1-苯基-2-硫脲对斑马鱼胚胎发育与黑色素生成的影响

“斑马鱼胚胎”资料文集目录一、不同寄主植物桑寄生水提物对斑马鱼胚胎心脏发育毒性及机制研究二、17乙炔雌二醇对斑马鱼胚胎发育的致畸作用及其基因靶位三、斑马鱼胚胎集成测试技术在复合污染毒性评估中的应用四、雄激素1,4雄烯二酮和雄烯二酮对斑马鱼胚胎昼夜节律和下丘脑垂体性腺轴通路中基因转录表达的影响五、不同形态微塑料和汞对斑马鱼胚胎发育毒性联合作用研究六、斑马鱼胚胎模型评价内分泌干扰物的类雌激素效应不同寄主植物桑寄生水提物对斑马鱼胚胎心脏发育毒性及机制研究本文旨在研究不同寄主植物桑寄生水提物对斑马鱼胚胎心脏发育的毒性及作用机制。

采用浸泡法将桑寄生水提物暴露于斑马鱼胚胎，观察胚胎发育情况，并通过分子生物学手段探讨其作用机制。

结果表明，不同寄主植物的桑寄生水提物对斑马鱼胚胎心脏发育具有不同程度的毒性，其毒性可能与其成分及含量有关。

同时，发现这些水提物可能通过影响相关基因的表达，进而影响斑马鱼胚胎心脏发育。

本研究为桑寄生的安全性评价及资源利用提供了科学依据。

桑寄生是一种常见的植物寄生虫，能寄生于多种植物上，其生长过程中会从寄主植物中获取营养。

近年来，桑寄生作为一种中药材受到了广泛关注，但其活性成分及对生物体的影响仍不明确。

斑马鱼作为一种理想的生物模型，具有与人类相似的生理特征，其胚胎发育过程透明可见，便于观察。

因此，本研究选用斑马鱼作为实验模型，研究不同寄主植物桑寄生水提物对胚胎心脏发育的毒性及作用机制。

分别收集寄生于不同植物的桑寄生样品，按照文献报道的方法制备水提物。

将桑寄生水提物配置成不同浓度，采用浸泡法处理斑马鱼胚胎。

分别在暴露后72小时观察胚胎发育情况，记录心脏发育相关指标。

采用实时荧光定量PCR技术，检测处理组和对照组胚胎中相关基因的表达水平。

不同寄主植物桑寄生水提物对斑马鱼胚胎心脏发育的影响实验结果表明，不同寄主植物的桑寄生水提物对斑马鱼胚胎心脏发育具有不同程度的毒性。

随着暴露时间的延长，心脏发育相关指标逐渐受到影响。

Pu.1和cMyb在斑马鱼中性粒细胞发育中的相互作用洪佳馨;徐颂恩;张文清;刘伟【期刊名称】《遗传》【年(卷),期】2024(46)4【摘要】中性粒细胞发生是一个高度有序且被精密调控的过程,造血相关转录因子在其中起着关键作用。

造血相关转录因子通过与其辅因子相互作用或转录因子之间相互作用形成复杂的调控网络,调控网络的异常可导致白血病的发生。

目前参与该过程的转录因子有几十种,它们的结构与功能被广泛研究,但对转录因子之间调控关系的研究则相对缺乏。

人PU.1和cMYB参与中性粒细胞发生的多个阶段且它们的异常通常与血液疾病相关,但目前对于在体情况下两者之间是否存在调控关系以及如何相互作用尚不明确。

本研究利用cMyb过表达(cmybhyper)和Pu.1缺陷(pu.1^(G242D/G242D))的斑马鱼模型,通过整体原位杂交、qRT-PCR、荧光报告系统以及拯救实验检测中性粒细胞发育过程中Pu.1和cMyb的相互作用关系。

结果显示,在pu.1^(G242D/G242D)突变体中,中性粒细胞的cmyb表达量显著升高,而在cmybhyper中,中性粒细胞的pu.1表达量则无明显变化。

进一步在pu.1^(G242D/G242D)突变体中注射MO(morpholino)来降低cmyb的表达,并使用SB以及BrdU染色检测中性粒细胞的数量和增殖情况,发现cmyb的敲低可以拯救突变体中中性粒细胞异常增生的表型。

这些结果表明,在中性粒细胞发育过程中Pu.1可以负调控cMyb的表达量。

最后,本研究通过构建多位点突变质粒和荧光报告系统,证实了Pu.1能够直接结合在cmyb启动子+72 bp位点,从而负调控其表达。

综上所述,本研究明确了Pu.1可以通过调控cmyb的表达参与中性粒细胞的发育,为理解两者之间调控关系及其在疾病中的作用提供了新的线索。

【总页数】14页(P319-332)【作者】洪佳馨;徐颂恩;张文清;刘伟【作者单位】华南理工大学医学院发育生物学与再生医学团队【正文语种】中文【中图分类】R73【相关文献】1.肌间刺缺失突变对斑马鱼胚胎发育过程中肌肉发育的影响2.外胚叶发育不全基因及其受体在斑马鱼牙齿早期发育中的表达3.心血管发育相关基因mpx在斑马鱼早期胚胎发育中的表达4.ITGB2在斑马鱼中性粒细胞迁移和巨噬细胞发育的作用机制初探因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

应用斑马鱼研究酒精性肝病相关内质网应激陈志亮【摘要】目的该实验旨在探讨斑马鱼在研究酒精性肝病相关内质网应激的可行性.方法显微观察胚胎肝脏大小及卵黄吸收情况,病理组织学方法检测酒精对肝脏的影响,RT-PCR法检测内质网应激标记物和脂代谢相关基因的表达水平.结果研究结果发现,急性酒精处理引起斑马鱼胚胎的肝肿大及卵黄吸收变慢.成鱼慢性酒精处理显示,肝细胞肿胀,呈气球样变性,大泡性脂肪变性,小叶炎性浸润.成鱼急性酒精处理显示内质网应激分子标记物bip、chop和gp78的表达上调,伴随肝脏脂代谢相关基因ACC1,Fasn,Fads以及胆固醇代谢相关的基因HMGCS1、HMGCRb的表达上调.结论通过上述研究表明酒精引起斑马鱼急、慢性肝损伤,这种肝损伤可能和内质网应激及脂肪和胆固醇代谢的紊乱密切相关.【期刊名称】《中国继续医学教育》【年(卷),期】2019(011)012【总页数】4页(P167-170)【关键词】斑马鱼;酒精性肝病;肝脏内质网应激;脂代谢;胆固醇代谢;分子标记物【作者】陈志亮【作者单位】漳州片仔癀药业股份有限公司研发中心福建省片仔癀天然医药研发企业重点实验室,福建漳州 363000【正文语种】中文【中图分类】R575斑马鱼是一种小型热带鱼，因其体表有斑纹而得名。

近年来，斑马鱼作为一种新的疾病模式动物被广泛应用于生物学、医学和药物研发。

内质网应激（ERS）是指由于内外环境因素使得未折叠蛋白或错误折叠蛋白在细胞ER内积聚的现象。

已有研究表明，内质网应激与肝细胞脂肪合成、炎症反应、细胞凋亡等密切相关，可能在酒精性肝病（ALD）的发生发展中起着至关重要的作用[1-3]。

然而，ALD的内质网应激与脂代谢的关系尚未研究清楚。

本文利用酒精对斑马鱼进行处理，并进一步观察酒精对斑马鱼肝脏内质网应激及脂代谢基因表达的影响，以期揭示内质网应激与肝脏脂肪性病变的关系。

1 材料与方法1.1 实验材料Trizol reagent购自美国Invitrogen公司；RNA逆转录试剂盒购自Fermentas公司；其他常规试剂及耗材均为国产。

糙米发酵滤液的护肤功效研究—斑马鱼实验文/王志华 陈雪平 任姝静 陆震 刘 卫 王玉玲关键词：糙米发酵滤液、斑马鱼、保湿、美白、舒缓、修复与样品(5g/L)的混合液，于28±1 ℃恒温箱中培养3h后对鱼胚胎进行显微镜拍照后用Image J测量尾部面积并进行计算和统计分析。

鱼胚胎尾巴面积缩小抑制率计算公式为：抑制率=其中：T—样品处理组鱼胚胎尾巴面积的平均值 C—空白对照组鱼胚胎尾巴面积的平均值 M—模型对照组鱼胚胎尾巴面积的平均值2.2美白功效评价模型人类皮肤变黑的主要原因是酪氨酸酶促进黑色素合成，而斑马鱼具有和人类相同的黑色素调控机制，皮肤结构也与人类高度相似，且斑马鱼在胚胎阶段是透明的，色素细胞易于观察[11]，方便于显微镜下拍照，用分析软件定量读取黑色素含量水平，可比较鱼胚胎黑色素变化水平，因此，斑马鱼技术可有效地评价护肤品的美白功效。

实验参照T/SHRH 036-2021化妆品黑色素抑制—斑马鱼胚胎测试方法。

将96尾8h大斑马鱼胚胎分别置于96孔板中，每孔含1尾鱼胚胎，随机平均分为4组，设置为空白对照组、100%黑色素抑制组、阳性对照组和样品处理组，分别加入0.2mL鱼胚胎培养液、0.2mL 浓度为1.5mg/mL的苯硫脲溶液（完全抑制黑色素生成，用作100%美白效果对标数据）、0.2mL浓度为2.5g/ L的曲酸溶液 和0.2mL 浓度为5g/L的样品溶液，于28±1 ℃恒温箱中培养48h后对鱼胚胎进行显微镜拍照，用Image J测量鱼胚胎透光率作为色素信号强度并进行计算统计分析。

斑马鱼黑色素抑制率计算公式为：抑制率=其中：T—样品处理组鱼胚胎黑色素信号强度平均值 C—空白对照组鱼胚胎黑色素信号强度平均值 P—100%黑色素抑制组黑色素信号强度平均值2.3舒缓功效评价模型（中性粒细胞）斑马鱼胚胎的中性粒细胞和人体中性粒细胞在形态、生化和生理功能上高度相似。

受到外界刺激后，免疫反应的发生将导致中性粒细胞致免疫细胞的迁移和聚集，而中性粒细胞是在损伤或病菌入侵部位第一批出现的白细胞，作用是清除感染或有害物质[12][13]，因此，应用硫酸铜诱导斑马鱼胚胎侧线区域神经丘细胞损伤而引起中性粒细胞聚集的模型[14]进行测试，比较受试物处理组和模型对照组的鱼胚胎侧线区域中性粒细胞的数量变化，可作为评价原料、配方或产品舒缓功效的一种有效手段。

3种成瘾性药物对斑马鱼胚胎心脏毒性的初步研究房淼;江明金;林莹波;朱道琦;李婵;陈敏婷;莫志贤【期刊名称】《中国药理学通报》【年(卷),期】2015(31)B11【摘要】目的观察3种成瘾性药物对斑马鱼胚胎心脏毒性的影响.方法以受精后48h发育正常的斑马鱼胚胎作为心脏毒性模型,用不同浓度的甲基苯丙胺、盐酸氯胺酮和美沙酮处理上述胚胎,分别于处理后12h、24h观察胚胎心脏的形态和心率的变化.结果与对照组比较,高浓度甲基苯胺（1000、500mg·L^-1）和氯胺（2000、1000、500mg·L^-1）引起斑马鱼胚胎心率显著降低,出现心膜出血、血细胞在心区堆积、心包囊水肿等心脏中毒现象.高浓度美沙酮（1000、500mg·L^-1）能引起斑马鱼胚胎全部死亡,而低浓度美沙酮（300、200mg·L^-1）能引起斑马鱼胚胎部分死亡,部分心率明显下降并且出现心脏中毒现象.结论初步证实3种成瘾性药物对斑马鱼胚胎均有心脏毒性作用,而美沙酮对斑马鱼胚胎心脏毒性作用更为严重.【总页数】2页(P68-69)【关键词】成瘾性药物;甲基苯丙胺;盐酸氯胺酮;美沙酮;斑马鱼胚胎;心脏毒性【作者】房淼;江明金;林莹波;朱道琦;李婵;陈敏婷;莫志贤【作者单位】南方医科大学中医药学院中药药理教研室,广东广州510515【正文语种】中文【中图分类】R595.4【相关文献】1.青藤碱和美沙酮对斑马鱼胚胎心脏毒性的研究 [J], 江明金;魏筱华;温金华;莫志贤2.氯氮平通过诱导斑马鱼胚胎心脏细胞凋亡引起心脏毒性 [J], 张凤;韩利文;张云;韩建;侯海荣;王希敏;刘可春;田青平;何秋霞3.纳米氧化锌暴露对斑马鱼胚胎心脏发育的毒性效应和机制研究 [J], 徐诚;张春兰;邵文涛;顾爱华4.雷公藤红素对斑马鱼胚胎心脏毒性的初步研究 [J], 王思锋;刘可春;王希敏;何秋霞;韩利文;侯海荣5.氢溴酸槟榔碱对斑马鱼胚胎发育及心脏毒性的研究 [J], 贾哲;李向日;董海鹏;韩婷;徐文娟;李春帅;刘梦楠;林青华;赵崇军;徐新房因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

水仙醇提物对斑马鱼胚胎黑色素合成的抑制作用张文娟;许璟瑾;陈晓莹;李秀敏;陈金妹;潘裕添;薛钰【期刊名称】《中国实验动物学报》【年(卷),期】2017(025)004【摘要】目的以斑马鱼为模型,重点研究水仙鳞茎的醇提物对斑马鱼黑色素合成的抑制效应.方法将斑马鱼胚胎暴露在0、50、100、200、500 μg/mL不同浓度的水仙花醇提物中,观察其黑色素生成情况,并进一步测定体内黑色素合成通路关键蛋白酪氨酸酶的酶活性变化和其他标记基因的时空表达,同时以200 μg/mL的熊果苷(arbutin,Ar)处理组为阳性对照.结果定性观察表明,随着水仙提取物处理浓度的增加,对斑马鱼黑色素合成的抑制明显增强;进一步检测黑色素合成相关基因的时空表达,证明了水仙醇提物通过抑制酪氨酸酶(TYR)、银色毛发(SILV)和Mitfa等基因的mRNA表达而抑制黑色素合成;最后,通过检测酪氨酸酶的酶活性,发现随着醇提物浓度的增加导致酶活性逐渐降低.结论水仙醇提物能有效地抑制斑马鱼胚胎黑色素的生成,同时该研究也为斑马鱼模型在天然美白化合物筛选和产品开发的应用提供了研究基础和思路.%Objective The aim of this study was to explore the inhibitory effect of alcohol extracts of Narcissus bulb on melanogenesis in zebrafish embryos.Methods Zebrafish embryos were exposed to different concentrations of alcohol extracts of Narcissus (0, 50, 100, 200, and 500 μg/mL), and then the formation of melanin was observed.Furthermore, we measured the enzyme activity of tyrosinase (TYR), which plays a pivotal role in melanogenesis.Meanwhile, the spatial and temporal pattern of melanin-specific marker genes were detected.Arbutin (Ar) was used as apositive control in all these experiments.Results The treatment of alcohol extracts of Narcissus bulb inhibited melanogenesis in the zebrafish embryos in a dose-dependent manner.Furthermore, the mRNA expression levels of melanin-related genes such as tyrosinase (TYR), silver (SILV) and Mitfa were significantly reduced after treatment with different concentrations of Narcissus extracts by in-situ and semi-quantitative PCR.Finally, the enzyme activity of tyrosinase was also gradually decreased with increasing concentrations of the alcohol extracts.Conclusions Narcissus alcohol extracts can effectively inhibit the production of melanin in zebrafish embryos.This study provides potential evidence and approaches for the screening of natural whitening compounds using zebrafish models.【总页数】8页(P425-432)【作者】张文娟;许璟瑾;陈晓莹;李秀敏;陈金妹;潘裕添;薛钰【作者单位】闽南师范大学菌物产业工程技术中心,福建漳州 363000;闽南师范大学菌物产业工程技术中心,福建漳州 363000;闽南师范大学菌物产业工程技术中心,福建漳州 363000;闽南师范大学菌物产业工程技术中心,福建漳州 363000;闽南师范大学菌物产业工程技术中心,福建漳州 363000;闽南师范大学菌物产业工程技术中心,福建漳州 363000;闽南师范大学菌物产业工程技术中心,福建漳州 363000【正文语种】中文【中图分类】Q95-33【相关文献】1.葡萄籽提取物对B16细胞内黑色素合成的抑制作用 [J], 王鹏;李素霞;韩福森;王勇刚;施惠娟2.1-苯基-2-硫脲对斑马鱼胚胎发育与黑色素生成的影响 [J], 张利军;史慧勤;苑晓燕;余寿忠;赵君;彭双清3.GHK对B16细胞内黑色素合成的抑制作用 [J], 王昭维;王惠嘉;高恩;赵金礼;杨小琳4.探究3种美白类中草药对抑制斑马鱼胚胎黑色素生成的作用 [J], 戴希越;吕秀华5.有机锗GeM_(10)对体外培养黑色素瘤细胞DNA合成的抑制作用 [J], 陈静宏;陈高平;苏敏;魏西秦因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

