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腺相关病毒（Adeno-Associated Viral Vector，AAV）属于微小病毒科( parvovirus)，为无包膜的单链线状D NA 病毒。
AA V 的基因组约4700bp，包括上下游两个开放读码框架(ORF)，位于分别由145 个核苷酸组成的2个反向末端重复序列(ITR)之间。
由于腺相关病毒具有宿主范围广、安全性高、免疫原性低、表达稳定和物理性质稳定等优点，已被广泛地应用于基础研究和临床试验中，并且腺相关病毒载体已成为世界上最常用的基因治疗载体之一。
AAV病毒特点1. 安全性高：迄今从未发现野生型A A V 对人体致病，重组A A V 基因组序列上去除了大部分的野生型A A V 基因组元件，进一步保证了安全性；2. 免疫原性低：AA V2 的基因组仅 4681 个核苷酸，便于用常规的重组 DNA 技术进行操作，而且进行动物实验时造成的免疫反应小；3. 宿主范围广：能感染分裂细胞和非分裂细胞；4. 表达稳定：能介导基因的长期稳定表达；5. 物理性质稳定：在60℃不能被灭活，能抗氯仿；AAV生物学特性表1 不同病毒的生物学特性比较慢病毒逆转录病毒腺相关病毒腺病毒包膜有有无无颗粒直径90-100 nm90-100 nm20-30 nm60-90nm 基因组dsRNA dsRNA ssDNA dsDNA表达起始时间48-72h48-72h72-96h24-48h表达持续时间> 2 months> 2 months> 6 months~1 month宿主基因组整合方式随机高频整合随机高频整合定向低频整合或非整合非整合AAV载体不同血清型研究发现AAV 具有多种血清型，各种不同血清型的AAV 载体的主要区别是衣壳蛋白不同，因此对不同的组织和细胞的转染效率存在差异。
目前汉恒生物在包装腺相关病毒时有12种不同的AAV 血清型可供客户选择，建议客户针对不同组织器官选择相应血清型的AAV 病毒，见表2。
汉恒重组腺病毒操作手册目录腺病毒安全使用和注意事项腺病毒储存与稀释的注意事项一、整体实验流程二、实验材料三、腺病毒包装和浓缩四、重组腺病毒滴度(PFU的测定五、重组腺病毒感染目的细胞六、重组腺病毒用于动物实验附1:汉恒生物腺病毒载体附2:腺病毒感染细胞最佳MOI的摸索(表达荧光的病毒附3:汉恒生物常见三种病毒感染目的细胞比较腺病毒安全使用和注意事项➢腺病毒安全使用注意事项(*非常重要!!!*1腺病毒相关实验请在生物安全柜(BL-2级别内操作。
2操作病毒时请穿实验服,佩戴口罩和手套,尽量不要裸露双手及手臂的皮肤。
3操作病毒时需要特别小心病毒溅出。
如果操作时超净工作台有病毒污染,请立即用70%乙醇加1%的SDS溶液擦拭干净。
4接触过病毒的枪头、离心管、培养板及培养瓶请用84消毒液浸泡后统一处理。
5如实验过程中需要离心,应使用密封性好的离心管,必要时请用封口膜封口后离心。
6病毒相关的废弃物需要特殊收集,统一经高温灭菌后处理。
7实验完毕后请用香皂清洗双手。
➢腺病毒储存与稀释的注意事项1腺病毒的储存收到病毒液后若在短期内使用,可将病毒放置于4℃保存(一周内使用完最佳;如需长期保存请分装后放置于-80 ℃。
注:a.反复冻融会降低病毒滴度(每次冻融会使病毒滴度降低10%~50%,因此在病毒使用过程中尽量避免反复冻融。
汉恒生物对病毒已进行分装(200 μl/tube,收到后请直接放置-80℃冰箱保存即可。
b.若病毒储存时间超过6个月,汉恒生物建议在使用前重新测定病毒滴度(参见附表2-慢病毒滴度测定方法。
2腺病毒的稀释需要稀释病毒时,请将病毒取出置于冰浴融解后,使用PBS或培养目的细胞用的无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染混匀分装后置于4℃保存(一周内使用完最佳。
重组腺病毒是一种复制缺陷的腺病毒载体系统,在基因治疗、基础生命科学研究等领域被广泛应用。
重组腺病毒具有以下几个显著优点:感染范围广,几乎可以感染所有的细胞系、原代细胞和部分组织;感染效率高达100%,可全面超越其他病毒载体工具和脂质体转染;对外源基因容载能力大(可以高达8Kb;不整合基因组;滴度高,操作方便。
