激光扫描共聚焦光谱成像系统_张运海

皮肤反射式共聚焦显微成像扫描畸变校正刘创1,2，张运海1，黄维1,2，唐玉国1(1.中国科学院苏州生物医学工程技术研究所江苏省医用光学重点实验室，江苏苏州215163；2.中国科学院大学，北京100049)摘要:皮肤反射式共聚焦显微镜是一种重要的皮肤影像学诊断工具，其采用共振型振镜扫描成像会带来非线性畸变，为校正这种畸变，提出一种像素值反正弦过采样信号重建的RCM 图像畸变校正方法，对间距为20μm 的矩形光栅扫描成像实验表明，在校正畸变前光栅图像间距的标准差为7.78μm ，图像的畸变率达到38.9%，经过像素值反正弦过采样信号重建后，光栅图像间距的标准差缩小为0.85μm ，畸变率缩小到4.2%。

结合分辨率板和实际人皮肤成像情况，表明文中提出的畸变校正方法能够较好地校正共振型振镜引起的图像畸变，满足人皮肤实时无创影像学诊断要求。

关键词:共聚焦显微镜；共振型振镜；非线性畸变中图分类号:TP391.4文献标志码:ADOI :10.3788/IRLA201847.1041003Correction of reflectance confocal microscopy for skin imagingdistortion due to scanLiu Chuang 1,2,Zhang Yunhai 1,Huang Wei 1,2,Tang Yuguo 1(1.Jiangsu Key Laboratory of Medical Optics,Suzhou Institute of Biomedical Engineering and Technology,Chinese Academy of Sciences,Suzhou 215163,China;2.University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,China)Abstract:Reflectance Confocal Microscopy for skin (RCM)is an important skin imaging diagnostic tool,which uses resonant galvanometer that will result in nonlinear distortion at image.In order to correct the distortion,a method of anti -sine signal oversampling based pixel using isochronous sampling system to correct the distorted RCM image caused by resonant galvanometer was presented.The results of experiments on the rectangular grating with a pitch of 20μm indicate that,the standard deviation of the grating spacing is 7.78μm.The distortion rate of image before being corrected is 38.9%.The standard deviation of the image corrected by the anti⁃sine signal over⁃sampling based pixel method is 0.85μm,so the distortion rate is reduced to 4.2%.According to the results of a resolution plate and the actual human skin imaging,the distortion correction method proposed in this paper can correct the image distortion caused by resonant galvanometer and meet the human skin real⁃time non⁃invasive imaging diagnostic requirements.Key words:confocal microscopy;resonant galvanometer;nonlinear distortion收稿日期:2018-05-05;修订日期:2018-06-03基金项目:(2017YFC0110303);(ZDYZ2013-1);(BK20160363);(SYG201510);(SS201643)作者简介:(1992-),,,。

2021年2月Feb. 2021第50卷第2期Vol.50 No.2红外与激光工程Infrared and Laser EngineeringMEMS 振镜扫描共聚焦图像畸变机理分析及校正缪 新叫李航锋1,张运海心，王发民込施 辛彳(1.中国科学技术大学，安徽合肥230026；2.中国科学院苏州生物医学工程技术研究所江苏省医用光学重点实验室，江苏苏州215163;3.苏州大学附属第二医院，江苏苏州215000)摘要：在皮肤反射式共聚焦显微成像过程中，针对MEMS 振镜二维扫描引起的共聚焦图像畸变，开 展了光束偏转理论分析，得出了投影面扫描图像的具体形状表征,理论畸变图像与真实畸变图像一致， 明确了畸变机理，提出一种有效的畸变校正算法，实现对图像二维畸变的校正。

首先记录原始光栅畸变图像，然后基于Hessian 矩阵提取光栅中心线，拾取特征点并设置基准参考线，通过基于最小二乘法 的7次多项式插值法标定二维方向像素畸变校正量，采用加权平均法填补间隙像素灰度值，最终实现图像畸变校正。