DBP和TPP联合暴露对斑马鱼胚胎发育的影响作者：张明君户沙沙姜伟伟李艳孙桂金来源：《安徽农业科学》2021年第20期摘要 [目的]研究邻苯二甲酸二丁酯（DBP）和磷酸三苯酯（TPP）单独及联合暴露对斑马鱼胚胎发育的影响。

[方法]将受精后4 hpf（hour post-fertilization，hpf）斑马鱼胚胎分别暴露于DBP（0、0.5和1.0 mg/L）、TPP（0和0.5 mg/L）和TPP+DBP（0.5 mg/L+0.5 mg/L和0.5 mg/L+1.0 mg/L），统计72 hpf胚胎孵化率以及96 hpf仔鱼存活率、孵化率、畸形率和体长。

[结果]DBP和TPP单独及联合暴露引起斑马鱼卵黄囊肿、心脏畸形、脊柱弯曲和尾巴畸形，导致斑马鱼孵化率和存活率下降、畸形率增加和体长缩短。

[结论]DBP和TPP联合暴露对斑马鱼存活率、畸形率和体长影响存在交互作用，对孵化率的影响无交互作用。

关键词 DBP;TPP;联合暴露;斑马鱼胚胎;发育中图分类号 S 917.4 文献标识码 A文章编号 0517-6611（2021）20-0105-03doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.20.027开放科学（资源服务）标识码（OSID）：Effect of Combined Exposure to DBP and TPP on the Development of Zebrafish （Danio rerio） EmbryosZHANG Ming-jun，HU Sha-sha，JIANG Wei-wei et al （School of Food Science and Engineering，Qilu University of Technology （Shandong Academy of Sciences），Jinan，Shandong 250000）Abstract [Objective]To study the effect of individual and combined exposure to dinbutyl phthalate （DBP） and triphenyl phosphate （TPP） on the development of zebrafishembryos.[Method]Zebrafish embryos at 4 hpf（hour post-fertilization，hpf） were exposed to DBP （0，0.5 mg/L and 1.0 mg/L），TPP （0 and 0.5 mg/L） and TPP+DBP （0.5 mg/L+0.5 mg/L and 0.5 mg/L+1.0 mg/L）.The hatching rate of zebrafish embryos was recorded at 72 hpf，and the survival rate，hatching rate，malformation rate and body length of zebrafish larvae were recorded at 96 hpf.[Result]Exposure to individual and combined of DBP and TPP resulted in obvoius malformations in zebrafish，including yolk-sac edema，cardiac deformities，spinal curvature and tail malformation，decreased hatching and survival rates，increased malformation rate and reduced body length in zebrafish embryos.[Conclusion]It has an interaction effect on the survival rate，malformation rate and body length of zebrafish，and no interaction on the hatching rate of zebrafish.Key words DBP;TPP;Combined exposure;Zebrafish embryos;Development基金項目国家级大学生创新创业训练计划项目（201910431048）。

苯硫脲对斑马鱼黑色素生成及早期发育的影响孙桂金;潘杰;刘可春;王雪;王思锋【期刊名称】《水产科学》【年(卷),期】2011(30)7【摘要】为探索苯硫脲抑制斑马鱼黑色素生成的最佳浓度及苯硫脲对斑马鱼早期发育的影响,用0.05～2.O mmol/L苯硫脲处理28-体节期斑马鱼胚胎,用1.0～15 mmol/L苯硫脲处理受精后2、10、24 h的斑马鱼胚胎.结果表明,在不同的发育时期,抑制黑色素生成的苯硫脲最佳浓度是不同的;且发育时期越早,斑马鱼对苯硫脲毒性越敏感;苯硫脲低于0.2 mmol/L时对斑马鱼孵化、存活和早期发育无显著影响;0.2 mmol/L苯硫脲导致斑马鱼孵化率降低;0.5～2.0 mmol/L苯硫脲导致斑马鱼的孵化率和存活率均降低,并引起斑马鱼畸形.【总页数】4页(P387-390)【作者】孙桂金;潘杰;刘可春;王雪;王思锋【作者单位】山东省科学院生物研究所,山东,济南,250014;山东师范大学生命科学学院,山东,济南,250014;山东师范大学生命科学学院,山东,济南,250014;山东省科学院生物研究所,山东,济南,250014;山东省科学院生物研究所,山东,济南,250014;山东省科学院生物研究所,山东,济南,250014【正文语种】中文【中图分类】S965.8【相关文献】1.六溴环十二烷(HBCD)对斑马鱼发育早期能量代谢及软骨、肌肉和鱼鳍发育的影响 [J], 邓军;杨丽华;周炳升2.1-苯基-2-硫脲抑制flk1型斑马鱼黑色素生成的最佳浓度 [J], 樊午阳;王琴梅3.1-苯基-2-硫脲对斑马鱼胚胎发育与黑色素生成的影响 [J], 张利军;史慧勤;苑晓燕;余寿忠;赵君;彭双清4.异甘草素对斑马鱼胚胎发育、血管生成和心脏的影响 [J], 何俊霖;于思;曹治兴;王雯雯;张若琪;李玉芝;彭成5.探究3种美白类中草药对抑制斑马鱼胚胎黑色素生成的作用 [J], 戴希越;吕秀华因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

Rap1基因在斑马鱼胚胎早期发育过程中的时空表达谱研究杨小燕;何志旭;舒莉萍;金皎;黄璟;吴莎莎;马健娟【摘要】目的：选择斑马鱼作为实验动物模型，研究Rap1基因在胚胎早期发育过程中的时空表达规律。

方法从斑马鱼胚胎cDNA中克隆Rap1基因片段，将Rap1基因片段和pCS2＋质粒进行体外连接重组，重组质粒经双酶切、菌落聚合酶链反应（PCR）及测序鉴定正确后，经T3RNA体外转录体系合成DIG标记的Rap1基因反义mRNA探针，采用整胚原位杂交方法检测Rap1在斑马鱼胚胎早期发育过程的表达情况。

结果在斑马鱼胚胎0．75 hpf的细胞分裂连接处、3．70 hpf和6．00 hpf的动物极、12．00～72．00 hpf的脊索神经部位均可见Rap1基因的阳性杂交信号。

结论 Rap1基因在斑马鱼脊索神经系统的早期发育过程中可能起到重要的调控作用。

%Objective To choose zebrafish as the experimental animal model for studying the spatiotemporal expression rule of rap1 gen in zebrafish embryo early development process .Methods The Rap1 gene f ragment was cloned from the zebrafish emby‐oscDNA ,then the Rap1 gene fragment and pCS2+ plasmid were performed the in vitro connetion and recombination was extracted , the combinant plasmid was correct after the double enzyme digestion ,colony PCR and sequencing identification .T3 RNA polymer‐ase in vitro transcription system was used to obtain the digoxin (DIG)‐labeled anti‐sense mRNA probe of Rap1gene .The whole mount in situ hybridization method was adopted to detect the Rap1 expression in zebrafish embryo early development process . Results The positive hybridization signal of Rap1 gene was detected at the cell division junction region of 0 .75 hpf ,animal pole of3 .70 hpf and 6 .00 hpf ,and notochord of 12 .00 -72 .00 hpf .Conclusion Rap1 gene might be involved in the early development process of notochord nervous system in zebrafish .【期刊名称】《重庆医学》【年(卷),期】2016(045)020【总页数】4页(P2748-2751)【关键词】Rap1基因;斑马鱼;原位杂交;基因表达【作者】杨小燕;何志旭;舒莉萍;金皎;黄璟;吴莎莎;马健娟【作者单位】贵州医科大学附属医院儿科 550004;贵州医科大学附属医院儿科550004; 贵州医科大学组织工程与干细胞实验中心 550004;贵州医科大学组织工程与干细胞实验中心 550004; 贵州医科大学免疫学教研室，贵阳550004;贵州医科大学附属医院儿科 550004;贵州医科大学附属医院儿科 550004;贵州医科大学附属医院儿科 550004;贵州医科大学附属医院儿科 550004【正文语种】中文【中图分类】Q132.4Rap1又称Ras相关GTP结合蛋白，是Kitayama在筛选NIH/3细胞中抑制Ras 蛋白转化功能的蛋白分子过程中发现的。

金线莲抑制斑马鱼黑色素形成的活性组分筛选及机理研究许璟瑾;张文娟;王静怡;姚丽云;潘裕添;欧一新;薛钰【摘要】为探索金线莲中对黑色素形成具有抑制效果的活性组分,本研究对金线莲进行分离、提取,获得总提组、醇沉组与醇提组,利用斑马鱼筛选金线莲具有美白作用的活性组分.将受精后0.75 h的斑马鱼胚胎分别暴露于不同浓度的金线莲总提组、醇沉组、醇提组,72h时观察结果表明,金线莲醇提物能有效抑制斑马鱼胚胎黑色素和黄色素沉着,浓度越高抑制效果越明显,且不影响胚胎生长发育.进一步采用半定量PCR和整胚原位杂交技术定量和定性地检测黑色素形成相关基因mRNA表达,结果表明金线莲醇提物可以有效降低silv、tyr和tyrp1a等黑色素合成相关基因的转录水平,且具有浓度依赖关系.通过检测酪氨酸酶活性显示,加入醇提物的实验组其酪氨酸酶活性随着处理浓度升高而逐渐降低.此外,在黑色素已经大量形成的情况下,金线莲醇提物仍可通过下调黑色素合成相关基因的mRNA表达及酪氨酸酶活性来抑制黑色素的形成,并且这种抑制效果可在金线莲醇提物撤除后得到恢复.上述实验结果表明,金线莲醇提物能显著抑制斑马鱼黑色素的形成,本文为金线莲在美白产品领域的开发和应用方面提供了有力支撑.%The aim of this study is to explore the active components of Anoectochilus roxburghii capable of inhibiting melanin formation using chemical separation and extraction and functional analysis.Anoectochilus roxburghii were extracted with alcohol and separated into three groups:the total extraction group,alcohol extracted group and alcohol precipitated group.Zebrafish embryos at 0.75 h post-fertilization were exposed to various concentrations of the three groups of extracts,and analyzed at 72 h,using semi-quantitative RT-PCR and in situ hybridization.The results showed that the alcohol extracts inhibitmelanogenesis most significantly in the zebrafish embryos.The mRNAs of melanin-related genes,such as silv,tyr,tyrp1a,were down-regulated by the alcohol extracts spatially and temporally.The alcohol extracts also inhibited the activity of tyrosinase,a key enzyme in melanogenesis,in a dosage dependent manner.In addition,the alcohol extracts also display a remarkable inhibitory effect on melanin synthesis through down-regulation of mRNAs of melanin-related genes and tyrosinase activity in zebrafish embryos,in which a large amount of melanin has already been synthesized.Such inhibitory effect could be reversed after the withdrawal of the alcohol extracts.Our results showed that the alcohol extracts of Anoectochilus roxburghii can significantly inhibit zebrafish melanogenesis,supporting the notion that Anoectochilus roxburghii could potentially be used in the development and production of natural whitening products.【期刊名称】《遗传》【年(卷),期】2017(039)012【总页数】10页(P1178-1187)【关键词】斑马鱼;金线莲醇提物;黑色素;基因表达;酪氨酸酶【作者】许璟瑾;张文娟;王静怡;姚丽云;潘裕添;欧一新;薛钰【作者单位】闽南师范大学,福建省菌类活性物质工程技术研究中心,漳州363000;闽南师范大学,福建省菌类活性物质工程技术研究中心,漳州363000;闽南师范大学,福建省菌类活性物质工程技术研究中心,漳州363000;闽南师范大学,福建省菌类活性物质工程技术研究中心,漳州363000;闽南师范大学,福建省菌类活性物质工程技术研究中心,漳州363000;闽南师范大学,福建省菌类活性物质工程技术研究中心,漳州363000;上海交通大学生命科学技术学院,上海200240;闽南师范大学,福建省菌类活性物质工程技术研究中心,漳州363000;膜生物学国家重点实验室,北京100101【正文语种】中文金线莲(Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl.)又名金线兰、花叶开唇兰，是兰科(Orchidaceae)开唇兰属(Anoectochilus)多年生珍稀药用植物[1]。

