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WHIRLPOOL REFRIGERATEUR - CONGELATEUR W7X94AOXFR MERCI D'AVOIR CHOISI UN PRODUIT WHIRLPOOLAfin de profiter d'une assistance complète, veuillez enregistrer votre appareil sur www.w hirlpool.e u/r egister Lisez attentivement les consignes de sécurité avant d’utiliser l’appareil.1ÈRE UTILISATIONAttendre au moins deux heures après l’installation avant de brancher l’appareil à l’alimentation électrique. Une fois branché, il commencera à fonctionner automatiquement. Les réglages de la température idéale sont préréglés à l'usine.Après avoir allumé l'appareil, attendre 4-6 heures pour qu'il atteigne la température correcte pour la conservation des aliments.PANNEAU DE COMMANDE1. Touche fonctionnement du congélateur2. Touche Fast Freeze (Congélation rapide)3. Voyant Fast Freeze (Congélation rapide)4. Voyant Température congélateur5. Voyant Température réfrigérateur6. Voyant Fast cool (Refroidissement rapide)7. Touche Fast cool (Refroidissement rapide)8. Touche Fonctionnement de réfrigérateurMARCHE/ARRÊTPour allumer/éteindre le produit appuyez aussi bien sur la Touchede Fonctionnement du Réfrigérateur que sur la Touche De Super Congélation 3 secondes.RÉGLAGE DE LA TEMPÉRATURE CONGÉLATEURPour régler la température dans le compartiment congélateur, utilisez le Bouton Fonctionnement du congélateur. La température ducongélateur consiste en 4 niveaux comme indiqué sur la sérigraphie (signalé par le voyant).Le réglage recommandé pour le congélateur est de -18°C.FONCTION FAST FREEZE (CONGÉLATION RAPIDE)Cette fonction est recommandée pour congeler des aliments frais. Les aliments frais doivent être congelés le plus vite possible, pour une meilleure conservation et pour maintenir leur valeur nutritionnelle. Appuyez sur le bouton Congélation rapide lorsque vous devez congeler des aliments frais ; le voyant Congélation rapide s'allumera. Nous vous recommandons d'appuyer sur le bouton Congélation rapide 24 heures avant de mettre les aliments dans le congélateur, afin depréparer le compartiment congélateur aux meilleures conditions de congélation possibles. Nous vous recommandons d'utiliser le tiroirinférieur pour optimiser la capacité de congélation.La fonction Super congélation est automatiquement désactivée après 48 heures, ou vous pouvez la désactiver manuellement en appuyant sur le bouton Congélation rapide.RÉGLAGE TEMPÉRATURE RÉFRIGÉRATEURLa température du réfrigérateur consiste en 4 niveaux comme indiqué sur la sérigraphie (signalé par le voyant). Pour régler la température du compartiment du réfrigérateur, utilisez la touche de Fonctionnement du Réfrigérateur.Le réglage recommandé pour le compartiment réfrigérateur est de+4°C.FONCTION FAST COOL (REFROIDISSEMENT RAPIDE)Vous pouvez activer ou désactiver la fonction Refroidissement rapide (refroidissement rapide des aliments frais et qui viennent d'être cuits) en appuyant sur la touche Refroidissement rapide sur l'affichage. Lorsqu'elle est activée, le voyant Refroidissement rapide s'allume.La fonction est automatiquement désactivée après 12 heures, ouelle peut être manuellement désactivée en appuyant sur la touche Refroidissement rapide.ÉCLAIRAGE À DELCe produit contient une source lumineuse de classe d'efficacitéénergétique F.Si le système d'éclairage DEL ne fonctionne pas, contactez le Service Après-vente pour le remplacer.Important : L'éclairage du compartiment réfrigérateur s'allume àl'ouverture de la porte. Si la porte est laissée ouverte pendant plus de 8 minutes, l'ampoule s'éteint automatiquement.6TH SENSECette fonction fonctionne automatiquement pour assurer les conditions optimales +pour la conservation des aliments. La fonction « 6th Sense » est activée automatiquement lorsque :• une grande quantité d'aliments est chargée dans le réfrigérateur • la porte du réfrigérateur reste ouverte longtemps• il y a eu une coupure de courant de longue durée et la température interne des compartiments est remontée à desniveaux pouvant compromettre la conservation correcte desaliments.