腺相关病毒（AAV）构建及包装操作手册目录一、AAV安全注意事项二、AAV储存和稀释注意事项三、AAV介绍四、汉恒生物AAV产品服务及载体信息与现货列表五、AAV整体实验流程六、实验材料七、AAV载体构建八、AAV包装九、AAV收集和纯化十、AAV滴度测定十一、AAV感染细胞测试十二、AAV用于动物实验（重磅干货，五星推荐）十三、案例分享附件1附件2一、AAV安全使用注意事项（*非常重要！！！*）1)AAV相关实验请在生物安全柜（BL-2级别）内操作。
2)操作病毒时请穿实验服，佩戴口罩和手套，尽量不要裸露双手及手臂的皮肤。
3)操作病毒时特别小心病毒溅出。
如果操作时超净工作台有病毒污染，请立即用70%乙醇加1%的SDS溶液擦拭干净。
接触过病毒的枪头、离心管、培养板、培养液请用84消毒液浸泡后统一处理。
4)如需要离心，应使用密封性好的离心管，如有必要请用封口膜封口后离心。
5)动物注射操作请在生物安全柜内（BL-2级别）完成。
6)病毒相关的废弃物需要特殊收集，统一经高温灭菌处理。
7)实验完毕用洗手液清洗双手。
二、AAV储存和稀释注意事项1.AAV的储存收到病毒液后若在短期内使用，可将病毒放置于4℃保存（一周内使用完最佳）；如需长期保存请分装后放置于-80℃。
注：a．反复冻融会降低病毒滴度（每次冻融病毒滴度会降低10%-50%），因此在病毒使用过程中应尽量避免反复冻融。
汉恒生物已对病毒进行了分装（200 l/tube），收到后请直接放置-80℃保存即可。
b．若病毒储存时间超过6个月，汉恒生物建议在使用前重新测定病毒滴度。
2.AAV的稀释需要稀释病毒时，请将病毒取出冰浴融解，再使用无菌PBS或生理盐水混匀分装后置于4℃保存(一周内使用完最佳)。
三、AAV介绍腺相关病毒（AAV）属微小病毒科( parvovirus)，为无包膜的单链线状DNA 病毒。
只有在腺病毒或者疱疹病毒等辅助病毒协助下，宿主才能产生具有感染性的AAV，所以AAV被称作腺相关病毒。
一、引言 (1)二、研究内容和制品质量控制 (2)1治疗用的目的基因 (2)2．载体 (2)3．DNA 重组体 (2)4．基因导入系统构建包括病毒载体与非病毒载体基因导入系统。
(3)(二)细胞库及工程菌库的建立和检定 (3)1.细胞库 (3)2．工程菌库 (3)(三)基因治疗制品制备和生产工艺 (4)1.普通要求 (4)2．以重组病毒作为基因治疗制品者，要求必须建立种子病毒库和工作病毒库。
(4)3．非病毒型重组质粒 DNA 复(混)合物作为最终制品者，要求需详述。
(4)4．以基因工程化的细胞为最终制品者，包括 exvivo 及其它形式的基因治疗。
(4)(四)制品的质量控制 (5)1. 重组病毒作为基因治疗制品的质量控制 (5)2．非病毒型重组 DNA 基因治疗制品 (7)(五)基因治疗的有效性试验 (7)1. 体外试验 (7)2．体内试验 (8)(六)基因治疗的安全试验 (8)2．份子遗传学的评估 (8)3．毒性反应的评估 (8)4．免疫学的评估 (9)5．致癌试验：见本指导原则相关部份。
(9)(七)基因治疗临床试验方案 (9)(八)伦理学考虑 (10)基因治疗是指改变细胞遗传物质为基础的医学治疗。
目前仅限于体细胞。
基因治疗的技术和方式日益多样性。
按基因导入的形式，分为体外基因导入(exvivo)及体内基因导入(invivo)两种形式。
前者是在体外将基因导入人细胞，然后将该细胞注入人体。
其制品形式是外源基因转化的细胞，适合在具有专门技术人材和 GMP 条件的医疗单位进行。
后者则是将基因通过适当的导入系统直接导入人体，包括病毒的与非病毒的方法。
其制品形式是基因工程技术改造的病毒或者是重组 DNA、或者是 DNA 复(混)合物。
基因治疗制剂种类较多，因此，本指导原则不可能用一个模式来概括，只能提出一个共同的原则，具体的方案应根据这些原则，确定研究技术路线。
其基本原则：一是必须确保安全与有效，要充分估计可能遇到的风险，并提出相应的质控要求；二是要促进基因治疗的研究，并加强创新。
上海生博AAV产品手册（2017版）一、AAV背景知识1.1AAV概况腺相关病毒(Adeno-associated virus，AAV)，是一类无包膜的细小病毒，属于微小病毒科(Parvoviridae)的依赖病毒属(Dependoparvovirus)，透射电镜(transmission electron microscope，TEM)下，AAV病毒本身呈二十面体结构。