第54卷 第1期 2024年1月中国海洋大学学报P E R I O D I C A L O F O C E A N U N I V E R S I T Y O F C H I N A54(1):079~085J a n .,20241-苯基2-硫脲通过p 53调控自噬活性来保护斑马鱼神经丘毛细胞❋秦彦筠1,2,范纯新1,2❋❋,王 建1,2(1.上海海洋大学国家海洋生物科学国际联合研究中心,上海201306;2.上海海洋大学水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室,上海201306)摘 要: 为了确定细胞自噬与毛细胞存活的关系,通过溶酶体标记物L ys o T r a c k e r 对神经丘的细胞自噬进行活体染色发现,斑马鱼(D a n i o r e r i o )经过苯基硫脲(P T U )处理后,其神经丘毛细胞L ys o T r a c k e r 信号强度增加,并伴随毛细胞数量增多和肿瘤抑制蛋白p 53基因(T u m o r p r o t e i n p 53g e n e ,t p 53)上调㊂为了阐明毛细胞的存活和保护机制,通过C R I S P R /C a s 9技术构建了t p53突变体斑马鱼,发现该基因突变后不会影响斑马鱼神经丘毛细胞的数量,但抑制了P T U 对神经丘毛细胞自噬的促进,神经丘毛细胞不再增多㊂研究结果表明:P T U 可以通过上调t p 53基因的表达,促进斑马鱼侧线神经丘毛细胞的自噬活性,进而促进毛细胞的存活,为保护毛细胞奠定了重要基础㊂关键词: t p53基因;侧线系统;毛细胞;细胞自噬;苯基硫脲中图法分类号: S 917 文献标志码: A 文章编号: 1672-5174(2024)01-079-07D O I : 10.16441/j.c n k i .h d x b .20220399引用格式: 秦彦筠,范纯新,王建.1-苯基2-硫脲通过p 53调控自噬活性来保护斑马鱼神经丘毛细胞[J ].中国海洋大学学报(自然科学版),2024,54(1):79-85.Q i n Y a n j u n ,F a n C h u n x i n ,W a n g J i a n .1-p h e n y l 2-t h i o u r e a p r o t e c t s h a i r c e l l s i n z e b r a f i s h n e u r o m a s t b y r e g u l a t i n g a u t o ph -a g y t h r o u g h p 53[J ].P e r i o d i c a l o f O c e a n U n i v e r s i t y of C h i n a ,2024,54(1):79-85. ❋ 基金项目:国家自然科学基金面上项目(31772406)资助S u p p o r t e d b y t h e G e n e r a l P r o gr a m o f N a t i o n a l N a t u r a l S c i e n c e F o u n d a t i o n o f C h i n a (31772406)收稿日期:2022-09-17;修订日期:2022-10-08作者简介:秦彦筠(1996 ),女,硕士生㊂E -m a i l :1834145317@q q.c o m ❋❋ 通信作者:E -m a i l :c x f a n @s h o u .e d u .c n毛细胞是一类感受机械刺激的感觉细胞,存在于所有脊椎动物的内耳中,以及鱼类和两栖类的侧线感受器中㊂内耳毛细胞可以探测环境中的声音信息,毛细胞的异常会导致人类的感音性耳聋[1]㊂侧线毛细胞用于探测水流运动,在鱼类捕食㊁避敌㊁群游和趋流等行为中发挥重要作用[2]㊂毛细胞的结构精细,对抗生素㊁重金属离子和噪音等刺激因素异常敏感[3]㊂因此,毛细胞的再生和存活研究对于人类健康和生物资源保护具有重要意义㊂自噬是真核细胞消化溶酶体中大分子和受损细胞器的一个基本分解代谢过程㊂在正常条件下,细胞自噬通过蛋白质降解和细胞器周转来平衡细胞的蛋白质合成和细胞器的生物活性,为正常细胞提供生长途径[4]㊂而在应激条件下,如饥饿㊁缺氧或细胞损伤等,自噬也可以作为一种促生存的途径来响应这些刺激[5]㊂已有研究表明,在各种类型的听力损失中,自噬对毛细胞存活具有保护作用[6-7]㊂P a n g 等[8]在顺铂的耳毒性实验中发现,自噬可抑制斑马鱼侧线和小鼠耳蜗免受顺铂诱导的毛细胞丢失㊂细胞自噬与肿瘤抑制蛋白p 53基因(T u m o r p r o t e i n p 53g e n e ,t p53)间存在重要的互作,t p53可以通过激活自噬基因,促进细胞自噬的发生[9]㊂但细胞自噬是否通过p 53保护毛细胞尚不清楚㊂苯基硫脲(P T U )是酪氨酸酶的抑制剂,常被用于阻断斑马鱼胚胎的色素形成㊂近期的研究表明:P T U 可以激活斑马鱼胚胎细胞中的细胞自噬,P T U 处理导致自噬体和自噬溶酶体形成,溶酶体富集[10]㊂侧线神经丘中的毛细胞与内耳毛细胞同源,且位于体表,易于观察,已成为感音性耳聋理想的研究模型[11]㊂本研究中,将利用斑马鱼仔鱼分析P T U 是否通过促进细胞自噬来保护侧线神经丘毛细胞,这个过程是否通过p 53发挥作用,从而为进一步理解毛细胞的存活和保护奠定基础㊂1 材料与方法1.1材料本课题所用的野生型A B 品系购自国家斑马鱼研中 国 海 洋 大 学 学 报2024年究中心,标记毛细胞的T g (B r n 3c :G F P )系为中国海洋大学赵呈天教授课题组惠赠㊂成体斑马鱼养殖在斑马鱼养殖单元中(海圣),每天早晚喂食新鲜孵化的丰年虫㊂室温控制在26~28ħ,循环水体P H 为7.0~8.0,固定光周期为14h 光照㊁10h 黑暗㊂斑马鱼胚胎饲养在蓝水(0.3g /L 红海盐以及0.4m g /L 亚甲基蓝)中,置于28.5ħ恒温培养箱中培养㊂受精后5d,仔鱼出壳后转移至光照培养箱喂养开口饵料草履虫,受精后10d 混喂草履虫和新鲜孵化的卤虫,受精后15d 可转移至水系统饲养,用于后续实验㊂有关斑马鱼的所有实验操作均符合上海海洋大学动物伦理委员会相关规定㊂1.2P T U 处理和溶酶体染色将苯基硫脲(P T U ,购买自s i gm a )用二甲基亚砜(D M S O )溶解后,用新鲜配制的1ˑH o l t s B u f f e r(1.75g /L N a C l ㊁0.05g /L C a C l 2㊁0.025g /L K C l 和0.5%H E P E S )配制成不同浓度的溶液㊂将受精后24h 的斑马鱼胚胎浸泡在装有P T U 溶液的12孔板中,每个孔盛放15条斑马鱼,对照组用等量的D M S O 溶液处理㊂将其放置在28.5ħ恒温培养箱培养,每天更换新鲜的药物㊂将L ys o T r a c k e r R e d D N D -99(Y e a s e n )按1ʒ1000稀释,从而得到终浓度为10μm o l /L 的工作液,然后将斑马鱼仔鱼浸泡在该工作液中于28.5ħ避光染色1h ㊂染色完成后,用1ˑH o l t s B u f f e r 清洗仔鱼3次,用麻醉剂M S -222(0.1m g/m L )处理后,将其包埋在1.5%低熔点琼脂糖中,保持侧面贴在薄底小皿底部,并用荧光倒置显微镜成像观察㊂1.3斑马鱼后侧线毛细胞标记用新鲜配制的1ˑH o l t s B u f f e r 将Y O -P R O -1(T h e r m o F i s h e r )配制成2μm o l /L 的染色工作液,然后将受精后3和5d 的斑马鱼仔鱼均用该工作液浸泡染色(28.5ħ避光),1h 后用1ˑH o l t s B u f f e r 清洗鱼体3次,每次5m i n ㊂用M S -222麻醉斑马鱼仔鱼5m i n 后,在荧光倒置显微镜488n m 通道下对活体斑马鱼侧线神经丘毛细胞进行观察计数㊂每个实验的实验组和对照组样本量都大于12㊂1.4荧光定量P C R荧光定量P C R 采用诺唯赞公司的C h a m Q U n i -v e r s a l S Y B R q P C R M a s t e r M i x 试剂盒㊂以斑马鱼c D -N A 为模板,以真核翻译延伸因子1α1基因(e e f1α1|1)为内参基因(见表1),每个样品检测设置3个平行,利用A p p l i e d B i o s ys t e m A B I 7500定量P C R 仪(A B I 7500)进行荧光定量P C R ,根据2-ΔΔC t 计算目标基因在不同样品中的相对表达量,并用t -检验对相对表达量进行差异显著性分析㊂表1 引物信息T a b l e 1 I n f o r m a t i o n o f pr i m e r s 引物名称P r i m e r n a m e引物序列(5 3)P r i m e r s e qu e n c e (5 3 )用途A p p l i c a t i o n s g R N A -t p 53T A A T A C G A C T C A C T A T A G G T G G A C G T T G C C C C T C C A C G T T T T A G A G C T A G A A s gR N A 合成模板U n i v e r s a l b o t t o mA A A A G C A C C G A C T C G G T G C C A C T T T T T C A A G T T G A T A A C G G A C T A G C C T T A -T T T T A A C T T G C T A T T T C T A G C T C T A A A A Cs gR N A 合成模板G T -t p 53-F T G T A A A A C G A C G G C C A G T A C C A G T A C T A A G G A A T A C C C C A基因分型G T -t p53-R G T G T C T T C T A T C T C C A T C C G G G G T T C G 基因分型W T -t p 53-F T G G T G G T G G A C G T T G C C C C T C C A 基因分型M T -t p53-F A A A T G G T G G T G G A C G T T G C A G G 基因分型t p 53-R A C A G C C A A A A C A A G A G A G T G A A C G A基因分型I S H -t p53-F G G A G A C A A G C G A C T A T C C C G 探针合成I S H -t p53-R T A A T A C G A C T C A C T A T A G G A C A C G C A C C T C A A A A G A C C T探针合成q P C R -e e f 1a 1|1-F C T T C T C A G G C T G A C T G T G C q P C R q P C R -e e f 1a 1|1-R C C G C T A G C A T T A C C C T C Cq P C R q P C R -t p53-F G G A G A C A A G C G A C T A T C C C Gq P C R q P C R -t p53-R C A C C A T T T G A A C G G G G C A A GqP C R 1.5整胚原位杂交收集受精后5d 的斑马鱼胚胎,用4%多聚甲醛(4%P F A )固定后,放置于4ħ过夜㊂固定后的样品用甲醇室温脱水5m i n ,再换取新鲜的甲醇放置-20ħ保081期秦彦筠,等:1-苯基2-硫脲通过T p53调控自噬活性来保护斑马鱼神经丘毛细胞存㊂全程都需要尽量保持R N a s e -F r e e 的环境㊂完全脱水后的样品经P B S T (2.5m L 20ˑP B S+0.1%T w e e n -20)梯度复水后,用10%过氧化氢溶液使胚胎脱色成米黄色,然后用10μg/m L 的蛋白酶K 在37ħ消化通透5m i n ,换上4%P F A 重新室温固定30m i n㊂加入含反义探针的杂交液,于70ħ孵育过夜㊂孵育之后依次经过漂洗㊁封闭㊁抗体孵育和漂洗,然后在室温下用碱性磷酸酶溶液(N B T /B C I P s t o c k s o l u t i o n)避光显色㊂显色完成后,用4%P F A 终止显色反应,经过P B S T 溶液漂洗后加入100%甘油长期保存,用体式镜进行观察并拍照㊂1.6s gR N A 的设计和合成利用C R I S P R s c a n 设计靶向于t p53第五外显子的s g R N A ㊂合成含有s g R N A 靶序列的特异性O l i go :5 端包含T 7启动子序列,3端包含下游通用引物的互补序列(见表1)㊂将该特异性O l i g o 与下游通用O l i go 共同进行P C R ,然后把所得P C R 产物通过利用T 7H i gh Y i e l d R N A S y n t h e s i s K i t (V a z ym e )进行体外转录合成s gR N A ㊂经过D N a s e Ⅰ消化后,产物用R N A C l e a n &C o n c e n t r a t o r K i t 纯化,纯化后的产物放置于-80ħ保存㊂1.7C a s 9m R N A 合成用X b a Ⅰ限制性核酸内切酶(T h e r m o F i s h e r)将质粒p T 3T S -n l s C a s 9n l s 线性化处理,所得线性化产物用普通D N A 产物纯化试剂盒(V a z ym e )进行纯化㊂用mM e s s a g e mM a c h i n e T 3T r a n s c r i p t i o n K i t 试剂盒体外转录获得C a s 9m R N A ,最后用R N A C l e a n &C o n -c e n t r a t o r K i t 纯化终产物,并保存于-80ħ㊂1.8显微注射和基因分型收集1~2细胞期的斑马鱼胚胎,利用显微注射仪将混合液通过显微注射针注射到细胞质中㊂每颗卵注射约300p g C a s 9m R N A 和50p g s gR N A ㊂注射后的胚胎转移到蓝水中28.5ħ恒温培养㊂将受精后培养约24h 的胚胎用碱裂解法提取D N A ㊂P C R 扩增后(见表1)将所得产物送生工生物工程公司进行毛细管电泳检测,判断是否敲除成功㊂将成功注射后的胚胎继续培养至性成熟,与野生型A B 交配获得子代F 1,将F 1饲养至一个月以上,剪取它们的尾部组织,然后由碱裂解法进行基因分型,挑选出杂合突变F 1并将它们内交,对获得的子二代F 2继续用碱裂解法进行基因分型以获得纯合突变体㊂另外,本研究中还根据野生型基因座和突变型基因座设计基因座特异性的基因分型引物(见表1),对模板D N A 进行P C R ,确定其D N A 的基因型㊂2 结果2.1P T U 促进神经丘毛细胞自噬本研究中,利用能标记溶酶体的L ys o T r a c k e r 探针去观察细胞内溶酶体和自噬溶酶体的含量情况,以此来反映细胞内的自噬情况㊂结果显示:D M S O 处理组神经丘在15m i n 后仍有较清晰的信号轮廓;P T U 处理组神经丘中的L ys o T r a c k e r 信号虽然早期更强,但信号弥散得更快,15m i n 后就变得弥散(见图1A )㊂为了确定神经丘内发生自噬的细胞类型,对受精后3d 斑马鱼同时进行Y O -P R O -1和L ys o T r a c k e r 染色,发现溶酶体染色阳性的细胞和Y O -P R O -1阳性的毛细胞共定位(见图1B ),这表明:P T U 在神经丘中诱导的自噬主要发生在毛细胞中㊂(A :经200μm o l /L P T U 处理受精后3d 野生型斑马鱼的溶酶体染色情况㊂标尺:50μm ㊂B:受精后3d 斑马鱼毛细胞和溶酶体染色阳性细胞的共定位㊂标尺:10μm ㊂A :L y s o s o m e s t a i n i n g i n 3d a y s p o s t f e r t i l i z a t i o n w i l d t y pe z e b r af i s h t r e a t e d w i t h 200μm o l /L P T U.S c a l e b a r :50μm.B :C o -l o c a l i z a -t i o n o f 3d a y s p o s t f e r t i l i z a t i o n z e b r a f i s h h a i r c e l l s a n d l y s o s o m e -po s i t i v e c e l l s .S c a l e b a r :10μm.)图1 P T U 促进神经丘毛细胞自噬F i g .1 P T U i n d u c e s n e u r o m a s t h a i r c e l l a u t o p h a g y18中国海洋大学学报2024年2.2P T U处理保护神经丘毛细胞本研究中,利用荧光成像技术,在T g(B r n3c: G F P)背景下观察P T U对毛细胞数量的影响㊂发现在200μm o l/L P T U处理下,实验组毛细胞数量多于对照组(见图2A C)㊂本文作者还用Y O-P R O-1对毛细胞进行活体染色,检测不同浓度的P T U对斑马鱼神经丘毛细胞的影响㊂染色结果表明无论是受精后3d (见图2B)还是受精后5d(见图2C),在200μm o l/L的P T U处理下,毛细胞数量都显著多于对照组,而当P T U浓度再升高时,毛细胞则没有显著增多,甚至在800μm o l/L的时候显著减少㊂因此,2种毛细胞标记方法都显示200μm o l/L的P T U促进毛细胞的存活㊂(A:200μm o l/L P T U处理后,T p(B r n3c:G F P)转基因斑马鱼毛细胞成像图㊂标尺:25μm㊂B:不同浓度P T U处理受精后3d野生型斑马鱼的毛细胞定量分析,纵坐标为毛细胞数量㊂:p<0.001㊂C:不同浓度P T U处理受精后5d野生型斑马鱼的毛细胞定量分析,纵坐标为毛细胞数量㊂: p<0.05,:p<0.01㊂A:I m a g i n g o f T g(B r n3.1:G F P)t r a n s g e n i c z e b r a f i s h h a i r c e l l s a f t e r200μm o l/L P T U t r e a t m e n t.S c a l e b a r:25μm.B:Q u a n-t i t a t i v e a n a l y s i s o f h a i r c e l l s i n3d a y s p o s t f e r t i l i z a t i o n w i l d t y p e z e b r a f i s h t r e a t e d w i t h d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f P T U.T h e Y-a x i s i s t h e n u m b e r o f h a i r c e l l s.:p<0.001.C:Q u a n t i t a t i v e a n a l y s i s o f h a i r c e l l s i n5d a y s p o s t f e r t i l i z a t i o n w i l d t y p e z e b r a f i s h t r e a t e d w i t h d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f P T U. T h e o r d i n a t e i s t h e n u m b e r o f h a i r c e l l s.:p<0.05,:p<0.01.)图2P T U处理保护神经丘毛细胞F i g.2P T U t r e a t m e n t p r o t e c t s n e u r o m a s t h a i r c e l l s2.3敲除斑马鱼t p53基因据报道,p53在细胞自噬过程中发挥重要作用[12]㊂为了确定t p53基因是否参与P T U诱导的神经丘毛细胞自噬,本文作者对P T U浸泡过的斑马鱼仔鱼用q P C R检测其t p53表达情况㊂结果显示:P T U处理组t p53表达量显著高于对照组(见图3A),这表明P T U处理可诱导t p53表达㊂另外,整胚原位杂交结果表明,t p53基因在斑马鱼侧线神经丘发育过程中呈现动态表达㊂在受精后3d时表达量较高,而在受精后5d时表达量显著降低(见图3B)㊂接下来,利用C R I S P R/C a s9技术敲除斑马鱼t p53基因㊂突变的t p53基因座g R N A靶点位置缺少了8个核苷酸C C C T C C A C,推测突变的t p53基因序列提前终止表达,因此其表达产物仅保留了N端的反转录激活域和一段残缺的D N A结合域(见图3C)㊂同时,q P C R结果显示:在受精后5d斑马鱼中,t p53纯合突变体内该基因的表达量显著低于野生型㊂这表明:t p53敲除导致无义介导的m R N A降解(见图3D)㊂由此可见,在本研究中,本文作者成功地建立了t p53功能缺失的突变体斑马鱼㊂2.4t p53突变不影响神经丘毛细胞的数量研究表明:p53参与细胞凋亡调控,p53可以促进细胞凋亡[13]㊂为了分析t p53突变是否直接影响神经丘毛细胞的数量,本文作者用Y O-P R O-1对t p53突变体斑马鱼的神经丘毛细胞进行活体染色,检测t p53突变是否影响神经丘毛细胞的数量㊂统计结果显示,无论是受精后3d还是受精后5d,t p53纯合突变体的毛细胞数量相较于野生型和t p53杂合突变体都没有显著性差异(见图4)㊂这说明t p53的突变可能不直接影响神经丘毛细胞的存活㊂2.5t p53突变减弱P T U对神经丘毛细胞的保护为了确定t p53突变是否影响斑马鱼神经丘的细胞自噬,本文作者用200μm o l/L P T U处理野生型A B系斑马鱼个体和t p53-/-突变体后观察其神经丘的L y s o T r a c k e r信号,通过荧光显微镜实时成像发现, 281期秦彦筠,等:1-苯基2-硫脲通过T p53调控自噬活性来保护斑马鱼神经丘毛细胞P T U 处理的t p53-/-突变体毛细胞L y s o T r a c k e r 信号和野生型染色标记消退的速度接近,在15m i n 左右依旧能看清细胞的轮廓(见图5A )㊂表明t p53缺失后,P T U 诱导的毛细胞自噬活性减弱㊂(A :经200μm o l /L P T U 处理受精后3d 野生型斑马鱼t p 53的表达情况㊂纵坐标为相对表达水平㊂:p <0.05㊂B :t p53基因在斑马鱼后侧线神经丘中表达情况,通过整胚原位杂交检测受精后3d 和5d 时期的野生型斑马鱼中t p 53基因的表达情况㊂标尺:200μm ㊂C :s g R N A 在t p53基因上的靶点(见图C 1),缺失的碱基对(见图C 2)以及预测的突变体p 53蛋白结构(见图C 3)示意图㊂D :q P C R 结果显示t p 53基因在野生型个体和t p53-/-突变体中的相对表达量㊂纵坐标为相对表达水平㊂W T :野生型;:p <0.0001㊂A :R e l a t i v e e x p r e s s i o n o f t p53i n 3d a y s p o s t f e r t i l i z a t i o n w i l d t y p e z e -b r a f i s h t r e a t e d w i t h 200μm o l /L P T U.T h e O r d i n a t e i s t h e r e l a t i v e e x p r e s s i o n l e v e l .:p <0.05.B :T h e e x p r e s s i o n o f t p53g e n e i n t h e z e b r a f i s h p o s t e -r i o r l a t e r a l l i n e n e u r o m a s t .T h e e x p r e s s i o n o f t p53g e n e i n w i l d t y p e z e b r a f i s h a t 3a n d 5d a y s p o s t f e r t i l i z a t i o n s t a g e s w a s d e t e c t e d b y w h o l e e m b r y o i n s i t u h y b r i d i z a t i o n .S c a l e b a r :200μm.C :T h e s c h e m a t i c d i a g r a m o f t h e s g R N A t a r g e t o n t h e t p53g e n e (s e e f i g u r e C 1),t h e m i s s i n g b a s e p a i r s (m i d d l e s e e f i g u r e C 2),a n d t h e p r e d i c t e d m u t a n t p 53p r o t e i n s t r u c t u r e (s e e f i g u r e C 3).D :q P C R r e s u l t s h o w s t h e r e l a t i v e e x p r e s s i o n o f t p 53g e n e i n w i l d t y p e a n d t p53-/-m u t a n t z e b r a f i s h .T h e o r d i n a t e i s t h e r e l a t i v e e x p r e s s i o n l e v e l .W T :W i l d t y pe ;:p <0.0001.)图3 敲除斑马鱼t p53基因F i g .3 K n o c k i n g o u t t p53i n z e b r a f i s h(A :受精后3d t p 53杂合子内交子代毛细胞的定量分析㊂纵坐标为神经丘毛细胞数量㊂B :受精后5d t p53杂合子内交子代毛细胞的定量分析㊂纵坐标为神经丘毛细胞数量,横轴中W T ㊁H e t 和H o m 分别代表野生型,杂合型和纯合型㊂A :Q u a n t i t a t i v e a n a l y s i s o f t p53h e t e r o z y g o u s i n b r e d p r o g e n y h a i r c e l l s a t 3d a y s p o s t f e r t i l i z a t i o n .T h e o r d i n a t e i s t h e n u m b e r o f h a i r c e l l s i n n e u r o m a s t .B :Q u a n t i t a t i v e a n a l y s i s o f t p53h e t e r o z y g o u s i n b r e d p r o g e n y h a i r c e l l s a t 5d a y s p o s t f e r t i l i z a t i o n .T h e o r d i n a t e i s t h e n u m b e r o f h a i r c e l l s i n n e u r o m a s t .W T ,H e t a n d H o m i n a b s c i s s a r e p r e s e n t s w i l d t y pe ,h e t e r o -z y g o u s a n d h o m o z y g o u s ,r e s p e c t i v e l y.)图4 t p53突变不影响神经丘毛细胞的数量F i g .4 t p53m u t a t i o n d o e s n o t a f f e c t t h e n u m b e r o f n e u r o m a s t h a i r c e l l s 38中国海洋大学学报2024年(A:经200μm o l/L P T U处理受精后3d野生型和t p53-/-突变体斑马鱼的溶酶体染色情况㊂W T:野生型;标尺:50μm㊂B:不同浓度P T U处理受精后3d t p53-/-突变体斑马鱼的毛细胞定量分析㊂纵坐标为毛细胞数量㊂:p<0.05㊂C:不同浓度P T U处理受精后5d t p53-/-突变体斑马鱼的毛细胞定量分析㊂纵坐标为毛细胞数量㊂A:L y s o s o m e s t a i-n i n g i n3d a y s p o s t f e r t i l i z a t i o n w i l d t y p e a n d t p53-/-m u t a n t z e b r a f i s h t r e a t e d w i t h200μm o l/L P T U.W T:W i l d t y p e;S c a l e b a r:50μm.B: Q u a n t i t a t i v e a n a l y s i s o f h a i r c e l l s i n3d a y s p o s t f e r t i l i z a t i o n t p53-/-m u t a n t z e b r a f i s h t r e a t e d w i t h d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f P T U.T h e o r d i-n a t e i s t h e n u m b e r o f h a i r c e l l s.:p<0.05.C:Q u a n t i t a t i v e a n a l y s i s o f h a i r c e l l s i n5d a y s p o s t f e r t i l i z a t i o n t p53-/-m u t a n t z e b r a f i s h t r e a t e d w i t h d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f P T U.T h e o r d i n a t e i s t h e n u m b e r o f h a i r c e l l s.)图5t p53突变减弱P T U对神经丘毛细胞的保护F i g.5t p53m u t a t i o n w e a k e n s t h e p r o t e c t i o n o fP T U o n n e u r o m a s t h a i r c e l l s为了阐明P T U诱导的神经丘毛细胞增多是否通过t p53发挥作用,本文作者在t p53-/-突变体中检测P T U处理对神经丘毛细胞数量的影响㊂经过毛细胞计数后发现,在受精后3和5d,不同浓度的P T U处理下,除了在高浓度下毛细胞数量略微下调外,其他组毛细胞数量与对照组并没有显著差异(见图5B㊁C)㊂这表明P T U诱导毛细胞的增多可能是通过p53来实现的㊂3讨论本研究中,发现P T U处理导致斑马鱼毛细胞溶酶体染色消退的速度较对照组明显加快,同时毛细胞数量较对照组多㊂而t p53突变抑制了P T U对溶酶体的活化和毛细胞的保护㊂溶酶体是自噬泡的降解部位,溶酶体的降解速度反映了自噬的活性[14]㊂另外,p53可通过转录激活促进自噬发生[9]㊂文献[8]的研究表明:细胞自噬可以保护毛细胞的存活㊂因此,本研究结果暗示P T U很可能通过p53诱导毛细胞内自噬溶酶体降解速度加快,从而促进毛细胞的存活㊂毛细胞的保护对于人类健康和动物适应环境具有重要意义㊂凋亡抑制因子㊁抗氧化小分子和热激蛋白等在毛细胞保护中都起到重要作用[15-16]㊂细胞自噬是通过降解异常蛋白和衰老细胞器进而维持细胞存活的重要途径㊂H e等[6]研究发现:新霉素或庆大霉素处理导致小鼠耳蜗毛细胞的自噬活性增加,若用自噬激活剂增加其自噬活性,则细胞的活性氧水平,凋亡和细胞死亡水平显著降低,揭示自噬通过抑制氧化应激来保护新霉素诱导的氧化损伤㊂P a n g等[7]研究发现:在老化的耳蜗中m i R-34a表达量明显升高,伴随吞噬体积累,自噬溶酶体融合受损,从而抑制细胞自噬,进而导致细胞死亡㊂与上述发现一致,本研究的侧线神经丘毛细胞中有明显的溶酶体信号,在用P T U加速了溶酶体信号的消退情况下,存活的毛细胞增多,这表明细胞自噬对毛细胞的保护在神经丘和内耳毛细胞中是保守的,未来可通过激活细胞自噬以开发保护毛细胞的药物或方法㊂另外,本文作者发现的保护神经丘毛细胞的P T U这类小分子化合物可以作为保护内耳毛细胞的候选,进一步在小鼠内耳等模型中确定其功能㊂P T U是实验室用于抑制斑马鱼胚胎色素形成的常用手段㊂但是,本文作者和以往研究者的工作都显示出P T U可促进斑马鱼胚胎脑㊁上皮细胞和毛细胞等多种组织的自噬[10]㊂细胞自噬与多种生理和病理过程有关,如癌症㊁神经退行性疾病和细胞分化等㊂本文作者发现,P T U对神经丘毛细胞的存活有促进作用,这提示在利用斑马鱼侧线神经丘作为模式以研究毛细胞损伤㊁保护和再生时,需要尽可能避免使用P T U抑制胚胎色素形成,因为P T U的处理可能会对结果造成干扰㊂481期秦彦筠,等:1-苯基2-硫脲通过T p53调控自噬活性来保护斑马鱼神经丘毛细胞参考文献:[1] R a p h a e l Y.E v i d e n c e f o r s u p p o r t i n g c e l l m i t o s i s i n r e s p o n s e t oa c o u s t i c t r a u m a i n t h e a v i a n i n n e r e a r[J].J o u r n a l o f N e u r o c y t o l o-g y,1992,21(9):663-671.[2] M c P h e r s o n D R.S e n s o r y h a i r c e l l s:A n i n t r o d u c t i o n t o s t r u c t u r ea n d p h y s i o l o g y[J].I n t e g r a t i v e a n d C o m p a r a t i v e B i o l o g y,2018,58(2):282-300.[3] K u r i o k a T,L e e M Y,H e e r i n g a A N,e t a l.S e l e c t i v e h a i r c e l l a b-l a t i o n a n d n o i s e e x p o s u r e l e a d t o d i f f e r e n t p a t t e r n s o f c h a n g e s i n t h e c o c h l e a a n d t h e c o c h l e a r n u c l e u s[J].N e u r o s c i e n c e,2016, 332:242-257.[4] Q u X,Y u J,B h a g a t G,e t a l.P r o m o t i o n o f t u m o r i g e n e s i s b y h e t-e r o z y g o u s d i s r u p t i o n of t h e b e c l i n1a u t o p h ag y g e n e[J].J o u r n a l o fC l i n i c a l I n v e s t i g a t i o n,2003,112(12):1809-1820.[5] K r o e m e r G,L e v i n e B.A u t o p h a g i c c e l l d e a t h:T h e s t o r y o f a m i s-n o m e r[J].N a t u r e R e v i e w s M o l e c u l a r C e l l B i o l o g y,2008,9(12): 1004-1010.[6] H e Z,G u o L,S h u Y,e t a l.A u t o p h a g y p r o t e c t s a u d i t o r y h a i r c e l l sa g a i n s t n e o m y c i n-i n d u c e d d a m a g e[J].A u t o p h a g y,2017,13(11):1884-1904.[7]P a n g J,X i o n g H,L i n P,e t a l.A c t i v a t i o n o f m i R-34a i m p a i r s a u-t o p h a g i c f l u x a n d p r o m o t e s c o c h l e a r c e l l d e a t h v i a r e p r e s s i n gA T G9A:I m p l i c a t i o n s f o r a g e-r e l a t e d h e a r i n g l o s s[J].C e l l D e a t hD i s c o v e r y,2017,8(10):e3079.[8]P a n g J,X i o n g H,Z h a n T,e t a l.S i r t u i n1a n d a u t o p h a g y a t t e n u a t ec i s p l a t i n-i nd u ce d h a i r c e l l d e a t h i n t h e m o u s e c o c h l e a a n d z e b r af i s hl a t e r a l l i n e[J].F r o n t i e r s i n C e l l u l a r N e u r o s c i e n c e,2018,12: 515.[9] W h i t e E.A u t o p h a g y a n d p53[J].C o l d S p r i n g H a r b o r P e r s p e c t i v e si n M e d i c i n e,2016,6(4):a026120.[10]C h e n X K,K w a n J S K,C h a n g R C C,e t a l.1-p h e n y l2-t h i o u r e a(P T U)a c t i v a t e s a u t o p h a g y i n z e b r a f i s h e m b r y o s[J].A u t o p h a g y, 2021,17(5):1222-1231.[11] N a y a k G D,R a t n a y a k a H S,G o o d y e a r R J,e t a l.D e v e l o p m e n to f t h e h a i r b u n d l e a n d m e c h a n o t r a n s d u c t i o n[J].I n t e r n a t i o n a l J o u r n a l o f D e v e l o p m e n t a l B i o l o g y,2007,51(6-7):597-608.[12] H u W,C h e n S,T h o r n e R F,e t a l.T P53,T P53T a r g e t G e n e s(D R A M,T I G A R),a n d A u t o p h a g y[J].A d v a n c e s i n E x p e r i m e n-t a l M e d i c i n e a n d B i o l o g y,2019,1206:127-149. [13]S h e i k h M S,F o r n a c e A J.R o l e o f p53f a m i l y m e m b e r s i n a p o p t o-s i s[J].J o u r n a l o f C e l l u l a r P h y s i o l o g y,2000,182(2):171-181.[14] W a n g C W,K l i o n s k y D J.T h e m o l e c u l a r m e c h a n i s m o f a u t o p h-a g y[J].M o l e c u l a r M e d i c i n e,2003,9(3-4):65-76.[15] B r e g l i o A,M a y L,B a r z i k M,e t a l.E x o s o m e s m e d i a t e s e n s o r yh a i r c e l l p r o t e c t i o n i n t h e i n n e r e a r[J].J o u r n a l o f C l i n i c a l I n v e s t i-g a t i o n,2020,130:2657-2672.[16]C h e n g A G,C u n n i n g h a m L L,R u b e l E W.M e c h a n i s m s o f h a i rc e l lde a t h a n d p r o t e c t i o n[J].C u r r e n t O p i n i o n i n O t o l a r y n g o l o g y&H e a d a n d N e c k S u r g e r y,2005,13(6):343-348.1-P h e n y l2-T h i o u r e a P r o t e c t s H a i r C e l l s i n Z e b r a f i s h N e u r o m a s tb y R e g u l a t i n g A u t o p h a g y T h r o u g h p53Q i n Y a n j u n1,2,F a n C h u n x i n1,2,W a n g J i a n1,2(1.I n t e r n a t i o n a l R e s e a r c h C e n t e r f o r M a r i n e B i o s c i e n c e s,M i n i s t r y o f S c i e n c e a n d T e c h n o l o g y,S h a n g h a i O c e a n U n i v e r s i t y, S h a n g h a i201306,C h i n a;2.K e y L a b o r a t o r y o f E x p l o r a t i o n a n d U t i l i z a t i o n o f A q u a t i c G e n e t i c R e s o u r c e s,S h a n g h a i O c e a n U n i v e r s i t y,M i n i s t r y o f E d u c a t i o n,S h a n g h a i201306,C h i n a)A b s t r a c t: T o i l l u s t r a t e t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n a u t o p h a g y a n d h a i r c e l l s u r v i v a l,w e l a b e l e d t h e n e u r o-m a s t i n z e b r a f i s h w i t h L y s o T r a c k e r t o t r a c k t h e a u t o p h a g y i n v i v o.W e f o u n d t h a t1-p h e n y l2-t h i o u r e a (P T U)t r e a t m e n t i n d u c e d t h e L y s o T r a c k e r s i g n a l i n g e n h a n c e m e n t i n h a i r c e l l s s p e c i f i c a l l y,a n d a l s o r e-s u l t e d i n a n i n c r e a s e i n t h e n u m b e r o f h a i r c e l l s a n d t h e e x p r e s s i o n o f t p53g e n e.T o c l a r i f y t h e s u r v i v a l a n d p r o t e c t i o n m e c h a n i s m s o f h a i r c e l l s,w e c o n s t r u c t e d t h e t p53m u t a n t z e b r a f i s h b y C R I S P R/C a s9 t e c h n o l o g y.T h e t p53m u t a t i o n d i d n o t a f f e c t t h e n u m b e r o f h a i r c e l l s i n n e u r o m a s t.H o w e v e r,t h e t p53 m u t a t i o n r e d u c e d t h e e n h a n c e m e n t o f a u t o p h a g y i n h a i r c e l l i n d u c e d b y P T U,a n d l o w e r e d t h e n u m b e r o f h a i r c e l l s i n c r e a s e d b y P T U t r e a t m e n t.O u r e v i d e n c e s h o w s t h a t P T U c a n p r o m o t e a u t o p h a g y i n h a i r c e l l s o f l a t e r a l l i n e n e u r o m a s t i n z e b r a f i s h b y u p r e g u l a t i n g t h e e x p r e s s i o n o f t p53g e n e,t h e r e b y p r o m o-t i n g t h e s u r v i v a l o f h a i r c e l l s,l a y i n g a n i m p o r t a n t f o u n d a t i o n f o r h a i r c e l l p r o t e c t i o n.K e y w o r d s:t p53g e n e;l a t e r a l l i n e s y s t e m;h a i r c e l l;c e l l a u t o p h a g y;1-p h e n g l2-t h i o u r e a责任编辑高蓓58。