利用网格畸变测试靶实验得出7次多项式插值后的校正决定系数最高、均方根误差值 最低，整幅512行图像在7次多项式插值后最优行数占379行，比例为74%,通过残差分析，二维方向 上残差最大为4个像素，最小为0个像素，平均为1.15个像素，校正结果较为精确。

皮肤在体实时成像实验显示，图像畸变校正后组织结构特征更加真实准确，表明这种校正算法有效可行，有助于皮肤疾 病的准确诊断。

关键词：图像二维畸变；机理分析；Hessian 矩阵；光栅；多项式插值 中图分类号：TH742.9文献标志码：A DOI ： 10.3788/IRLA20200206Analysis and correction of image distortion in MEMSgalvanometer scanning confocal systemMiao Xin 12, Li Hangfeng 1, Zhang Yunhai 1,2*, Wang Famin 1,2, Shi Xin 3(1. University of Science and Technology of China, Hefei 230026, China;2. Jiangsu Key Laboratory of Medical Optics, Suzhou Institute of Biomedical Engineering and Technology,Chinese Academy of Sciences, Suzhou 215163, China;3. The Second Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215000, China)Abstract: Aiming at the distorted confocal images caused by the two-dimensional scanning of MEMS galvanometer during skin imaging by reflectance confocal microscopy, the theoretical analysis of beam deflectionwas carried out, and the specific shape representation of projection plane scanning image was obtained. It was concluded that the theoretical distortion image was consistent with the real distortion image. The distortionmechanism was clarified and a distortion correction method was proposed. First, the original distorted grating image was recorded, then the center lines of grating were obtained based on the Hessian matrix, after that feature points were picked and datum reference lines were set. Finally, the correction to the distorted confocal images wasrealized by calibrating the corrections of the two-dimensional pixel distortions using polynomial interpolation收稿日期：2020-10-12；修订日期:2020-11-15基金项目:国家重点研发计划(2017YFC0110305)；山东省自然科学基金(ZR2019BF012)；济南市“高校20条”资助项目(2018GXRC018)；苏州市民生科技项目(SS201643)红外与激光工程第50卷第2期based on the least square method and filling the gray value of gap pixels by weighted average method.By the experiment of measuring target with grid distortion,the correction coefficient was the highest and the root mean square error was the lowest after polynomial interpolation of degree7.Also,the optimal number of512rows was 379,accounting for74%.The residual distortions were accurately evaluated,in two dimensional,the maximum value is4pixels,the minimum value was0pixel and the average value was L15pixels,so the results were accurate.The experiment of in vivo real-time skin imaging shows that the organizational structure features are more real and accurate after corrections.So this method is effective and feasible,which is helpful for accurate diagnosis of skin diseases.Key words:two-dimensional distortions of images;polynomial interpolation0引言作为一款新型影像学临床诊断设备，皮肤反射式共聚焦显振镜利用皮肤中血红蛋白、黑色素和角蛋白等不同组织成分的折射率差异进行成像，为皮肤组织的实时观测提供有效的技术手段，在恶性皮肤肿瘤早期诊断、治疗后随访等方面发挥了愈发重要的作用"役为进一步实现皮肤病检查时的便捷性,需要发展手持式皮肤共聚焦显振镜，由于受到系统体积和重量限制，系统中的核心部件扫描振镜要采用单镜面式MEMS振镜实现二维扫描成像,该扫描方式使得采集到的图像存在较为严重的二维畸变，扭曲了皮肤组织真实的结构形态.如不对这种图像畸变进行校正，将不利于医生观察皮损组织真实形态、边界轮廓、结构特征等信息，直接影响临床诊断结果因此，需要在分析产生图像畸变机理的基础之上，实现畸变校正，将真实图像信息准确呈现，为皮肤疾病诊断奠定基础。