AAV 基因组为约4.7kb的线性单链DNA(single strand DNA，ssDNA)，只含两个基因，Rep(Replication)基因和Cap(Capsid)基因。
AAV为目前发现的基因组最简单的复制缺陷型病毒，也因此，AAV被作为病毒载体广泛应用。
FIG1 AAV的3D构象图FIG2 AAV病毒颗粒的组分构成FIG1和FIG2文献出处：Mingozzi, F. and K.A. High.Blood, 2013. 122(1): p. 23-36.FIG3 AAV TEM图Zinn, E., et al.. Cell Rep, 2015. 12(6): p. 1056-68.1.2AAV的ITR区AAV基因组的5’和3 ’端各有一个长度为145bp的倒转重复序列(inverted terminal repeat，ITR)，是AAV复制和包装所必需的最少的自身序列。
ITR区富含GC(>80%)，可折叠为一个自我互补的T型发卡结构，其中的Rep蛋白结合位点(Rep binding elements，RBE)、RBE’和末端解链位点(terminal resolution site，TRS)是AAV 基因组的复制起始的关键。
另外ITR区还含有包装信号，是AAV整合、复制和包装所必须的顺式作用元件，并具有转录启动子活性。
FIG4 AAV基因组结构图Nance, M.E. and D. Duan. Hum Gene Ther, 2015. 26(12): p. 786-800.FIG5 AAV ITR区的二级结构图(以AAV2序列为例)Daya, S. and K.I. Berns. Clin Microbiol Rev, 2008. 21(4): p. 583-93.1.3AAV的ORFAAV含有两个开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)，Rep基因和Cap基因。
腺病毒载体操作手册一、实验流程制备腺病毒穿梭质粒，分别高纯度无内毒素抽提腺病毒穿梭质粒和骨架质粒，共转染293A细胞，转染后6h更换为完全培养基，培养十几天，在中间四五天左右更换一次新鲜培养基，然后收集细胞和1ml培液置于15ml离心管后，液氮/37度冻融三次（冻-融要彻底），2000rpm离心5分钟，取上清即为病毒液初代原液。
连续三代反复扩增收集病毒后，行病毒的大量扩增，然后通过CsCl密度梯度离心-透析联用法纯化病毒。
二、实验材料（一）腺病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为两质粒系统，组成为穿梭质粒（包括pHBAd-CMV-IRES-GFP,pHBAd-CMV-IRES-RFP,pHBAd-U6-GFP, pHBAd-U6-RFP）和骨架质粒pBHGlox（delta）E1,3Cre。
其中穿梭质粒pHBAd-CMV-IRES-GFP和pHBAd-U6-GFP能表达绿色荧光蛋白（GFP）。
pHBAd-CMV-IRES-RFP和pHBAd-U6-RFP能表达红色荧光蛋白（RFP）。
1、载体信息1) 腺病毒克隆载体图谱如下：各载体用途如下表：2）骨架质粒信息如下：2、细胞株293A，腺病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，经培养生长增殖形成单层细胞,生长培养基为DMEM(含10% FBS)。
3、菌株大肠杆菌菌株DH5α。
用于扩增腺病毒载体和腺病毒骨架载体质粒。
三、包装细胞293A细胞的培养（一）293A细胞的冻存293A细胞来源于一个用作空斑测定的亚克隆，具有易使用和易转染的特性。
该细胞株对于高细胞密度很敏感，当细胞超过70%汇合时，一些细胞可能会丢失它们的表型。
若细胞密度持续在70%以下，QBI-293A细胞则能连续培养3~4个月维持原有细胞特性。
若以购买得到的293A作为第一代，则30代内能得到最佳结果。
随着传代的次数增加，293A细胞会出现生长状态下降、突变等。
为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。