橘色双冠丽鱼黑素皮质素受体1基因(MC1R)整胚原位杂交潘贤辉;郑曙明;胡隐昌;宋红梅;周康奇;汪学杰;刘奕;牟希东;余梵冬;杨叶欣;刘超【摘要】为探究黑素皮质素受体1基因(MC1R)在橘色双冠丽鱼胚胎发育和体色形成过程中的表达定位及功能,本研究首先制备了MC1R基因的RNA正反义探针,T7方向转录的正义RNA探针质量浓度为447.529 ng/μL,SP6方向转录的反义RNA探针质量浓度为342.698 ng/μL.经10～20倍稀释后的探针用于原位杂交,MC1R基因探针表达定位显示,随橘色双冠丽鱼胚胎的发育杂交信号总体呈逐渐减弱趋势,原肠期和视泡期其卵黄和胚体侧卧部分有杂交信号分布;出膜期其脊柱、卵黄囊及其内容物和色素细胞内出现杂交信号;出膜期第1天,卵黄表面有信号分布.总体来看,杂交信号在脊索、卵黄囊、卵黄囊内容物质及色素细胞有特异表达,而以正义探针作为阴性对照组在5个胚胎阶段均无任何信号,杂交信号显现的MC1R表达定位说明其在橘色双冠丽鱼色素细胞的分化、迁移中起到重要调控作用,也与神经、营养、免疫功能相关,初步建立了鱼类体色相关基因功能和定位研究的整胚原位杂交方法.【期刊名称】《水产学报》【年(卷),期】2019(043)007【总页数】9页(P1560-1568)【关键词】橘色双冠丽鱼;黑素皮质素受体1;整胚原位杂交;定位分析;探针;MC1R 【作者】潘贤辉;郑曙明;胡隐昌;宋红梅;周康奇;汪学杰;刘奕;牟希东;余梵冬;杨叶欣;刘超【作者单位】中国水产科学研究院珠江水产研究所,农业农村部休闲渔业重点实验室,广东广州510380;西南大学,淡水鱼类资源与生殖发育教育部重点实验室,重庆402460;西南大学,淡水鱼类资源与生殖发育教育部重点实验室,重庆402460;中国水产科学研究院珠江水产研究所,农业农村部休闲渔业重点实验室,广东广州510380;中国水产科学研究院珠江水产研究所,农业农村部休闲渔业重点实验室,广东广州510380;中国水产科学研究院珠江水产研究所,农业农村部休闲渔业重点实验室,广东广州510380;西南大学,淡水鱼类资源与生殖发育教育部重点实验室,重庆402460;中国水产科学研究院珠江水产研究所,农业农村部休闲渔业重点实验室,广东广州510380;中国水产科学研究院珠江水产研究所,农业农村部休闲渔业重点实验室,广东广州510380;中国水产科学研究院珠江水产研究所,农业农村部休闲渔业重点实验室,广东广州510380;中国水产科学研究院珠江水产研究所,农业农村部休闲渔业重点实验室,广东广州510380;中国水产科学研究院珠江水产研究所,农业农村部休闲渔业重点实验室,广东广州510380;中国水产科学研究院珠江水产研究所,农业农村部休闲渔业重点实验室,广东广州510380【正文语种】中文【中图分类】Q785;S917.4整胚原位杂交(whole mount in situ hybridization，WISH)是研究动物胚胎发育及器官形成过程中基因表达定位和基因功能的重要手段，又称整体原位杂交。