专利名称：一种激光扫描共聚焦显微镜硬件控制系统与方法专利类型：发明专利
发明人：薛晓君,张运海
申请号：CN201410804094.8
申请日：20141222
公开号：CN104570860A
公开日：
20150429
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本案为一种激光扫描共聚焦显微镜硬件控制系统与方法，包括硬件部分：激光器、二色镜电机、狭缝电机、针孔电机、光电倍增管、扫描振镜、纳米位移台；还包括数据采集卡、下位机、上位机；所述激光器、二色镜电机、狭缝电机、针孔电机、PMT、扫描振镜、纳米位移台分别成光路连接；还包括扫描振镜控制电路，其与扫描振镜电性连接；在所述上位机和各硬件之间还包括下位机系统，各硬件间接的通过所述下位机系统与所述上位机通讯连接，其中，每个硬件设有唯一的识别码。

本案通过下位机系统完成系统软件对各个硬件的间接控制，实现起来更加快捷，降低了整个系统实现的难度。

申请人：中国科学院苏州生物医学工程技术研究所
地址：215163 江苏省苏州市科技城科灵路88号
国籍：CN
代理机构：北京远大卓悦知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：史霞
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第29卷第1期2021年1月Vol.29No.1Jan.2021光学精密工程Optics and Precision Engineering大视场线扫描共聚焦全息显微成像纵浩天1，2，张运海2*，王发民1，2，缪新1，2（1.中国科学技术大学生物医学工程学院，安徽合肥230026；2.中国科学院苏州生物医学工程技术研究所江苏省医学光学重点实验室，江苏苏州215163）摘要：传统显微成像一般记录样本的强度信息，对于半透明或相位组织成像对比度较差。

为实现相位组织非荧光标记成像，采用线扫描共聚焦全息成像方法，在线扫描共聚焦成像的基础上增加一路参考光，在共聚焦狭缝处形成离轴像面数字全息，通过控制样本的移动实现对样本的扫描，将获得的干涉线合成为二维全息图，通过频域滤波的方式获得振幅与相位分布，采用相邻剖面相似的特性校正环境振动引起的相位横纹，并且通过多区域扫描拼接实现大视场全息成像。

对USAF1951分辨率板进行线扫描共聚焦全息成像，采用抖动校正算法，使本实验重建相位图中的抖动横纹降低了84.7%，获取3个子区域图，通过图像拼接达到1160μm×1043μm的成像视场，扫描更多的子区域可以获取更大的视场，并且对洋葱表皮细胞实现共聚焦相位成像。

实验结果表明了该线扫描共聚焦全息成像方法可以实现对半透明样本的大视场相位成像，为相关仪器研制提供了指导与依据。

关键词：数字全息；光学显微成像；线扫描共聚焦；扫描拼接；大视场中图分类号：O426.1；O438.1文献标识码：A doi：10.37188/OPE.20212901.0001Large field of view line-scanning confocal holographic microscopy ZONG Hao-tian1，2，ZHANG Yun-hai2*，WANG Fa-min1，2，MIAO Xin1，2（1.School of Biomedical Engineering，University of Science and Technology of China，Hefei230026，China；2.Jiangsu Key Lab of Medical Optics，Suzhou Institute of Biomedical Engineering and Technology，Chinese Academy of Sciences，Suzhou215163，China）*Corresponding author，E-mail：zhangyh@Abstract：Traditional microscopic imaging generally records the intensity information of a sample，but the contrast is poor for translucent or phase tissue.To realize phase tissue non-fluorescence labeling imaging，a line-scanning confocal holographic imaging method was adopted.In line-scanning confocal imaging，a reference light was added to form off-axis image plane digital holography at the confocal slit.The sample was scanned by controlling the movement of the sample.The interference lines obtained were combined to form a two-dimensional hologram，and the distribution of amplitude and phase was obtained by filtering in the frequency domain.The phase striation caused by environmental vibration was rectified using the char⁃文章编号1004-924X（2021）01-0001-09收稿日期：2020-08-28；修订日期：2020-10-21.基金项目：江苏省国际合作项目（No.BZ2020004）；国家重点研发计划资助项目（No.2017YFC0110303）；济南市“高校20条”资助项目（No.2018GXRC018）；山东省自然科学基金资助项目（No.ZR2019BF012）第29卷光学精密工程acteristics of adjacent sections，and large field-of-view holographic imaging was realized by multi-area scan⁃ning and splicing.A USAF1951resolution plate was imaged by line scanning confocal holography，and a jitter correction algorithm was used to reduce the jitter stripes in the reconstructed phase map by84.7%to obtain three sub-area maps.An imaging field of1160μm×1043μm was achieved by splicing；scanning more sub-regions can help in obtaining a larger field of view and in realizing confocal phase imaging of on⁃ion epidermal cells.The experimental results show that the line-scanning confocal holographic imaging method can realize large-field phase imaging of translucent samples and provide guidance and a basis for the development of related instruments.Key words：digital holography；optical microscopy；line-scanning confocal；scanning splicing；large field of view1引言显微镜是人类观察与探索微观世界的重要工具，它在生物医学和工业检测等领域都发挥着重要的作用。