重组腺相关病毒（AAV）载体构建技术原理腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）是微⼩病毒科（parvoviridae）家族的成员之⼀，是⼀类⽆法⾃主复制、⽆被膜的⼆⼗⾯体微⼩病毒，其直径约20-26nm，含有4.7kb左右的线状单链DNA作为基因组。
研究中采⽤的重组腺相关病毒载体（recombination adeno-associated virus, rAAV）是在⾮致病的野⽣型AAV基础上改造⽽成的基因载体，由于其种类多样、免疫原性极低、安全性⾼、宿主细胞范围⼴（对分裂细胞和⾮分裂细胞均具有感染能⼒）、扩散能⼒强、体内表达基因时间长等，rAAV被视为最有前途的基因研究和基因治疗载体之⼀。
AAV基因组结构悬浮框：包装纯化及滴度检测--侵染细胞过程-- rAAV载体优势—rAAV⾎清型选择—应⽤案例rAAV包装纯化及滴度检测AAV包装过程中，包装质粒负责编码⽬的基因以及两个末端反向重复序列（ITR，对于病毒的复制和包装具有决定性作⽤），辅助质粒包含AAV包装所需的cap（编码病毒⾐壳蛋⽩）和rep（参与病毒的复制）基因，以及腺病毒Helper质粒。
三种质粒共同转染293T细胞后，AAV病毒开始复制和包装。
和元⽣物腺相关病毒的⽣产和质控采取了国际学术界公认的标准流程，采⽤三质粒系统在293T细胞中进⾏包装。
所获得的病毒颗粒经过超速离⼼纯化，并通过qPCR对病毒基因拷贝进⾏滴定。
另外，我们也可以根据使⽤者要求，提供蛋⽩染⾊检测⾐壳蛋⽩的完整性以及内毒素含量等。
⼀般情况下rAAV的滴度在1012~1013VG/ml，完全可以满⾜各类整体实验的使⽤要求。
AAV包装流程图滴度检测⽅法：定量PCR检测病毒基因组中外源DNA拷贝数。
滴度检测原理：腺相关病毒的基因组为单链DNA，外源DNA拷贝数代表病毒基因组拷贝数。
高效转染病毒
源井生物可以提供不同质量标准的慢病毒，腺病毒，腺相关病毒。
在基因编辑方面，源井生物可以提供体外细胞感染用的浓缩病毒，也可以提供动物体内使用的超纯化病毒，满足客户的不同科研需求。
三种病毒的比对:
腺相关病毒包装原理
腺相关病毒( adeno-associated virus，AAV) 是一类细小病毒，基因组为单链DNA，对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。
通常需要腺病毒或疱疹病毒帮助其在体内复制扩增。
重组腺相关病毒（recombinant AAV, rAAV）是利用
AAV2 型基因组与不同血清型的衣壳蛋白基因组结合产生的混合体病毒载体，可将目的基因的CDS 区序列或者RNAi 干扰序列插入rAAV 表达质粒中，包装病毒后感染细胞完成对目的基因的操作。
腺相关病毒具有感染温和，免疫原性小，长效稳定表达的特点，主要应用于动物体内注射。
源井生物提供的腺相关病毒颗粒经过超速离心纯化，并通过qPCR对病毒基因拷贝进行滴定。
腺相关病毒的滴度在10^12~10^13GC/ml，可以满足各类整体实验的使用要求。
不同血清型的AAV组织感染嗜亲性各不相同，表现出一定的器官靶向特异性。
下表列举了不同的AAV血清型及对应的组织亲和性:
产品规格：
服务流程及质量控制：
基因敲除腺相关病毒
源井生物构建基因敲除腺相关病毒载体并包装为腺相关病毒，经过超速离心纯化后，可用于动物定位注射和整体注射实验。
细胞感染腺相关病毒后，可稳定表达gRNA和Cas9蛋白，达到敲除靶基因的目的。
基因敲除腺相关病毒载体选择：
注明| 文章是源井生物原创，转载请注明。
腺相关病毒生产流程
腺相关病毒生产流程大致可分为基因克隆、细胞转染、收毒、病毒纯化、滴度检测等步骤，具体步骤我们下文分解？怎么可能，下面就是腺相关病毒生产流程。
1）根据订单不同选择不同的载体，在此以人源基因克隆为例。
2）Vigenebio 公司的AAV 载体与我们的人源ORF （注：维真生物拥有18000人源cDNA ORF克隆，可以最快的时间克隆到载体）库中的穿梭质粒的多克隆位点相兼容，通过酶切，连接，转化的方式将基因亚克隆进入pAV-FH AAV 载体，得到阳性克隆之后进行酶切跑胶验证及测序以确认插曲片段的正确性。