《BHT及其代谢产物对斑马鱼心脏发育的影响及机制》篇一一、引言近年来，关于环境污染物对水生生物的毒性研究逐渐增多，其中，苯甲羟肟酸（BHT）作为一种常见的抗氧化剂和防腐剂，在食品、化妆品和医药等领域广泛应用。

然而，BHT对水生生物的潜在影响，尤其是对鱼类心脏发育的影响及其机制尚未完全明确。

本实验以斑马鱼为研究对象，探究BHT及其代谢产物对斑马鱼心脏发育的影响及潜在机制。

二、材料与方法1. 实验材料：斑马鱼胚胎、BHT及其代谢产物。

2. 实验方法：（1）斑马鱼胚胎培养：在实验室条件下培养斑马鱼胚胎至不同发育阶段。

（2）BHT暴露实验：将斑马鱼胚胎暴露于不同浓度的BHT 溶液中，设立对照组和实验组，分别在胚胎发育的不同阶段进行暴露。

（3）观察指标：记录斑马鱼心脏的发育情况、形态特征以及相关生化指标的变化。

（4）数据分析：采用统计软件对实验数据进行处理和分析。

三、实验结果1. BHT对斑马鱼心脏发育的影响（1）心脏形态学变化：在BHT暴露下，斑马鱼心脏的形态出现异常，如心腔扩张、心室壁变薄等。

（2）心脏功能变化：BHT暴露导致斑马鱼心率减慢，心脏收缩力减弱，心脏输出量减少。

（3）发育延迟：BHT暴露的斑马鱼心脏发育出现延迟现象，表现为心脏发育关键基因的表达下调。

2. BHT代谢产物的影响（1）代谢产物检测：通过生物分析方法检测到BHT的代谢产物在斑马鱼体内积累。

（2）代谢产物对心脏的影响：BHT的代谢产物对斑马鱼心脏发育也产生不良影响，表现为心脏形态和功能的异常。

3. 机制探讨（1）基因表达分析：通过实时荧光定量PCR技术检测相关基因的表达情况，发现BHT及其代谢产物可影响心脏发育相关基因的表达。

（2）信号通路分析：通过蛋白质组学和生物信息学分析，发现BHT及其代谢产物可能通过干扰Wnt/β-catenin等信号通路影响心脏发育。

四、讨论本实验结果表明，BHT及其代谢产物对斑马鱼心脏发育具有不良影响，可能导致心脏形态和功能的异常，以及发育延迟等现象。

四环素对斑马鱼胚胎发育及CAT和SOD活性的影响作者：梁伟放赵建国柳贤德来源：《热带农业工程》2017年第01期摘要抗生素在养殖业中的长期滥用，对水环境产生的污染问题日益受到关注。

本研究采用5种不同梯度浓度（0，200，220，240，260，280 mg/L）的四环素溶液对斑马鱼胚胎进行处理，随后观察其在受精后144 h的死亡率和孵化率；将成年斑马鱼暴露于四环素溶液（400 mg/L）96 h，随后取其肝、肾、肌肉和脑，并分别测定这4类组织中过氧化氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）的活性。

结果表明：四环素对斑马鱼胚胎发育有明显的毒性作用，并导致幼鱼的脊柱弯曲、鱼鳔萎缩甚至死亡；CAT酶在肌肉组织中显著升高，而SOD酶在肝脏组织中显著上升。

鱼类肌肉中的CAT酶活性和肝脏中的SOD酶活性可成为水生生态抗生素污染的生物标记。

关键词四环素；胚胎发育；CAT ；SOD中图分类号 Q493Effects of Tetracycline on Embryo Development and Enzymatic Activities of Zeb7rafishLIANG Weifang ZHAO Jianguo LIU Xiande（Department of Veterinary Medicine，Hainan University，Haikou，Hainan 570228）Abstract Due to long-term abuse of antibiotics in aquaculture，environmental pollution of water is increased. Zebrafish embryo were exposed to different concentration（0，200，220，240，260，280 mg/L）of tetracycline solution，and then observed mortality and hatchability at 144 hpf. Adult zebrafish were exposed to tetracycline solution（400 mg/L）for 96 hours and removed the liver，kidney，muscle，and brain. The catalase（CAT）and superoxide dismutase（SOD）activity were determined in liver，kidney，muscle，and brain. Results indicated that tetracycline toxic to zebrafish embryos，and inducedspinal curvature and swim bladder atropy inzebrafish larve. CAT activity was significantly increased in muscle and SOD activity was slightly increased in liver. Therefore，CAT activity of muscle and SOD activity of liver may become to biomarker for tetracycline pollution of aquatic environment.Key words tetracycline ；embryo development ；CAT ；SOD抗生素由于能促进动物生长和增产，在养殖业中以亚治疗剂量被长期添加于动物饲料中。

阿奇霉素对斑马鱼心脏毒性的初步研究崔国祯;周鹤峰;陈焕娴;李铭源【摘要】目的建立阿奇霉素诱导斑马鱼幼鱼心脏毒性的模型,为后续抗菌类药物心脏毒性的机理研究奠定基础.方法以受精后2d发育正常的斑马鱼胚胎作为模型,以不同浓度的阿奇霉素处理斑马鱼胚胎3d后,观察斑马鱼胚胎心脏形态并计算其心率和心搏量以评价斑马鱼胚胎心脏的功能.结果 0.3和1mm浓度的阿奇霉素作用3d 后,可见斑马鱼胎心明显毒性.与正常对照组比较,模型组斑马鱼胎心肿大,心率减慢和心搏量减小.结论阿奇霉素对斑马鱼胎心有明显毒性作用,且与阿奇霉素的浓度正相关,该模型可以用于后续抗生素类药物引起的心脏毒性的机理研究.【期刊名称】《遵义医学院学报》【年(卷),期】2014(037)005【总页数】4页(P495-498)【关键词】阿奇霉素;心脏毒性;斑马鱼【作者】崔国祯;周鹤峰;陈焕娴;李铭源【作者单位】遵义医学院珠海校区生物工程系,广东珠海519041;澳门大学中华医药研究院中药质量研究国家重点实验室,澳门999078;遵义医学院珠海校区生物工程系,广东珠海519041;澳门大学中华医药研究院中药质量研究国家重点实验室,澳门999078;澳门大学中华医药研究院中药质量研究国家重点实验室,澳门999078;澳门大学中华医药研究院中药质量研究国家重点实验室,澳门999078【正文语种】中文【中图分类】R978.1阿奇霉素是第1个氮杂内酯类抗生素，是一较新的广谱大环内酯类抗生素。