德国Leica Sp2激光扫描共聚焦显微镜
佚名
【期刊名称】《重庆医科大学学报》
【年(卷),期】2009(34)1
【摘要】激光扫描共聚焦显微镜是以激光作为激发光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦的原理和装置，对荧光标记样本进行断层扫描，获得高分辨率的光学切片，并利用计算机对所观察的对象进行数字图像处理的一套观察、分析和输出系统。

激光扫描共聚焦显微镜具有非常广阔的应用领域和应用前景。

【总页数】1页(PF0003-F0003)
【关键词】激光扫描共聚焦显微镜;Leica;德国;数字图像处理;光学显微镜;断层扫描;荧光标记;光学切片
【正文语种】中文
【中图分类】R285.5;R446.8
【相关文献】
1.Zeiss LSM 780激光扫描共聚焦显微镜光路设置和不同扫描模式的使用 [J], 李华丽
2.Leica SP8 STED 3X激光扫描共聚焦显微镜的使用研究 [J], 狄伶
3.入射激光对激光扫描共聚焦显微镜分辨率的影响 [J], 肖昀;张运海;王真;黎发志
4.飞秒激光LASIK与飞秒激光基质透镜切除术后角膜神经再生的激光扫描共聚焦显微镜观察 [J], 赵静静;王锐;陈元兵;付梦军;张浩润
5.德国Leica Sp2激光扫描共聚焦显微镜 [J],
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专利名称：一种共聚焦成像畸变校正系统及方法专利类型：发明专利
发明人：唐玉国,黄维,张运海,薛晓君
申请号：CN201710093232.X
申请日：20170221
公开号：CN107065157A
公开日：
20170818
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明提供一种共聚焦成像畸变校正系统，其包括共振振镜、检流计振镜、同步控制器和数据采集机构，所述共振振镜，用于在X轴方向上驱动扫描光斑，并在每一个振动周期中输出一个行同步信号；所述检流计振镜，用于在Y轴方向上驱动扫描光斑；所述同步控制器，用于接收来自于所述共振振镜的行同步信号，对所述行同步信号进行校准，产生与所述共振振镜的运动同步的行同步信号，并以校准后的行同步信号为时序基准，生成对所述检流计振镜的控制波形和与所述数据采集机构采样速率相匹配的等时间间隔的采样控制信号；所述数据采集机构，用于根据所述同步控制器的采样控制信号，采集观测样本的光信号，生成有非线性图像畸变的原始图像。

本发明还提供一种共聚焦成像畸变校正方法。

申请人：中国科学院苏州生物医学工程技术研究所
地址：215163 江苏省苏州市高新区科技城科灵路88号
国籍：CN
代理机构：深圳市科进知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：赵勍毅
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化石研究的新技术──激光扫描共聚焦显微系统
杨伟平;张海春;王冰;徐放鸣
【期刊名称】《古生物学报》
【年(卷),期】1996(35)6
【摘要】激光扫描共聚焦显微技术的根本特性在于任何时候都将照明光与探测到
物体表面的光限制在物体某一个相同点上。