腺相关病毒载体图谱（维真生物）
细胞冻存流程
1) 按照培养细胞流程，将细胞吹下来加入50ml 离心管中，800g 离心5min。
2) 配制冻存液，90% 血清，10% DMSO，混匀。
3) 离心后去上清，将配制的冻存液加入，将细胞吹匀
4) 取上述溶液1ml 分至1.5ml 细胞冻存管中，做好标记和日期。
5) 放入装有异丙醇的冻存盒中，放入-80度冰箱过夜。
（冻存盒要提前一天从冰箱中拿至室温，使异丙醇的温度达到室温，每次冻存前确保异丙醇的加入量在刻度线上）。
6) 第二天将冻存盒放入液氮或-150℃冰箱中。
1) 10cm 培养盘中加10cm 新鲜DMEM 培养基，放培养箱预热至37℃。
2) 从液氮中取出冷冻管，迅速投入37 ℃～38℃水浴中，使其融化（1-2 分钟左
右）。
3) 待细胞冻存管中溶液尚未完全融化时加入预热的培养盘中。
4) 摇晃均匀，放培养箱培养。
5) 4h后待细胞完全贴壁后更换新鲜培养基（除去冻存液中DMSO 对细胞的毒害作用。
也可在第3步中800g 离心5min，除去培养基后再悬浮细胞添加至新鲜预热的DMEM 细胞培养皿中）。
1) 生物安全柜紫外灭菌半小时。
2) 灭菌期间，DMEM 培养基(含10%FBS，1%青链霉素混合液)、PBS 以及
0.25%胰酶在37℃水浴锅中预热。
3) 取汇合度接近100%活性好的的HEK293T 细胞，吸弃培养盘中培养基，加约
5ml，1×PBS，摇晃几下，吸弃PBS。
（加PBS目的主要除去残留在皿中的培养基中的FBS，以提高胰酶的消化效率）
4) 加1ml 0.25% 胰酶在生物安全柜内消化约1min，室温低时可放置于培养箱中消化。
消化时间不宜过长，否则影响细胞再次贴壁效率和活性。
5) 加入约5ml 的预热的培养基。
6) 用移液管吹打均匀，按照1:3 比例传代。
各洗2ml 培养基至新的10cm 皿中，再加入8ml 预热的DMEM 培养基。
（吹打过程中不可用力过大，否则会吹破细胞）。
注意：传代盘数较多时，要先将预热的DMEM 培养基加入到10cm 皿中，再加入含细胞的培养基，以避免细胞分布不均。
放置于培养箱前轻轻混匀皿中的培养基，使细胞均匀分散于培养基中。
细胞培养条件为5%-7%CO2 浓度，37℃，培养箱内无菌水盘内水份提供一定的湿度。
细胞传盘以及分6 孔板，24 孔板，96 孔板分细胞都经过上述流程，只是细胞数与分的比例不同，具体情况具体操作。
以10cm 细胞培养皿为例
第一天: 聚合度90%以上的HEK293T 细胞按1：3 比例传盘（每盘大约2.5 x 10E6），培养基Hyclone 高糖DMEM 培养基（含10%FBS）。
第二天: 转质粒前1-2h 左右，换成无血清培养基（所有血清型AAV），用转染试剂将目的基因质粒和辅助质粒（需用酚氯仿提取的质粒）转入HEK293T 中。
第三天：质粒转化24h 后，换新的无血清培养基（所有血清型AAV）
第五天：转染72h 收毒。
带着培养基，吹下细胞，离心；然后分别收获培养基上清与细胞沉淀。
用PEG8000 沉淀培养基上清中的病毒，沉淀过夜后收集病毒沉淀。
病毒纯化浓缩
将病毒的混合液用碘克沙醇密度梯度离心进行纯化，然后用超滤管进行浓缩。
病毒滴度检验
1)腺性相关病毒处理破除AAV 病毒外壳，37 ℃孵育30 min，然后加热95 ℃5
min 使酶失活，体系如下：
组成成分体积
病毒液 5ul
蛋白酶K（5ug/ul） 1ul
超纯水4ul
2)离心12000rpm,2min.取上清。
3)标准品的拷贝数，7 个梯度稀释浓度分别：
7.2E+8V.G./UL,7.2E+7V.G./UL,7.2E+6V.G./UL,7.2E+5V.G./UL,7.2E+4V.G./UL,7.2E +3V.G./UL,7.2E+2V.G./UL.并将超纯水作为阴性对照。
4)配制PCR 反应体系，每个样品20 ul 体系，体系如下：
组成成分体积
2X SYBRGreen 缓冲液10ul
F、R 引物混合物0.8ul
超纯水7.2ul
病毒样品或标准品2ul
5)PCR 反应体系
组成成分体积
95℃
5min；
95℃15sec
60℃15sec
72℃15sec
40 个cycles
6)病毒颗粒数公式：病毒颗粒数（个/ml）= 与标准品相对值× 1000。