1980年，南斯拉夫药厂普利瓦(Pliva)成功研发阿奇霉素，并于1981年获批上市。

美国辉瑞公司(Pfizer)得到全球开发权后，将其推向全球市场，使用广泛。

阿奇霉素抗菌谱广，抗菌活性较好，并具有良好的药代动力学特性(半衰期较长，每天仅需服药1次)，是目前我国临床抗细菌感染的主流药物之一。

阿奇霉素在早期的使用过程中，一般认为其相对心脏毒副作用小[1]。

然而, 近10年来，越来越多的临床数据提示，阿奇霉素有潜在的心脏毒副作用的风险。

山东科学ＳＨＡＮＤＯＮＧＳＣＩＥＮＣＥ第３６卷第６期２０２３年１２月出版Ｖｏｌ.３６Ｎｏ.６Ｄｅｃ.２０２３收稿日期:２０２３￣０１￣３１基金项目:济南市 新高校２０条 项目(２０２１ＧＸＲＣ１０６)ꎻ齐鲁工业大学(山东省科学院)科教产融合试点工程项目(２０２２ＰＹ０３３ꎬ２０２２ＪＢＺ０１￣０６)作者简介:时瑞碟(１９９７ )ꎬ女ꎬ硕士研究生ꎬ研究方向为神经药理学ꎮＥ￣ｍａｉｌ:ｓｈｉｒｕｉｄｉｅ＠１６３.ｃｏｍ∗通信作者ꎬ靳梦(１９８５ )ꎬ女ꎬ博士ꎬ研究员ꎬ硕士生导师ꎬ研究方向为神经系统疾病模型建立和神经药理学ꎮＥ￣ｍａｉｌ:ｍｊｉｎ１９８５＠ｈｏｔｍａｉｌ.ｃｏｍ张秀军(１９６６ )ꎬ男ꎬ博士ꎬ教授ꎬ博士生导师ꎬ研究方向为药理学㊁毒理学ꎮＥ￣ｍａｉｌ:ｚｈａｎｇｘｉｕｊｕｎ６６＠１６３.ｃｏｍ基于斑马鱼模型研究木蝴蝶苷Ａ的抗阿尔茨海默病活性和作用机制时瑞碟１ꎬ２ꎬ高鑫２ꎬ王宝堃２ꎬ高代丽２ꎬ靳梦２∗ꎬ张秀军１∗(１.华北理工大学心理与精神卫生学院ꎬ河北唐山０６３２００ꎻ２.齐鲁工业大学(山东省科学院)生物研究所山东省科学院药物筛选技术重点实验室ꎬ山东济南２５０１０３)摘要:基于六水合氯化铝诱导的斑马鱼阿尔茨海默病模型ꎬ探究木蝴蝶苷Ａ的抗阿尔茨海默病活性及作用机制ꎮ将受精后３ｄ的野生型ＡＢ品系斑马鱼随机分为阴性对照组ꎬ８０μｍｏｌ/Ｌ六水合氯化铝模型对照组ꎬ８０μｍｏｌ/Ｌ六水合氯化铝与６μｍｏｌ/Ｌ多奈哌齐阳性对照组ꎬ８０μｍｏｌ/Ｌ六水合氯化铝与不同浓度(５㊁１０㊁２０μｍｏｌ/Ｌ)木蝴蝶苷Ａ受试物组ꎮ斑马鱼受精后６ｄꎬ利用明暗交替行为学实验观察不同处理组斑马鱼行为差异并分析其变化ꎻ通过硫黄素Ｓ染色测定各组斑马鱼头部Ａβ斑块沉积数ꎻ采用酶活测定试剂盒检测各组斑马鱼乙酰胆碱酯酶活性ꎻ以实时荧光定量ＰＣＲ检测自噬相关基因(ｂｅｃｌｉｎ１㊁ｕｌｋ１ｂ㊁ｕｌｋ２和ａｔｇ７)的表达变化ꎻ借助分子对接技术验证木蝴蝶苷Ａ与自噬相关蛋白(ｂｅｃｌｉｎ１㊁ｕｌｋ１ｂ㊁ｕｌｋ２和ａｔｇ７)结合的可靠性ꎮ结果表明ꎬ木蝴蝶苷Ａ缓解了六水合氯化铝造成的斑马鱼运动障碍ꎬ降低了Ａβ斑块沉积数和乙酰胆碱酯酶活性水平ꎬ使自噬相关基因的异常表达趋于正常ꎮ该研究初步揭示了木蝴蝶苷Ａ能够缓解六水合氯化铝诱导的斑马鱼运动障碍ꎬ其机制可能与激活细胞自噬有关ꎬ这为木蝴蝶苷Ａ的临床应用及其治疗阿尔茨海默病的相关研究提供了理论依据ꎮ关键词:阿尔茨海默病ꎻ六水合氯化铝ꎻ自噬ꎻ斑马鱼ꎻ木蝴蝶苷Ａ中图分类号:Ｒ９６５㊀㊀㊀文献标志码:Ａ㊀㊀㊀文章编号:１００２￣４０２６(２０２３)０６￣００２８￣１０开放科学(资源服务)标志码(ＯＳＩＤ):Ａｎｔｉ￣ＡｌｚｈｅｉｍｅｒᶄｓｄｉｓｅａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｏｒｏｘｉｎＡａｎｄｉｔｓｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆａｃｔｉｏｎｂａｓｅｄｏｎｚｅｂｒａｆｉｓｈｍｏｄｅｌＳＨＩＲｕｉｄｉｅ１ꎬ２ꎬＧＡＯＸｉｎ２ꎬＷＡＮＧＢａｏｋｕｎ２ꎬＧＡＯＤａｉｌｉ２ꎬＪＩＮＭｅｎｇ２∗ꎬＺＨＡＮＧＸｉｕｊｕｎ１∗(１.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＰｓｙｃｈｏｌｏｇｙａｎｄＭｅｎｔａｌＨｅａｌｔｈꎬＮｏｒｔｈＣｈｉｎａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬＴａｎｇｓｈａｎ０６３２００ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＤｒｕｇＳｃｒｅｅｎｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆＳｈａｎｄｏｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＢｉｏｌｏｇｙＩｎｓｔｉｔｕｔｅꎬＱｉｌｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ(ＳｈａｎｄｏｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ)ꎬＪｉｎａｎ２５０１０３ꎬＣｈｉｎａ)ＡｂｓｔｒａｃｔʒＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅａｍｅｌｉｏｒａｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｏｒｏｘｉｎＡｏｎＡｌｚｈｅｉｍｅｒᶄｓｄｉｓｅａｓｅ(ＡＤ)ａｎｄｔｈｅｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆａｃｔｉｏｎꎬａｚｅｂｒａｆｉｓｈＡＤｍｏｄｅｌｉｎｄｕｃｅｄｂｙａｌｕｍｉｎｕｍｃｈｌｏｒｉｄｅｈｅｘａｈｙｄｒａｔｅ(ＡｌＣｌ３)ｗａｓｕｓｅｄ.Ｗｉｌｄ￣ｔｙｐｅｚｅｂｒａｆｉｓｈＡＢｌａｒｖａｅａｔ３ｄｐｆ(ｄａｙｓｐｏｓｔｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ)ｗｅｒｅｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔｇｒｏｕｐｓꎬｉｎｃｌｕｄｉｎｇｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐꎬＡｌＣｌ３(８０μｍｏｌ/Ｌ)ｍｏｄｅｌｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐꎬＡｌＣｌ３(８０μｍｏｌ/Ｌ)ｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈｄｏｎｅｐｅｚｉｌ(６μｍｏｌ/Ｌ)ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐꎬａｎｄＡｌＣｌ３(８０μｍｏｌ/Ｌ)ｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ(５ꎬ１０ꎬａｎｄ２０μｍｏｌ/Ｌ)ｏｆｏｒｏｘｉｎＡｔｅｓｔｇｒｏｕｐ.Ａｔ６ｄｐｆꎬｚｅｂｒａｆｉｓｈｂｅｈａｖｉｏｒｗａｓｍｏｎｉｔｏｒｅｄａｎｄａｎａｌｙｚｅｄｕｓｉｎｇｚｅｂｒａｆｉｓｈｌｉｇｈｔ￣ｄａｒｋｌｏｃｏｍｏｔｉｏｎｔｅｓｔ.ＡβｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｚｅｂｒａｆｉｓｈｈｅａｄｓｗａｓａｓｓａｙｅｄｂｙｔｈｉｏｆｌａｖｉｎＳｓｔａｉｎｉｎｇ.Ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅａｓｓａｙｋｉｔｔｅｓｔｅｄａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ(ＡｃｈＥ)ａｃｔｉｖｉｔｙ.Ｉｎａｄｄｉｔｉｏｎꎬｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｕｔｏｐｈａｇｙ￣ｒｅｌａｔｅｄｇｅｎｅｓ(ｂｅｃｌｉｎ１㊁ｕｌｋ１ｂ㊁ｕｌｋ２ａｎｄａｔｇ７)ｗａｓｔｅｓｔｅｄｂｙｒｅａｌ￣ｔｉｍｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ.ＭｏｌｅｃｕｌａｒｄｏｃｋｉｎｇｗａｓｐｅｒｆｏｒｍｅｄｔｏｖａｌｉｄａｔｅｔｈｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｏｒｏｘｉｎＡａｎｄａｕｔｏｐｈａｇｙ￣ｒｅｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ(ｂｅｃｌｉｎ１㊁ｕｌｋ１ｂ㊁ｕｌｋ２ａｎｄａｔｇ７).ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｏｒｏｘｉｎＡｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｒｅｌｉｅｖｅｄｔｈｅｄｙｓｋｉｎｅｓｉａａｎｄｉｎｈｉｂｉｔｅｄＡβｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎａｎｄＡｃｈＥａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｚｅｂｒａｆｉｓｈｉｎｄｕｃｅｄｂｙＡｌＣｌ３.Ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｕｔｏｐｈａｇｙ￣ｒｅｌａｔｅｄｇｅｎｅｓｔｅｎｄｅｄｔｏｂｅｎｏｒｍａｌａｆｔｅｒｏｒｏｘｉｎＡｔｒｅａｔｍｅｎｔ.ＴｈｉｓｓｔｕｄｙｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｉｌｙｒｅｖｅａｌｅｄｔｈａｔｏｒｏｘｉｎＡａｌｌｅｖｉａｔｅｄＡｌＣｌ３￣ｉｎｄｕｃｅｄＡＤｓｙｍｐｔｏｍｓｉｎｚｅｂｒａｆｉｓｈꎬｗｈｅｒｅｔｈｅｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆａｃｔｉｏｎｉｓｐｏｓｓｉｂｌｙａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈａｃｔｉｖａｔｅｄａｕｔｏｐｈａｇｙꎬｐｒｏｖｉｄｉｎｇａｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌｂａｓｉｓｆｏｒｔｈｅｃｌｉｎｉｃａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｏｒｏｘｉｎＡａｎｄｉｔｓｒｅｌａｔｅｄｒｅｓｅａｒｃｈｉｎｔｒｅａｔｉｎｇＡＤ.ＫｅｙｗｏｒｄｓʒＡｌｚｈｅｉｍｅｒᶄｓｄｉｓｅａｓｅꎻａｌｕｍｉｎｕｍｃｈｌｏｒｉｄｅｈｅｘａｈｙｄｒａｔｅꎻａｕｔｏｐｈａｇｙꎻｚｅｂｒａｆｉｓｈꎻｏｒｏｘｉｎＡ㊀㊀阿尔茨海默病(ＡｌｚｈｅｉｍｅｒᶄｓｄｉｓｅａｓｅꎬＡＤ)是一种常见的神经退行性疾病ꎬ主要病理特征是细胞外β￣淀粉样蛋白(ａｍｙｌｏｉｄβ￣ｐｒｏｔｅｉｎꎬＡβ)斑块的沉积和细胞内神经原纤维缠结的形成[１]ꎮＡＤ的发病机制复杂多样ꎬ目前广为认可的发病机制假说包括淀粉样蛋白级联假说㊁ｔａｕ蛋白异常磷酸化假说㊁胆碱能假说等[２]ꎮ目前针对ＡＤ的治疗ꎬ主要是胆碱酯酶抑制剂(多奈哌齐㊁加兰他敏和卡巴拉汀)和Ｎ￣甲基￣Ｄ￣天冬氨酸受体拮抗剂(美金刚)[２]ꎮ这些药物虽然能在一定程度上改善ＡＤ患者的行为和认知障碍ꎬ但并不能治愈或者预防该疾病ꎮ自噬是细胞自我降解的过程ꎬ在去除错误折叠或聚集的蛋白质㊁清除受损细胞器等方面起着重要作用[３]ꎮ研究表明自噬的增强能够降低人神经元细胞中ｔａｕ蛋白的过度磷酸化ꎬ缓解ＡＤ小鼠模型的记忆障碍[４]ꎮ杜仲雄花通过调节自噬基因异常表达来改善ＡＤ样症状[５]ꎮ自噬与ＡＤ病理之间存在复杂的联系ꎬ这表明自噬相关蛋白(ｂｅｃｌｉｎ１㊁ｕｌｋ２㊁ｕｌｋ１ｂ和ａｔｇ７)可能是ＡＤ治疗的重要靶点ꎮ中药木蝴蝶来源于紫葳科植物木蝴蝶的干燥成熟种子ꎬ具有清肺利咽㊁疏肝和胃等作用[６]ꎮ木蝴蝶苷Ａ是木蝴蝶提取而得到的一种黄酮类物质ꎮ研究表明ꎬ木蝴蝶苷Ａ具有抗氧化㊁抗炎㊁抗病毒㊁抗癌等特性ꎬ但目前还缺乏关于木蝴蝶苷Ａ对神经系统疾病作用的研究[７￣８]ꎮ斑马鱼是人类疾病和药物开发的理想模型系统ꎬ常用于研究ＡＤ㊁帕金森病㊁精神分裂症等神经退行性疾病ꎮ六水合氯化铝诱导的斑马鱼ＡＤ模型ꎬ是一种比较成熟的能够反映ＡＤ主要特征性病理变化的体内动物模型[９]ꎮ本研究中ꎬ我们使用六水合氯化铝诱导的斑马鱼ＡＤ模型ꎬ通过观察并记录斑马鱼的行为表现ꎬ检测乙酰胆碱酯酶(ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅꎬＡｃｈＥ)的活性和Ａβ斑块沉积以及测定自噬相关基因的表达变化ꎬ从而分析木蝴蝶苷Ａ对六水合氯化铝诱导的斑马鱼ＡＤ症状是否具有缓解作用ꎬ并对其机制进行探究ꎮ１㊀仪器与材料１.１㊀实验仪器Ｚ￣Ａ￣Ｓ５斑马鱼养殖系统(上海海圣公司)ꎻＺｅｂｒａＬａｂ３.３Ｚｅｂｒａｂｏｘ斑马鱼行为分析仪(法国Ｖｉｅｗｐｏｉｎｔ公司)ꎻＨＰＧ￣２８０ＢＸ光照培养箱(东联电子技术开发有限公司)ꎻ１３７２０实时荧光定量ＰＣＲ仪器(瑞士Ｒｏｃｈｅ诊断产品有限公司)ꎻＣ１０００Ｔｏｕｃｈ梯度ＰＣＲ仪(美国Ｂｉｏ￣Ｒａｄ公司)ꎻＦＶ１２００激光扫描共聚焦显微镜(日本Ｏｌｙｍｐｕｓ公司)ꎻＮａｎｏＤｒｏｐＯｎｅ超微量分光光度计(上海基因生物技术国际贸易有限公司)ꎻＳｐｅｃｔｒａＭＲ全波长酶标仪(美国Ｄｙｎｅｘ公司)ꎮ１.２㊀实验材料木蝴蝶苷Ａ(批号ＤＭ００２８ꎬ纯度ȡ９６％ꎬ成都乐美天医药科技有限公司)ꎻ六水合氯化铝(批号Ａ１１２５１１ꎬ纯度９９.９９％ꎬ上海阿拉丁生化科技股份有限公司)ꎻ盐酸多奈哌齐(批号Ｄ１２９９４８ꎬ纯度ȡ９８％ꎬ上海阿拉丁生化科技股份有限公司)ꎻＲＮＡ快速提取试剂盒(批号３１２４２３ＡＸꎬ北京艾德莱生物科技有限公司)ꎻ逆转录试剂盒(批号Ｅ０４７￣０１Ｂꎬ苏州近岸蛋白质科技股份有限公司)ꎻＢＣＡ蛋白浓度测定试剂盒(批号************ꎬ上海碧云天生物技术有限公司)ꎻ实时荧光定量ＰＣＲ试剂盒(批号Ｅ０９６￣０１Ｂꎬ苏州近岸蛋白质科技股份有限公司)ꎻ硫磺素Ｓ(批号ＭＫＣＨ４１０８ꎬ美国Ｓｉｇｍａ公司)ꎻＡｃｈＥ活性检测试剂盒(批号２０２００８２９ꎬ南京建成生物工程研究所)ꎻＮ￣苯基硫脲(批号Ｐ７６２９ꎬ美国Ｓｉｇｍａ公司)ꎻ０.３％ＴｒｉｔｏｎＸ￣１００(批号３４６６８５０ꎬ上海生工生物工程有限公司)ꎻ柠檬酸钠抗原修复液(１ˑ)(批号２０１９０３２２ꎬ北京索莱宝科技有限公司)ꎻ４％多聚甲醛(批号７１０４１８００ꎬ北京兰杰柯科技有限公司)ꎮ１.