大多数瘤胃微生物生长要求复杂的营养因子和严格的厌氧环境体外培养成活的瘤胃微生物只是很少的一部分随着各种技术在动物科学中的研究应用越来越多的研究者开始在瘤胃微生物的研究上也开始将纯培养技术与分子生物学技术结合起来作为一种新的突破点
动 物医 学进 展 ! 增# $ ! " " #! ! $" ’ % & ’ < ( ) * ) , . /0 , 1 , ) . / 2 ) , 5 . 6 . / , + 34
年 代以 来 ! 电 子 显 微镜 技 术 在 微 生 物 研 究 领 域 的 应 用! 使得 人们 对 瘤 胃微 生 物 除 了 可 以 对 其 进 行 形 态 观 察外 ! 还可 对其 生长 所需 的营 养要 求 % 环 境条 件 和 生 长特 性进 行深入 的研 究 & 由于 瘤 胃微 生 物大 多 是 厌 氧性 质的 ! 很难 培养 成功 ! 经过 人 们长 期 的研 究 探 索! 目前 培养 瘤 胃 厌氧 微 生 物 的 简 便 而 又 有 效 的 技 术 包括 厌氧 箱培养 技术 ! 厌 氧罐 培养 技 术 ! 厌氧 袋 培 养 技术 和亨 盖特厌 氧滚 管技 术 & 现 在主 要 运用 的 是 亨 盖特 厌氧 滚管 技术 &
瘤胃微生物的多样性及其研究技术

瘤胃微生物的多样性及其研究技术


同时 又相 互 联 系 ， 同与 宿 主 之 间 构成 了复 杂 的 微 生 态 系统 。为 了探 明瘤 胃微 生 态 系统 ， 方 面要 完善 传 统 的微 生 共 一
物分 离技术 ， 另一方面要 大力发展 分子 生物 学技术 ， 将二者结合起 来进行研 究。
关键 词 ： 胃微 生物 ； 瘤 多样 性 ； 究技 术 研 Ｄ０ １ ．９ ９ Ｊ Ｉ ： ０３ ６ ／ ． １ ＳＳＮ．６ １ ６ ２ ．０１ ．２ ０ ５ １ ７ － ０ ７ ２ ０ ．０ ２
在反刍动物 的瘤 胃内存在 着复杂多样 的非致病性微 生 物， 主要包括瘤 胃原虫、 胃细菌和厌氧真菌 。 瘤
１１ 瘤 胃原 虫 ．
亨盖特厌 氧滚 管技术就是传统 的分离培养 中研究严格 、 专性厌氧菌的一种极 为有效 的技术 。其基本步骤为 ： 氏管 亨 中分装有 ４ ５ Ｌ融化 的琼脂培养基 ，冷却至 ４ 左右时接 ～ｍ ７
态 的研 究 。
其 中一些对氧气 十分敏感 ， 遇到氧气就会被杀死 。瘤 胃细菌 最佳生长 ｐ Ｈ范 围在 ６ｏ ６９ 瘤 胃最佳温度 为 ３ ％ ； 胃细 ． ．； ～ ９ 瘤
管和单菌落分 离后 即可得到纯的菌株 。 分离培养 技术 可以研究瘤 胃微生 物的多样性 ， 但存在很 大局限性 。瘤 胃微生物仅有少于 ２ ％的种类可 以培养 ， ０ 这样
约 占纤毛虫总数 的 ８％～ ８ ５ ９ ％。 原虫 与瘤 胃中其 它微生 物有着 复杂的联 系 ， 在蛋 白质和 碳水化合物的消化 过程 中具有重要 的作用 ， 但也有诸如降低
究表 明 ，饲 喂高粗饲料 日粮 的反刍家 畜瘤 胃细菌有 以下特 征： 大部分细菌属于革 兰氏阴性菌 ， 日粮中能量饲料 含量 当 增加时 ， 革兰氏 阳性菌数量增加 ； 大部分 细菌为绝对厌氧菌 ，
分子生物学方法在微生物多样性研究中的应用

分子生物学方法在微生物多样性研究中的应用

2017年04月分子生物学方法在微生物多样性研究中的应用张晨曦(上海师范大学,上海200235)摘要：微生物多样性研究是生物多样性研究中的重要内容，由于微生物与动植物相比，存着这许多不同之处，因此其多样性研究也存在着许多不同之处，尤其是研究方法仍有待提升。

近些年来，越来越多的研究通过分子生物学方法观察微生物并取得了一定的成效。

因此，文章主要针对分子生物学方法在微生物多样性研究中的应用价值展开分析。

关键词：分子生物学方法；微生物多样性；遗传多样性微生物主要包括细菌、放线菌、原生动物、真菌、部分藻类和病毒，是构成自然界的重要组成部分，其具有代谢多样性和遗传多样性，使得微生物在许多极端环境中都能够生存、繁衍。

微生物是生物链中的重要成员，对于动植物的生长发育、生态循环以及污染物的自然降解具有重要作用[1]。

微生物种类数量仅次于昆虫，但目前已知微生物种类占其总估计量的比重仍较低，目前生物界中已知的细菌、真菌以及病毒占其总种类的比重仅有6%、11%和5%，微生物多样性的研究滞后于其他生物群。

1微生物多样性研究的重要性微生物在维持生态平衡中具有重要作用，但是我们对于维持生态平衡的微生物系统的结构以及有关参数知之甚少，究其原因是由于传统微生物培养方法是通过获得培养菌株才能了解其特征，但是在自然界中能够培养的微生物数量还不到微生物总量的百分之一。

传统微生物研究主要是通过观察菌株的表性特征以及细胞的性质（包括细胞形态学、生理生化反应以及细胞组成成分等方面）[2]。

由于实验室培养是观察这些微生物特征的重要前提，因此这使得许多无法培养的微生物都不能被具体描述。

此外，这种研究方式对于微生物的进化关系没有有效的作用，因此微生物进化研究受到影响，从而无法对微生物进行准确的分类以及系统关系图的创建。

DNA 技术以及微生物分子学的出现为微生物研究提供了新的道路，有助于现代微生物多样性研究的良好开展。

从理论层面上分析，微生物进化之间的关系主要是由于基因组的结构决定的，通过比较微生物基因序列之间的不同能够有助于分析微生物之间的进化关系，比较简单的方法就是比较不同微生物类似基因之间的碱基序列，碱基序列之间的差距越大，说明微生物之间的进化关系也就越小。