如果这个点非常小又在极小衍射范围内，那么激光扫描共聚焦成像系统的分辨率要比任何传统显微镜高许多。

通过变换焦距，可做一系列虚拟断层切面。

利用这个特点，对那些用常规手段无法进行切片磨面的微体化石采用激光扫描共聚焦新技术进行研究，获得了对小壳化石、昆虫、孢粉等化石研究的新成果。

【总页数】4页(P730-733)
【关键词】化石;激光扫描共聚焦;研究技术
【作者】杨伟平;张海春;王冰;徐放鸣
【作者单位】中国科学院南京地质古生物研究所
【正文语种】中文
【中图分类】Q911.23
【相关文献】
1.激光扫描共聚焦显微镜使用中荧光共定位的一种计算方法 [J], 胡西学;郭宏博;甘雅玲
2.激光扫描共聚焦显微镜技术用于eIF-5A与syntenin及TIMP4的共定位及相互
作用研究 [J], 周涛;巩伟丽
3.激光共聚焦扫描显微镜与多光子激光扫描显微镜之比较 [J], 张向阳;门金娥;师兴安
4.共焦激光扫描荧光显微镜的扫描系统研究 [J], 张平;陈德;吴震;黄俊
5.共焦激光扫描荧光显微镜的扫描系统研究 [J], 张平;陈德;吴震;黄俊
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激光扫描共聚焦显微镜实验技术与应用岳磊;张垚;马卓【摘要】介绍了激光扫描共聚焦显微镜的工作原理、常规样品制备要求，以及图像获取的基本方法，包括光路设置及光强度调节、针孔的调节、增益值的调节、透射光路及DIC设置等。

在此基础上，进一步介绍了共聚焦在生物学研究领域上的应用技巧，如多通道荧光采集、多层扫描及三维构建、荧光共定位及强度分析、时间序列扫描及光漂白技术，为快速掌握共聚焦的操作技巧提供有力的技术参考。