３㊀斑马鱼品系野生型ＡＢ品系斑马鱼由山东省科学院生物研究所提供ꎮ将成年斑马鱼饲养在恒温２８ħ的养殖系统中ꎬ每天同一时间段给与１４ｈ/１０ｈ的光照循环ꎬ定点喂食两次丰年虾ꎮ将成年斑马鱼按照２:２的雌雄比例于前一天分别放置于鱼缸中ꎬ用挡板将雌雄鱼分开ꎬ并于第二天早上８:３０抽取挡板ꎬ大概２ｈ后ꎬ将鱼缸中的鱼卵转移到玻璃缸中ꎬ并加入５ｇ/Ｌ的亚甲基蓝ꎬ之后放置在恒温２８ħ的光照培养箱中培养ꎮ２㊀方法２.１㊀实验分组及处理将受精后３ｄ的斑马鱼随机转移到６孔细胞培养板中ꎬ之后将斑马鱼随机分为６个组:阴性对照组ꎬ六水合氯化铝(８０μｍｏｌ/Ｌ)模型对照组ꎬ六水合氯化铝和不同浓度(５㊁１０和２０μｍｏｌ/Ｌ)木蝴蝶苷Ａ受试物共处理组ꎬ六水合氯化铝和多奈哌齐(６μｍｏｌ/Ｌ)阳性对照组ꎮ每天给药一次ꎬ之后放置在光照培养箱中培养ꎮ在斑马鱼受精后６ｄ进行明暗交替行为学观察ꎬＡｃｈＥ活性检测ꎬ斑马鱼头部Ａβ斑块数检测和实时荧光定量ＰＣＲ分析自噬相关基因的表达ꎮ２.２㊀明暗交替行为学观察将受精后６ｄ的斑马鱼(ｎ＝３２)分别吸入到４８孔板中ꎬ每孔加入１ｍＬ的养鱼水ꎮ将斑马鱼置于行为学观测箱中在１００％光照环境中适应１０ｍｉｎꎬ之后进行６０ｍｉｎ包括３组明暗交替循环(１０ｍｉｎ黑暗ꎬ１０ｍｉｎ光照)的行为学测试ꎮ实验结束后利用Ｚｅｂｒａｂｏｘ斑马鱼行为分析仪对斑马鱼的游动轨迹㊁游动速度和游动距离进行分析ꎮ２.３㊀ＡｃｈＥ活性检测将药物处理结束的受精后６ｄ的斑马鱼(ｎ＝１００)收集在１.５ｍＬ的离心管中ꎬ每管加入２００μＬ的生理盐水ꎬ之后用破碎机进行破碎匀浆ꎮ以１１０００ｒ/ｍｉｎ的转速在４ħ离心１０ｍｉｎ后取上清液ꎬ之后按照ＢＣＡ蛋白浓度测定试剂盒说明书进行操作ꎬ用全波长酶标仪测定５６２ｎｍ处的光密度值(ｏｐｔｉｃａｌｄｅｎｓｉｔｙꎬＯＤ)并计算样品的蛋白浓度ꎮ之后根据ＡｃｈＥ活性检测试剂盒的说明书ꎬ稍作修改后进行实验ꎮ具体操作为分别吸取双蒸水㊁底物缓冲液和显色应用液各５㊁５０㊁５０μＬ配置空白管所需溶液ꎻ分别吸取标准液㊁底物缓冲液和显色应用液各５㊁５０㊁５０μＬ配置标准管所需溶液ꎻ分别吸取各组斑马鱼样品蛋白上清液㊁底物缓冲液和显色应用液各５㊁５０㊁５０μＬ配置不同处理组的测定溶液ꎮ之后将各组配置好的溶液振荡混匀后加入到９６孔板中ꎬ每个处理组５次重复ꎮ在３７ħ恒温培养箱中孵育２０ｍｉｎ后ꎬ每孔加入１０μＬ的透明剂和３μＬ的抑制剂ꎮ在室温下放置１５ｍｉｎ后ꎬ使用酶标仪在４１２ｎｍ波长和０.５ｃｍ光径处测定ＯＤ值ꎬ之后根据各样品组的ＯＤ值和浓度ꎬ计算得出各处理组的ＡｃｈＥ活力ꎮ２.４㊀斑马鱼头部Ａβ斑块数检测将受精后的斑马鱼卵收到养鱼缸之后ꎬ加入１ｍｇ/ｍＬ的Ｎ￣苯基硫脲以抑制黑色素的形成ꎮ每天同一时间换一次液ꎬ其他药物处理方法同２.１节所述ꎮ将４％多聚甲醛处理后的受精后６ｄ的斑马鱼放入４ħ冰箱中过夜ꎮ第二天使用磷酸缓冲盐缓冲液(ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅꎬＰＢＳ)将斑马鱼清洗３次ꎬ每次１０ｍｉｎꎮ将清洗完的斑马鱼使用１％的琼脂凝胶固定后ꎬ进行酒精梯度脱水ꎬ二甲苯透明ꎬ石蜡浸润ꎮ之后将处理完的蜡块ꎬ以７μｍ间距进行横切切片ꎮ脱蜡之后在室温下用ＰＢＳ洗涤切片５ｍｉｎꎬ重复３次ꎮ吸干水分ꎬ用免疫组化笔将载玻片上的组织框起来ꎮ然后按照３μＬ:１ｍＬ比例配制０.３％ＴｒｉｔｏｎＸ￣１００和柠檬酸钠抗原修复液(１ˑ)ꎬ混匀后加到框起来的组织上ꎬ在４ħ冰箱孵育２０ｍｉｎ后ꎬ用ＰＢＳ清洗２次ꎬ每次５ｍｉｎꎮ用滤纸将载玻片上的ＰＢＳ完全吸干后ꎬ在免疫组化笔圈住的部分加入０.３％硫黄素Ｓꎬ并放入４ħ冰箱避光过夜ꎮ第二天用ＰＢＳ在避光环境下洗涤切片１０ｍｉｎꎬ重复３次ꎬ之后用激光扫描共聚焦显微镜观察斑马鱼头部Ａβ斑块沉积状况并进行拍照ꎮ使用Ｉｍａｇｅ￣ＰｒｏＰｌｕｓ５.１分析图像ꎬ并计数斑马鱼头部Ａβ斑块沉积数ꎮ２.５㊀实时荧光定量ＰＣＲ分析自噬相关基因的表达将药物处理结束的受精后６ｄ的斑马鱼(ｎ＝３０)收集在１.５ｍＬ的离心管中ꎬ每管加入５００μＬ的裂解液ꎬ之后用破碎机进行破碎匀浆ꎮ按照ＲＮＡ快速提取试剂盒的说明书进行ＲＮＡ提取后ꎬ利用超微量分光光度计检测不同组别斑马鱼的ＲＮＡ浓度ꎮ之后立即使用Ｃ１０００Ｔｏｕｃｈ梯度ＰＣＲ仪将ＲＮＡ进行逆转录ꎬ将逆转录得到的ｃＤＮＡ进行稀释ꎬ之后根据实时荧光定量ＰＣＲ试剂盒说明书ꎬ加入相应的引物ꎮ用实时荧光定量ＰＣＲ仪对基因进行扩增ꎬ扩增结束后ꎬ用Ｃｑ值计算各组样品基因的差异表达ꎬ选用ｒｐｌ１３ａ为内参ꎬ目的基因与内参基因的Ｃｑ差值用ΔＣｑ表示ꎬΔΔＣｑ值为各样品的ΔＣｑ值与Ｃｔｌ组ΔＣｑ值平均数的差值ꎬｍＲＮＡ的相对表达量根据２－ΔΔＣｑ相对定量法计算ꎬ每组设置３个重复组ꎮ引物序列见表１ꎮ表１㊀实时荧光定量ＰＣＲ所需引物序列信息ＴａｂｌｅＰＣＲｒｐｌ１３ａ上游:ＴＣＴＧＧＡＧＧＡＣＴＧＴＡＡＧＡＧＧＴＡＴＧＣ下游:ＡＧＡＣＧＣＡＣＡＡＴＣＴＴＧＡＧＡＧＣＡＧｂｅｃｌｉｎ１上游:ＧＴＴＣＡＧＧＴＧＧＴＣＴＧＣＧＴＴＴＴ下游:ＧＣＡＡＡＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＴＧＴＣＡｕｌｋ１ｂ上游:ＡＧＧＣＣＧＡＡＡＧＴＣＴＣＡＣＴＴＣＡ下游:ＡＧＣＣＡＴＧＴＡＣＡＴＣＧＧＡＧＡＣＣｕｌｋ２上游:ＡＣＣＴＣＴＧＡＴＴＧＧＣＴＧＡＣＡＡＡＡＴ下游:ＧＡＧＡＴＴＧＣＡＡＧＡＧＧＣＴＴＧＡＧＴＴａｔｇ７上游:ＡＧＡＧＴＣＣＡＧＴＣＣＧＡＴＧＴＣ下游:ＡＧＡＡＧＴＡＡＣＡＧＣＣＧＡＧＡＣＧ２.６㊀分子对接的准备过程木蝴蝶苷Ａ的３Ｄ结构从ＰｕｂＣｈｅｍ(ｈｔｔｐｓ://ｐｕｂｃｈｅｍ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ/)数据库中下载ꎬ自噬相关蛋白(ｂｅｃｌｉｎ１㊁ｕｌｋ１ｂ㊁ｕｌｋ２和ａｔｇ７)的３Ｄ结构从ＰｒｏｔｅｉｎＤａｔａＢａｎｋ(ｈｔｔｐｓ://ｗｗｗ.ｒｃｓｂ.ｏｒｇ/)数据库下载ꎮ使用薛定谔分子对接软件对自噬相关蛋白进行加氢㊁去水等处理ꎬ之后将自噬相关蛋白和木蝴蝶苷Ａ进行对接ꎬ以对接分数作为分子对接的结果ꎬ最后借助Ｐｙｍｏｌ进行可视化分析ꎮ２.７㊀统计分析使用ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ７.０通过单向方差分析和双向方差分析进行统计分析ꎬ结果用ｘʃｓ表示ꎬＰ<０.０５表示差异有统计学意义ꎮ３㊀结果３.１㊀木蝴蝶苷Ａ具有缓解六水合氯化铝诱导的斑马鱼运动障碍作用如图１(ａ)和１(ｂ)所示ꎬ与空白对照组的斑马鱼相比ꎬ六水合氯化铝模型对照组中斑马鱼的游动总距离明显变短(Ｐ<０.００１)ꎬ游动速度减缓ꎮ与六水合氯化铝模型对照组相比ꎬ不同浓度的木蝴蝶苷Ａ受试物(５㊁１０㊁２０μｍｏｌ/Ｌ)与六水合氯化铝共同处理时ꎬ斑马鱼的游动总距离(Ｐ＝０.００９ꎬＰ＝０.００２ꎬＰ<０.００１)和速度均显著增加ꎮ与六水合氯化铝模型对照组相比ꎬ六水合氯化铝和多奈哌齐阳性对照组的速度和总距离有所增加ꎬ其结果(Ｐ＝０.２３)不具有统计学意义ꎮ如图１(ａ)所示ꎬ在黑暗环境下ꎬ不同药物处理组斑马鱼的游动距离变化与总游动距离变化具有一致性ꎮ以上结果表明ꎬ木蝴蝶苷Ａ对六水合氯化铝诱导的斑马鱼运动障碍具有一定的缓解作用ꎮ注:∗∗Ｐ<０.０１ｖｓ.空白对照组ꎬ∗∗∗Ｐ<０.００１ｖｓ.空白对照组ꎻ＃＃Ｐ<０.０１ｖｓ.模型对照组ꎬ＃＃＃Ｐ<０.００１ｖｓ.模型对照组ꎻｎ＝３２ꎻ红色线为快速游动轨迹ꎬ绿色线为中速游动轨迹ꎬ黑色线为慢速游动轨迹ꎮ图１㊀木蝴蝶苷Ａ对六水合氯化铝诱导的斑马鱼运动障碍的影响Ｆｉｇ.１㊀ＥｆｆｅｃｔｏｆｏｒｏｘｉｎＡｏｎａｌｕｍｉｎｕｍｃｈｌｏｒｉｄｅｈｅｘａｈｙｄｒａｔｅ￣ｉｎｄｕｃｅｄｌｏｃｏｍｏｔｉｏｎｉｍｐａｉｒｍｅｎｔｓｉｎｚｅｂｒａｆｉｓｈ３.２㊀木蝴蝶苷Ａ对斑马鱼头部Ａβ斑块沉积的抑制作用如图２(ａ)和２(ｂ)所示ꎬ与空白对照组相比ꎬ六水合氯化铝模型对照组的斑马鱼大脑中Ａβ斑块的数明显增多(Ｐ<０.００１)ꎮ与六水合氯化铝模型对照组相比ꎬ六水合氯化铝和多奈哌齐阳性对照组中Ａβ斑块沉积数减少(Ｐ＝０.０６)ꎬ六水合氯化铝和木蝴蝶苷Ａ受试物组的Ａβ斑块沉积数显著降低(Ｐ＝０.０３ꎬＰ＝０.００２)ꎮ注:∗∗∗Ｐ<０.００１ｖｓ.空白对照组ꎻ＃Ｐ<０.０５ｖｓ.模型对照组ꎬ＃＃Ｐ<０.０１ｖｓ.模型对照组ꎻｎ＝８ꎮ图２㊀木蝴蝶苷Ａ对斑马鱼头部Ａβ斑块沉积的抑制Ｆｉｇ.２㊀ＩｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｏｒｏｘｉｎＡｏｎＡβｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｚｅｂｒａｆｉｓｈ３.３㊀木蝴蝶苷Ａ对ＡｃｈＥ活性的抑制作用抑制ＡｃｈＥ活性ꎬ可以提高脑中的乙酰胆碱水平ꎬ从而改善ＡＤ患者的学习记忆障碍[１０]ꎮ在本实验中ꎬ研究探讨了木蝴蝶苷Ａ对六水合氯化铝处理的斑马鱼ＡｃｈＥ活性的影响ꎮ如图３所示ꎬ与空白对照组相比ꎬ六水合氯化铝模型对照组斑马鱼的ＡｃｈＥ活性显著增加(Ｐ<０.００１)ꎮ与六水合氯化铝模型对照组相比ꎬ六水合氯化铝和多奈哌齐阳性对照组中斑马鱼的ＡｃｈＥ活性显著降低(Ｐ＝０.００８)ꎬ在六水合氯化铝和木蝴蝶苷Ａ受试物组中斑马鱼的ＡｃｈＥ活性也显著降低(Ｐ<０.００１)ꎬ且剂量与效应呈正相关ꎮ注:∗∗Ｐ<０.０１ｖｓ.空白对照组ꎻ＃＃Ｐ<０.０１ｖｓ.模型对照组ꎬ＃＃＃Ｐ<０.０１ｖｓ.模型对照组ꎻｎ＝５ꎮ图３㊀木蝴蝶苷Ａ对斑马鱼ＡｃｈＥ活性的抑制Ｆｉｇ.３㊀ＩｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｏｒｏｘｉｎＡｏｎｔｈｅＡｃｈＥａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｚｅｂｒａｆｉｓｈ３.４㊀木蝴蝶苷Ａ对自噬相关基因表达的影响如图４所示ꎬ与空白对照组相比ꎬ六水合氯化铝模型对照组中ｂｅｃｌｉｎ１㊁ｕｌｋ１ｂ㊁ｕｌｋ２㊁和ａｔｇ７的表达明显下调(Ｐ＝０.０２ꎬＰ<０.００１ꎬＰ<０.００１ꎬＰ<０.００１)ꎮ如图４(ａ)所示ꎬ与六水合氯化铝模型对照组相比ꎬ六水合氯化铝与５㊁２０μｍｏｌ/Ｌ木蝴蝶苷Ａ受试物组ｂｅｃｌｉｎ１表达明显上调(Ｐ＝０.００１ꎬＰ<０.００１)ꎻ如图４(ｂ)所示ꎬ六水合氯化铝与不同浓度木蝴蝶苷Ａ(５㊁１０㊁２０μｍｏｌ/Ｌ)受试物组中ｕｌｋ１ｂ的表达明显上调(Ｐ<０.００１ꎬＰ<０.００１ꎬＰ<０.００１)ꎻ如图４(ｃ)所示ꎬ六水合氯化铝与５㊁２０μｍｏｌ/Ｌ木蝴蝶苷Ａ受试物组ｕｌｋ２表达明显上调(Ｐ<０.００１ꎬＰ<０.００１)ꎻ如图４(ｄ)所示ꎬ六水合氯化铝与不同浓度木蝴蝶苷Ａ(５㊁１０㊁２０μｍｏｌ/Ｌ)受试物ａｔｇ７的表达也明显上调(Ｐ＝０.０１ꎬＰ<０.００１ꎬＰ<０.００１)ꎮ注:∗Ｐ<０.０５ｖｓ.空白对照组ꎬ∗∗∗Ｐ<０.００１ｖｓ.空白对照组ꎻ＃Ｐ<０.０５ｖｓ.六水合氯化铝ꎬ＃＃Ｐ<０.０１ｖｓ.六水合氯化铝ꎬ＃＃＃Ｐ<０.０１ｖｓ.六水合氯化铝ꎻｎ＝４０ꎮ图４㊀木蝴蝶苷Ａ对自噬相关基因表达的影响Ｆｉｇ.４㊀ＥｆｆｅｃｔｓｏｆｏｒｏｘｉｎＡｏｎａｕｔｏｐｈａｇｙｒｅｌａｔｅｄｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ３.５㊀分子对接结果通过２.６方法对木蝴蝶苷Ａ与自噬相关蛋白(ｂｅｃｌｉｎ１㊁ｕｌｋ１ｂ㊁ｕｌｋ２和ａｔｇ７)进行分子对接ꎬ得出图５ꎬ即ｂｅｌｃｌｉｎ１(ＰＤＢＩＤ:４ＺＷ１)与木蝴蝶苷Ａ的对接㊁ｕｌｋ１ｂ(ＰＤＢＩＤ:６ＹＩＤ)与木蝴蝶苷Ａ的对接㊁ｕｌｋ２(ＰＤＢＩＤ:６ＱＡＴ)与木蝴蝶苷Ａ的对接㊁ａｔｇ７(ＰＤＢＩＤ:４ＰＨ４)与木蝴蝶苷Ａ的对接ꎮ木蝴蝶苷Ａ与ｂｅｌｃｌｉｎ１㊁ｕｌｋ１ｂ㊁ｕｌｋ２和ａｔｇ７的对接分数分别为－６.７０７㊁－７.７０８㊁－７.８８８㊁－７.２４９ꎬ这说明木蝴蝶苷Ａ对自噬相关蛋白发挥调控作用ꎮ图５㊀木蝴蝶苷Ａ与自噬相关蛋白的对接结果Ｆｉｇ.５㊀Ｄｏｃｋｉｎｇｒｅｓｕｌｔｓｏｆａｕｔｏｐｈａｇｙ￣ｒｅｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓｗｉｔｈｏｒｏｘｉｎＡｓｈｏｗｉｎｇｔｈｅｂｉｎｄｉｎｇ４㊀讨论与结论ＡＤ是一种进行性神经退行性疾病ꎬ可导致神经元丧失㊁脑萎缩和死亡ꎮ研究表明ꎬ木蝴蝶能够改善ＡＤ小鼠的学习记忆能力ꎬ但具体哪些化学成分起作用还未见报道ꎬ所以我们利用六水合氯化铝诱导的斑马鱼ＡＤ模型去探讨木蝴蝶苷Ａ的抗ＡＤ活性ꎮ正常斑马鱼在面对突然的刺激时ꎬ会表现出快速的保护反应ꎮ研究表明斑马鱼幼鱼在受精后４ｄ后暴露于明暗交替的刺激时ꎬ在光亮中运动活动会突然增加[１１]ꎮ斑马鱼明暗交替行为学测试常被用来识别测定药物的神经保护活性ꎬ通过评估斑马鱼的游动轨迹㊁游动距离和速度ꎬ可以了解其神经行为效应[１０]ꎮ在本研究中ꎬ明暗交替行为学测试表明ꎬ与空白对照组相比六水合氯化铝模型组的斑马鱼游动速度减慢ꎬ游动距离变短ꎬ表明斑马鱼的认知能力受损ꎬ反应迟缓ꎬ不能对外界刺激做出及时的反应ꎮ而经过木蝴蝶苷Ａ的处理ꎬ这种表现有所改变ꎬ这提示木蝴蝶苷Ａ对六水合氯化铝诱导的斑马鱼运动障碍具有缓解作用ꎮＡＤ的特征在于海马和新皮层中ＡｃｈＥ活性升高ꎬ使ＡＤ患者脑内乙酰胆碱水平降低ꎬ影响神经信号的传递ꎬ从而损伤学习记忆能力[１２]ꎮ抑制ＡｃｈＥ活性ꎬ可以提高脑中的乙酰胆碱水平ꎬ改善ＡＤ患者的学习记忆障碍[１３]ꎮ有研究表明暴露于六水合氯化铝的斑马鱼在５０~２５０μｍｏｌ/Ｌ的浓度范围内显示出ＡｃｈＥ活性增加ꎬ运动活性缺乏[１４]ꎮ我们的研究结果表明ꎬ六水合氯化铝和木蝴蝶苷Ａ受试物组的斑马鱼ＡｃｈＥ的活性水平降低ꎬ这说明木蝴蝶苷Ａ能够抑制ＡｃｈＥ活性ꎬ减少乙酰胆碱的水解ꎮＡβ的细胞毒性已在众多体内和体外研究中得到证实ꎬ脑实质中Ａβ斑块的沉积在ＡＤ发病机制中起着核心作用[１５]ꎮＡβ沉积会引发一系列相关反应ꎬ导致ｔａｕ蛋白的错误折叠和组装ꎬ进而将病变扩散到整个神经回路和皮层ꎬ最终损害神经系统ꎬ导致认知能力下降[１６]ꎮ我们的研究表明ꎬ木蝴蝶苷Ａ明显降低了ＡＤ模型中斑马鱼头部的Ａβ斑块计数ꎮ以上表明木蝴蝶苷Ａ能够缓解六水合氯化铝诱导的ＡＤ样症状ꎮ为了进一步探究木蝴蝶苷Ａ是如何发挥抗ＡＤ活性的ꎬ我们进行了机制探究ꎮ自噬在Ａβ的生成和代谢中起重要作用ꎬ与ＡＤ发病进展密切相关[１７]ꎮｂｅｃｌｉｎ１是酵母自噬蛋白ａｔｇ６和ａｐｇ６的同系物ꎬ被认为是自噬体形成的标记蛋白ꎮ研究表明抑制ｂｅｃｌｉｎ１的表达会增加ＡＤ中Ａβ的聚集ꎬ从而加速神经病变[１８]ꎮ还有研究表明ＡＤ患者神经元ｂｅｃｌｉｎ１表达明显下降[１９]ꎮ在本研究中ꎬ六水合氯化铝模型组ꎬｂｅｃｌｉｎ１的基因表达量明显下调ꎬ六水合氯化铝和木蝴蝶苷Ａ受试物组ｂｅｃｌｉｎ１的表达量上调ꎬ说明木蝴蝶苷Ａ能够促进Ａβ在细胞内部降解ꎮｕｌｋ１ｂ具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性ꎬｕｌｋ２和ｕｌｋ１ｂ在自噬的起始阶段发挥着重要的调控作用[２０]ꎮ六水合氯化铝模型组ｕｌｋ２和ｕｌｋ１ｂ的表达明显下调ꎬ而六水合氯化铝和木蝴蝶苷Ａ受试物组ｕｌｋ２和ｕｌｋ１ｂ的表达明显上调ꎬ说明木蝴蝶苷Ａ能够激活自噬的表达ꎮａｔｇ７是与自噬相关的细胞降解和再循环的必需蛋白质ꎬ主要参与自噬小体的形成ꎬ是调节自噬偶联系统的关键基因[２１]ꎮ研究发现ＡＤ小鼠模型大脑皮层和海马体中ａｔｇ７蛋白水平降低[２２]ꎮ六水合氯化铝模型组ꎬａｔｇ７的表达明显降低ꎬ抑制了自噬的过程ꎬ而六水合氯化铝和木蝴蝶苷Ａ受试物组ａｔｇ７的表达明显上调ꎬ说明ａｔｇ７激活了自噬ꎬ可能促进自噬性溶酶体的形成ꎬ恢复细胞内稳态ꎮ基于分子对接初步模拟木蝴蝶苷Ａ与自噬相关蛋白(ｂｅｃｌｉｎ１㊁ｕｌｋ１ｂ㊁ｕｌｋ２和ａｔｇ７)之间的分子作用机制ꎬ对接分数的大小直接反应预测结果的可靠性ꎬ对接分数越小表示结合活性越高ꎮ其对接分数均为负数ꎬ表明木蝴蝶苷Ａ与自噬相关蛋白(ｂｅｃｌｉｎ１㊁ｕｌｋ１ｂ㊁ｕｌｋ２和ａｔｇ７)具有良好的结合能力ꎮ这进一步验证了木蝴蝶苷Ａ能对自噬相关蛋白发挥调控作用ꎬ但后续仍需进一步的生物实验验证ꎮ本研究通过对六水合氯化铝诱导的斑马鱼行为的观察㊁ＡｃｈＥ活性的检测以及Ａβ斑块的沉积情况ꎬ预测了木蝴蝶苷Ａ对ＡＤ的潜在治疗作用ꎮ实时荧光定量ＰＣＲ以及分子对接的结果提示木蝴蝶苷Ａ可能通过激活自噬ꎬ从而发挥抗ＡＤ活性ꎮ本研究为治疗ＡＤ药物研发拓展了新思路ꎬ但还需要采取哺乳动物实验及临床试验等方法做进一步的验证ꎮ参考文献:[１]ＴＡＴＵＬＩＡＮＳＡ.ＣｈａｌｌｅｎｇｅｓａｎｄｈｏｐｅｓｆｏｒＡｌｚｈｅｉｍｅｒᶄｓｄｉｓｅａｓｅ[Ｊ].ＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖｅｒｙＴｏｄａｙꎬ２０２２ꎬ２７(４):１０２７￣１０４３.ＤＯＩ:１０.１０１６/ｊ.ｄｒｕｄｉｓ.２０２２.０１.０１６.[２]ＴＡＭＫꎬＪＵＹＪ.ＰａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌｍｅｃｈａｎｉｓｍｓａｎｄｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓｔｒａｔｅｇｉｅｓｆｏｒＡｌｚｈｅｉｍｅｒᶄｓｄｉｓｅａｓｅ[Ｊ].ＮｅｕｒａｌＲｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎＲｅｓｅａｒｃｈꎬ２０２２ꎬ１７(３):５４３.ＤＯＩ:１０.４１０３/１６７３￣５３７４.３２０９７０.[３]ＳＲＩＲＡＭＮꎬＳＡＨＭＫ.ＲｅｇｕｌａｔｏｒｙｉｎｓｉｇｈｔｓｉｎｔｏｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃａｎｃｅｒａｎｄＡｌｚｈｅｉｍｅｒᶄｓｄｉｓｏｒｄｅｒｆｒｏｍａｕｔｏｐｈａｇｙｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ[Ｊ].ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＲｅｐｏｒｔｓꎬ２０２１ꎬ４８(１２):８２２７￣８２３２.ＤＯＩ:１０.１００７/ｓ１１０３３￣０２１￣０６８３８￣４.[４]ＦＡＮＧＥＦꎬＨＯＵＹＪꎬＰＡＬＩＫＡＲＡＳＫꎬｅｔａｌ.Ｍｉｔｏｐｈａｇｙｉｎｈｉｂｉｔｓａｍｙｌｏｉｄ￣βａｎｄｔａｕｐａｔｈｏｌｏｇｙａｎｄｒｅｖｅｒｓｅｓｃｏｇｎｉｔｉｖｅｄｅｆｉｃｉｔｓｉｎｍｏｄｅｌｓｏｆＡｌｚｈｅｉｍｅｒᶄｓｄｉｓｅａｓｅ[Ｊ].ＮａｔｕｒｅＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅꎬ２０１９ꎬ２２(３):４０１￣４１２.ＤＯＩ:１０.１０３８/ｓ４１５９３￣０１８￣０３３２￣９. [５]ＳＵＮＣꎬＺＨＡＮＧＳＳꎬＢＡＳＫꎬｅｔａｌ.ＥｕｃｏｍｍｉａｕｌｍｏｉｄｅｓｏｌｉｖｅｍａｌｅｆｌｏｗｅｒｅｘｔｒａｃｔｓＡｍｅｌｉｏｒａｔｅａｌｚｈｅｉｍｅｒᶄｓｄｉｓｅａｓｅ￣ｌｉｋｅｐａｔｈｏｌｏｇｙｉｎｚｅｂｒａｆｉｓｈｖｉａｒｅｇｕｌａｔｉｎｇａｕｔｏｐｈａｇｙꎬａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅꎬａｎｄｔｈｅｄｏｐａｍｉｎｅｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ[Ｊ].ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅꎬ２０２２ꎬ１５:９０１９５３.ＤＯＩ:１０.３３８９/ｆｎｍｏｌ.２０２２.９０１９５３.[６]国家药典委员会.中华人民共和国药典２０２０年版二部[Ｍ].北京:中国医药科技出版社ꎬ２０２０.[７]ＣＨＥＮＧＸＤꎬＨＵＡＮＧＴＴꎬＷＡＮＧＣＨꎬｅｔａｌ.ＮａｔｕｒａｌｃｏｍｐｏｕｎｄｌｉｂｒａｒｙｓｃｒｅｅｎｉｎｇｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓｏｒｏｘｉｎＡｆｏｒｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｍｙｏｃａｒｄｉａｌｉｓｃｈｅｍｉａ/ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎｉｎｊｕｒｙ[Ｊ].ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙꎬ２０２２ꎬ１３:８９４８９９.ＤＯＩ:１０.３３８９/ｆｐｈａｒ.２０２２.８９４８９９. [８]鲁冰冰.木蝴蝶苷Ａ对食管鳞癌增殖的抑制作用及其机制的研究[Ｄ].郑州:郑州大学ꎬ２０２０.[９]任擎宇ꎬ靳梦ꎬ商学良ꎬ等.基于网络药理学和斑马鱼模型的金盏菊缓解阿尔茨海默病症状及作用机制[Ｊ].中国药理学通报ꎬ２０２２ꎬ３８(３):４２９￣４３６.ＤＯＩ:１０.１２３６０/ＣＰＢ２０２１０８０７５.[１０]ＢＡＳＮＥＴＲＭꎬＺＩＺＩＯＬＩＤꎬＴＡＷＥＥＤＥＴＳꎬｅｔａｌ.Ｚｅｂｒａｆｉｓｈｌａｒｖａｅａｓａｂｅｈａｖｉｏｒａｌｍｏｄｅｌｉｎｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ[Ｊ].Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅｓꎬ２０１９ꎬ７(１):２３.ＤＯＩ:１０.３３９０/ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅｓ７０１００２３.[１１]ＳＨＥＮＯＹＡꎬＢＡＮＥＲＪＥＥＭꎬＵＰＡＤＨＹＡＡꎬｅｔａｌ.Ｔｈｅｂｒｉｌｌｉａｎｃｅｏｆｔｈｅｚｅｂｒａｆｉｓｈｍｏｄｅｌ:ｐｅｒｃｅｐｔｉｏｎｏｎｂｅｈａｖｉｏｒａｎｄａｌｚｈｅｉｍｅｒᶄｓｄｉｓｅａｓｅ[Ｊ].ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＢｅｈａｖｉｏｒａｌＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅꎬ２０２２ꎬ１６:８６１１５５.ＤＯＩ:１０.３３８９/ｆｎｂｅｈ.２０２２.８６１１５５.[１２]ＰＡＴＩＬＤＮꎬＰＡＴＩＬＳＡꎬＳＩＳＴＬＡＳꎬｅｔａｌ.Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ:Ａｓｃｒｅｅｎｉｎｇｔｏｏｌｆｏｒａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ[Ｊ].ＰＬｏＳＯｎｅꎬ２０１９ꎬ１４(５):ｅ０２１５２９１.ＤＯＩ:１０.１３７１/ｊｏｕｒｎａｌ.ｐｏｎｅ.０２１５２９１.[１３]ＳＡＸＥＮＡＭꎬＤＵＢＥＹＲ.ＴａｒｇｅｔｅｎｚｙｍｅｉｎＡｌｚｈｅｉｍｅｒᶄｓｄｉｓｅａｓｅ:ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ[Ｊ].ＣｕｒｒｅｎｔＴｏｐｉｃｓｉｎＭｅｄｉｃｉｎａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙꎬ２０１９ꎬ１９(４):２６４￣２７５.ＤＯＩ:１０.２１７４/１５６８０２６６１９６６６１９０１２８１２５９１２.[１４]ＳＥＮＧＥＲＭＲꎬＳＥＩＢＴＫＪꎬＧＨＩＳＬＥＮＩＧＣꎬｅｔａｌ.Ａｌｕｍｉｎｕｍｅｘｐｏｓｕｒｅａｌｔｅｒｓｂｅｈａｖｉｏｒａｌｐａｒａｍｅｔｅｒｓａｎｄｉｎｃｒｅａｓｅｓａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｚｅｂｒａｆｉｓｈ(Ｄａｎｉｏｒｅｒｉｏ)ｂｒａｉｎ[Ｊ].ＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＴｏｘｉｃｏｌｏｇｙꎬ２０１１ꎬ２７(３):１９９￣２０５.ＤＯＩ:１０.１００７/ｓ１０５６５￣０１１￣９１８１￣ｙ.[１５]ＷＡＬＳＨＤＭꎬＳＥＬＫＯＥＤＪ.Ａｍｙｌｏｉｄβ￣ｐｒｏｔｅｉｎａｎｄｂｅｙｏｎｄ:ｔｈｅｐａｔｈｆｏｒｗａｒｄｉｎＡｌｚｈｅｉｍｅｒᶄｓｄｉｓｅａｓｅ[Ｊ].ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＮｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ２０２０ꎬ６１:１１６￣１２４.ＤＯＩ:１０.１０１６/ｊ.ｃｏｎｂ.２０２０.０２.００３.[１６]ＢＵＳＣＨＥＭＡꎬＷＥＧＭＡＮＮＳꎬＤＵＪＡＲＤＩＮＳꎬｅｔａｌ.Ｔａｕｉｍｐａｉｒｓｎｅｕｒａｌｃｉｒｃｕｉｔｓꎬｄｏｍｉｎａｔｉｎｇａｍｙｌｏｉｄ￣βｅｆｆｅｃｔｓꎬｉｎＡｌｚｈｅｉｍｅｒｍｏｄｅｌｓｉｎｖｉｖｏ[Ｊ].ＮａｔｕｒｅＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅꎬ２０１９ꎬ２２(１):５７￣６４.ＤＯＩ:１０.１０３８/ｓ４１５９３￣０１８￣０２８９￣８.[１７]ＤＥＮＧＺＱꎬＤＯＮＧＹꎬＺＨＯＵＸＴꎬｅｔａｌ.ＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌｍｏｄｕｌａｔｉｏｎｏｆａｕｔｏｐｈａｇｙｆｏｒＡｌｚｈｅｉｍｅｒᶄｓｄｉｓｅａｓｅｔｈｅｒａｐｙ:Ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓａｎｄｏｂｓｔａｃｌｅｓ[Ｊ].ＡｃｔａＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａＳｉｎｉｃａＢꎬ２０２２ꎬ１２(４):１６８８￣１７０６.ＤＯＩ:１０.１０１６/ｊ.ａｐｓｂ.２０２１.１２.００９. [１８]ＰＩＣＫＦＯＲＤＦꎬＭＡＳＬＩＡＨＥꎬＢＲＩＴＳＣＨＧＩＭꎬｅｔａｌ.Ｔｈｅａｕｔｏｐｈａｇｙ￣ｒｅｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｂｅｃｌｉｎ１ｓｈｏｗｓｒｅｄｕｃｅｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｅａｒｌｙＡｌｚｈｅｉｍｅｒｄｉｓｅａｓｅａｎｄｒｅｇｕｌａｔｅｓａｍｙｌｏｉｄｂｅｔａａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｉｎｍｉｃｅ[Ｊ].ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎꎬ２００８ꎬ１１８(６):２１９０￣２１９９.ＤＯＩ:１０.１１７２/ＪＣＩ３３５８５.[１９]ＪＡＥＧＥＲＰＡꎬＰＩＣＫＦＯＲＤＦꎬＳＵＮＣＨꎬｅｔａｌ.Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆａｍｙｌｏｉｄｐｒｅｃｕｒｓｏｒｐｒｏｔｅｉｎｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇｂｙｔｈｅｂｅｃｌｉｎ１ｃｏｍｐｌｅｘ[Ｊ].ＰＬｏＳＯｎｅꎬ２０１０ꎬ５(６):ｅ１１１０２.ＤＯＩ:１０.１３７１/ｊｏｕｒｎａｌ.ｐｏｎｅ.００１１１０２.[２０]ＭＣＡＬＰＩＮＥＦꎬＷＩＬＬＩＡＭＳＯＮＬＥꎬＴＯＯＺＥＳＡꎬｅｔａｌ.Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｎｕｔｒｉｅｎｔ￣ｓｅｎｓｉｔｉｖｅａｕｔｏｐｈａｇｙｂｙｕｎｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ５１￣ｌｉｋｅｋｉｎａｓｅｓ１ａｎｄ２[Ｊ].Ａｕｔｏｐｈａｇｙꎬ２０１３ꎬ９(３):３６１￣３７３.ＤＯＩ:１０.４１６１/ａｕｔｏ.２３０６６.[２１]任李梅ꎬ杨松ꎬ卢姝言ꎬ等.人参总皂苷在巨噬细胞ＲＡＷ２６４.７中降低脂多糖诱导的炎症和氧化应激[Ｊ].中国医院药学杂志ꎬ２０２２ꎬ４２(９):８９６￣９０１.ＤＯＩ:１０.１３２８６/ｊ.１００１￣５２１３.２０２２.０９.０４.[２２]ＣＡＲＶＡＬＨＯＣꎬＳＡＮＴＯＳＭＳꎬＯＬＩＶＥＩＲＡＣＲꎬｅｔａｌ.Ａｌｚｈｅｉｍｅｒᶄｓｄｉｓｅａｓｅａｎｄｔｙｐｅ２ｄｉａｂｅｔｅｓ￣ｒｅｌａｔｅｄａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓｉｎｂｒａｉｎｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａꎬａｕｔｏｐｈａｇｙａｎｄｓｙｎａｐｔｉｃｍａｒｋｅｒｓ[Ｊ].ＢｉｏｃｈｉｍｉｃａｅｔＢｉｏｐｈｙｓｉｃａＡｃｔａ(ＢＢＡ)￣ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢａｓｉｓｏｆＤｉｓｅａｓｅꎬ２０１５ꎬ１８５２(８):１６６５￣１６７５.ＤＯＩ:１０.１０１６/ｊ.ｂｂａｄｉｓ.２０１５.０５.００１.。