%This paper introduced the working principle , conventional sample preparation and production requirements of laser scanning confocal microscopy , as well as the method of im-age acquisition , including the regulation of light path and light intensity adjustment , gain value and pinhole regulation , transmission light path and DIC settings .And introduced the confocal technique in biological research field , such as multi-track fluorescence collection , Z-stack scanning and three -dimensional construction , analysis of fluorescence colocalisa-tion and intensity , time sequence scanning and bleaching technology .This paper could effi-ciently provide technical reference for grasping the confocal operation skills .【期刊名称】《哈尔滨商业大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2015(000)003【总页数】5页(P263-266,290)【关键词】激光扫描共聚焦显微镜;图像;应用【作者】岳磊;张垚;马卓【作者单位】哈尔滨工业大学生命科学与技术学院，哈尔滨150080;哈尔滨工业大学生命科学与技术学院，哈尔滨150080;哈尔滨工业大学生命科学与技术学院，哈尔滨150080【正文语种】中文【中图分类】R446激光扫描共聚焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM)是20世纪80年代发展起来的一项具有划时代意义的高科技新产品，是当今分子生物学和生命科学重要的分析仪器之一[1].它是在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置，利用计算机进行图像处理，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察诸多生理信号机细胞形态的变化，成为形态学、分子细胞生物学、神经科学、药理学、遗传学等科学领域中强有力的研究工具[2].如何运用共聚焦拍摄出清晰的信号图像，对于一些初次接触共聚焦的科研人员会有些无从入手，本文通过介绍共聚焦的操作技巧以及在生物学上的应用技术，对初学人员提供快速有效的应用参考.仪器型号：Zeiss LSCM510主要技术参数：4种激光器：He-Ne 激光器激发波长633 nm；He-Ne 激光器激发波长543 nm；Ar多线激光器激发波长458/488/514 nm；Diode 固体激光器激发波长405 nm.5种可选物镜：10X，20X，40Xoil，63Xoil，100Xoil，每个物镜都有Plus-DIC功能.Confocal 利用放置在光源后的照明针孔和放置在检测器前的探测针孔实现点照明和点探测，来自光源的光通过照明针孔发射出的光聚焦在样品焦平面的某个点上，该点所发射的荧光成像在探测针孔上，该点以外的任何发射光均被探测针孔阻挡[3-4].照明针孔与探测针孔对被照射点或被探测点来说是共轭的，因此被探测点即共焦点，被探测点所在的平面即共焦平面.计算机以像点的方式将被探测点显示在计算机屏幕上，为了产生一幅完整的图像，由光路中的扫描系统在样品焦平面上扫描，从而产生一幅完整的共焦图像.只要载物台沿着Z轴上下移动，将样品新的一个层面移动到共焦平面上，样品的新层面又成像在显示器上，随着Z轴的不断移动，就可得到样品不同层面连续的光切图像[5] .3.1 染料的选择由于共聚焦是以单一波长的激光作为光源，因此在选择荧光染料时要根据仪器配备的激光器波长选择，如果在同一样品中有多种荧光染料标记，还要考虑它们的发射波长尽量不要重叠，避免串色问题[6].3.2 样品承载物的选择一般的共聚焦高倍物镜均为油镜，它的数值孔径较小，要求镜头与样品之间的工作距离不大于0.17 mm，因此如果观察样品为贴壁细胞或组织切片，可以用普通的载玻片和盖玻片即可.如果是悬浮细胞或悬浮粒子，可以用共聚焦专用的培养皿(glass bottom)承载样品进行观察[7].3.3 封片剂的选择如果样品只需要观测一次并且不是极易淬灭的荧光，可以选用一定浓度的甘油混合液封片即可.如果样品需要放置一段时间并多次拍摄，应选用抗荧光淬灭的封片剂，以减少荧光信号丢失[8].4.1 光路设置及光强度调节根据样品结合的荧光探针种类来选择相应的激光器(即发射波长)，如果样品为多种荧光染色，建议使用Multi Track模式进行信号采集，以避免串色问题.有些荧光染料发射波段比较宽，当与其他染料在同一样品中时，多通道采集也会串色，这时可以考虑将发射波段的滤片由长通(LP)调整为带通(BP)，或者进一步选用特征光谱曲线(Spectra)进行扫描[9].激光强度越高，样品的信号越强，但荧光也容易淬灭或漂白；如果激光强度过低，信号采集时过多地增大Gain值，就会噪音点增多，影响图像质量，或者采集不到较弱的信号.随着激光管使用寿命的增加，激光的亮度会有所下降，原则上激光强度越低越好.4.2 针孔(Pinhole)的调节针孔直径的大小决定了采集的荧光信号多少及切片的厚度，针孔越大，获得的荧光信号越多，切片的厚度越大，同时获得的非焦平面的信号也增多，背景较高.因此，在保证图片质量的前提下，针孔直径越小越好，以提高图像分辨率.4.3 增益值(Gain)的调节增益值大小的调节相当于调节光电倍增管(PMT)的电压值，该值的大小直接决定了获得荧光信号的多少.Gain值越大，荧光强度越大，图像亮度越高，同时噪音点也增多.4.4 背景扣除(Offset)的调节在采集图像时，可以适当调节Offset键，扣除背景的荧光亮度，该值通常设置在0以下.Offset与Gain相辅相成，在实际操作中，二者要结合调节，增加Gain值，噪音点增多时，可以降低Offset值，提高图像质量.4.5 图像扫描用低像素预览，高像素获取图像.像素是指基本原色素及其灰度的基本编码，像素越高，分辨率越高，图像越清晰，反之亦然[10].要获取高清图像，不但可以通过提高像素的方法，还可以采用增加扫描次数的模式，更好的减少噪音点和背景.但是扫描次数越多，扫描速度越慢，容易造成荧光淬灭和弱信号丢失，通常扫描次数可以选择2～4次.4.6 透射光路及DIC(微分干涉差)设置共聚焦的透射光图像也是以激光为光源，由PMT将光信号转换成电信号，获取图像，图像颜色为伪彩.DIC(Differential Interference Contrast)原理是利用平面偏振光，可使样品厚度的微小差异转变为细微明暗差别，增强立体感，通常用于观察细胞的整体轮廓，便于荧光定位[11-12].共聚焦采集的DIC 图像为非共焦图像，因此在透射光通道无法对样品进行光学切片.5.1 多通道荧光及透射光叠加图像采用Multi Track模式可以进行多种荧光及透射光图像扫描并叠加，选用不同颜色区分不同的荧光染料(如图1).叠加后的图片能更直观地观察不同荧光信号在生物体内的定性及共定位情况.5.2 Z轴扫描及三维构建利用共聚焦可以去除非焦平面杂散光的特性，可以将较厚的样品进行多层扫描及三维构建.在获取模式下选择Z-stack，然后在Z轴方向选择起始层面和终止层面，再根据样品的厚度及实验需求选择扫描的层数(keep slice)，或者选择Z轴步进值(keep interval).通常步进值为切片厚度的50%可以获得较高的轴向分辨率[13].如图2所示.5.3 双色荧光共定位分析在多通道荧光叠加图像上，通过Histo模式下的Colocalisation功能，可以对多种荧光信号进行两两共定位分析，共定位的部分可以选用另一种颜色标记出来，获得的图像及谱图能更直观清晰的进行荧光信号的定性定量分析.如图3所示.5.4 荧光强度对比分析在Profile模式下选定某一区域或一条直线范围，通过荧光强度峰图，可以直观对比对照组与处理组不同通道的荧光强度差别.如图4所示.5.5 时间序列(Time Series)扫描共聚焦可以对标有荧光信号的活细胞实时动态观测，记录细胞内特定成分的动态变化.共聚焦是以扫描方式成像，成像速度慢，在进行时间序列扫描时，要想能及时扑捉到快速变化的信号，可以降低分辨率，增加扫描速度，或者将面(Frame)扫描变为线(Line)扫描及点(Spot)扫描，但获取的图像质量也会降低.时间序列的扫描时间可以在软件直接设置，也可以由外置设备(如电生理仪等)进行控制.如图5所示. 5.6 光漂白(Bleach)扫描利用光漂白扫描方法可以完成相应的荧光光漂白恢复 (FRAP)及荧光共振能量转移(FRET)等实验.先采集一张标准图像，然后选择漂白区域(Define Region)，增大激光强度，再设定漂白次数(Iterations)，以实现荧光快速淬灭的效果.结合时间序列扫描方式，就可以完成FRAP及FRET实验.如图6所示.综上所述，通过激光扫描共聚焦显微镜可以获得高清晰、高质量的图像，还可以扩大图像的信息量，获得更多的分析结果，这些功能使得LSCM已成为生物学研究领域中必不可少的分析仪器[14-15].激光扫描共聚焦显微镜可以进行细胞形态定位、立体结构重组、动态变化过程等研究，并能提供定量荧光测定、定性图像分析等实用研究手段，结合其他相关生物技术，在形态学、生理学、免疫学、遗传学等分子细胞生物学领域将会得到更广泛应用[16-17].【相关文献】[1] 李楠, 尹岭, 苏振伦, 等. 激光扫描共聚焦显微术[M]. 北京: 人民军医出版社, 1997.[2] 肖艳梅,付道林,李安生. 激光扫描共聚焦显微镜( LSCM)及其生物学应用[J]. 激光生物学报, 1999, 8(4): 305-311.[3] 肖昀, 张运海, 王真, 等. 入射激光对激光扫描共聚焦显微镜分辨率的影响[J].光学精密工程, 2014, 22(1): 31-37.[4] KENNEDY G T, MANNING H B, ELSON D S. A fluorescence lifetime imaging scanning confocal endomicroscope[J]. Journal of Biophotonics, 2011, 3(1-2): 103-107.[5] ROBERTSON K, REES J L. Variation in epidermal morphology in human skin at different body sites as measured by reflectance confocal microscopy [J]. Acta Dermato-Venereologica, 2010, 90: 368-373.[6] 王志颖, 饶玉春, 刘敏. 激光共聚焦显微镜的样品前处理技术研究[J]. 安徽农业科学, 2013,41(26): 10602-10603,10621.[7] 骆宁, 范瑾瑾. 两种盖玻片对激光共聚焦显微镜成像效果的影响[J]. 新医学, 2011, 42(7): 433-436.[8] 李钻芳, 陈文列. 激光共聚焦显微术在中药与天然药诱导肿瘤细胞凋亡研究中的应用[J].环球中医药, 2011(4): 70-73.[9] 齐凤慧, 詹亚光. 利用激光共聚焦显微镜对茉莉酸甲酯诱导后细胞形态学检测[J]. 实验技术与管理, 2010, 17(8): 54-55, 62.[10] 段妍, 关苑君, 蓝秀健, 等. Zeiss LSM710 激光扫描共聚焦显微镜的使用和管理[J]. 实验室研究与探索, 2012, 31(8): 228-230, 239.[11] TOVEY S C, BRIGHTON P J, BAMPTON E T W. Confocal microscopy: theory and applications for cellular signaling [J]. Methods in Molecular Biology, 2013, 937: 51-93. 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皮肤反射式共聚焦显微成像自适应图像亮度调节缪新;张运海;黄维【摘要】在皮肤反射式共聚焦显微成像过程中,为了实现图像亮度的快速调节,提出了一种图像亮度自适应调节方法.通过实验建立光强控制电压与图像亮度之间的关系模型,划分图像极端亮度区间与适度亮度区间,采用分段调节策略,将初始图像从极端亮度区间快速调整至适度亮度区间,在适度亮度区间内通过线性补偿调节至目标灰度均值.对不同深度、不同位置的皮肤组织进行实时成像,图像初始亮度存在着过亮、过暗和适中等各种情况,上述亮度自适应调节方法均能实现快速亮度调节,调节迭代次数为2～3,调节后图像灰度均值达到最优值70左右.实验结果表明,这种自适应图像亮度调节方法快速、有效,能够满足皮肤共聚焦成像检测的需要.【期刊名称】《光学精密工程》【年(卷),期】2019(027)006【总页数】7页(P1270-1276)【关键词】显微成像;反射式共聚焦;皮肤;亮度区间;线性补偿;图像灰度均值【作者】缪新;张运海;黄维【作者单位】中国科学技术大学,安徽合肥230026;中国科学院苏州生物医学工程技术研究所江苏省医用光学重点实验室,江苏苏州215163;中国科学技术大学,安徽合肥230026;中国科学院苏州生物医学工程技术研究所江苏省医用光学重点实验室,江苏苏州215163;中国科学院苏州生物医学工程技术研究所江苏省医用光学重点实验室,江苏苏州215163【正文语种】中文【中图分类】TH742.91 引言皮肤反射式共聚焦显微镜是一款新型皮肤影像学诊断仪器[1-2]，主要应用于感染性、色素减退性、色素增加性、炎症性皮肤病及良、恶性皮肤肿瘤的诊断[3-4]。

该系统以近红外激光作为光源，照明光点、物点、探测针孔相共轭[5-6]，通过针孔设置抑制非焦面杂散光，利用皮肤中黑色素和角蛋白等不同细胞结构的折射率差异，实现皮肤组织结构的无创在体三维层析成像。

在系统成像过程中，由于光束到达不同层次、不同位置皮肤组织的光强不同，呈现出的图像整体亮暗程度不同，这一定程度上直接影响医生对患者皮损组织成像观察、微结构特征辨识、边界界定，甚至诊断结果的准确性，而频繁手动控制激光光源不仅操作繁琐，还分散医生精力，因此，需要在系统实时成像的同时实现快速自适应图像亮度调节，维持图像整体亮度在一定阈值范围内。