• Fruits et légumesRemarque : nous vous recommandons de ne pas mettre du poisson et de la viande dans le bac en même temps sauf s'ils sont convenablement emballés, afin d'éviter une contamination croisée.Humidity Control (Contrôle de l'humidité*)Tournez le bouton vers la gauche si vous conservez des légumes (pour lesquels un environnement plus humide est recommandé), tournez le bouton vers la droite si vous conservez des fruits (pour lesquels un environnement moins humide est recommandé), tournez le bouton au centre si vous conservez un mélange de fruits et légumes.1. Pleine profondeur, pour utiliser toute la surface.Demi-profondeur, pour utiliser la partie arrière et en mêmetemps, créer de l'espace pour des articles plus grands (comme les bouteilles et les carafes) sur la clayette inférieure. Pour ajuster la clayette à demi-profondeur, soulevez légèrement la partie avant puis tirez-la vers l'intérieur.3. Relevée vers le haut si vous avez besoin de faire de la place pourles articles de grande taille ou volumineux placés sur la clayette inférieure. Pour relever la clayette vers le haut, réglez-la tout d'abord à mi-chemin de la demi-profondeur. Rabattez la clayette pour revenir en arrière et l'utiliser à demi-profondeur et pleine profondeur.COMPARTIMENT CONGÉLATEURLes congélateurs « Total No Frost » fournissent une circulation d'air froid autour des zones de stockage, et empêchent la formation de glace, en éliminant ainsi totalement la nécessité de dégivrage.Les produits surgelés ne collent pas aux parois, les étiquettes sont lisibles et l'espace de stockage reste propre et net.Le compartiment congélateur permet une conservation de longue durée d'aliments congelés et la congélation d'aliments frais. Laquantité d'aliments frais pouvant être congelés en heures est inscrite sur la plaque signalétique. Placer les aliments frais dans la zone de congélation du compartiment congélateur en laissant assez d’espace autour des emballages pour permettre à l’air de circuler librement. Éviter de laisser des aliments frais entrer en contact direct avec les aliments congelés. Les limites de charge sont déterminées par des paniers, des volets, des tiroirs, des tablettes, etc..Assurez-vous que ces composants peuvent toujours se fermerfacilement après avoir été chargés. Le tiroir/compartiment de la zone de congélation est indiqué sur la photo ci-dessus. Pour optimiser la vitesse de congélation et obtenir davantage de place, le compartiment congélateur peut être utilisé sans les tiroirs et les aliments peuvent être placés directement sur le fond du compartiment.. Pour éviter de gaspiller de la nourriture, consultez les réglages et les durées de conservation recommandés dans le manuel de l'utilisateur en ligne.GlaçonsRemplir le bac à glaçons au 2/3 d’eau et le replacer dans lecompartiment congélateur. N'utilisez jamais d'objets pointus ou tranchants pour éliminer le givre.ACCESSOIRES*PLATEAU À ŒUFSBAC À GLAÇONSPORTE-BOUTEILLESCLAYETTE REPLIABLEINFORMATIONS GÉNÉRALESLes tiroirs, paniers et tablettes doivent rester dans leur position sauf spécification différente dans le présent guide rapide.Le système d'éclairage à l'intérieur du compartiment réfrigérateur utilise un éclairage DEL, qui fournit un meilleur éclairage et utilise moins d'énergie que les ampoules traditionnelles.Les portes et couvercles du réfrigérateur doivent être enlevés avant la mise au rebut, pour éviter que les enfants ou animaux ne soient piégés à l'intérieur.DÉPANNAGEQue faire si...Causes possiblesSolutionsL'appareil ne fonctionne pas.Il se peut que l’alimentation de l’appareil présente une anomalie.•Assurez-vous que le câble électrique est connecté à une prise de courant qui fonctionne avec la bonne tension.• Vérifiez les dispositifs de protection et fusibles du système électrique de votre domicileIl y a de l'eau dans le bac de dégivrage.Cela est tout à fait normal par temps chaud et humide. Il est même possibleque le bac soit à moitié plein.• Vérifiez que l'appareil est de niveau de façon à ce que l'eau ne déborde pas.Les bords de l'appareil, qui entrent en contact avec le joint de porte, sont chauds au toucher. Ceci est tout à fait normal. Cela est tout à fait normal par temps chaud et lorsque le compresseur est en cours de fonctionnement.L'éclairage ne fonctionnepas.Il se peut que l'ampoule ait besoin d'être remplacée.L'appareil peut être en mode Marche/Veille.• Assurez-vous que les dispositifs de protection et fusibles du système électrique de votre installation fonctionnent correctement.•Assurez-vous que le câble électrique est branché dans une prise qui fonctionne avec la bonne tension•Si les voyants à LED sont endommagés, vous devez contacter le Service Après-Vente ou un distributeur agréé pour les remplacer par des voyants de même type.Le moteur semble fonctionner trop durée de fonctionnement du moteurdépend de plusieurs facteurs : fréquenced'ouverture de la porte, quantité d'aliments stockés, température de la pièce, réglages de température.• Assurez-vous que les commandes de l'appareil sont correctement réglées.• Vérifiez s'il n'y a pas trop d'aliments dans l'appareil.• Veillez à ne pas ouvrir la porte trop souvent.•Vérifiez que la porte est correctement fermée.Vous trouverez les documents normatifs, la documentation standard, la commande de pièces derechange et les informations supplémentaires sur le produit :• En visitant nos sites web docs.w hirlpool.e u et parts-s elfservice.w hirlpool.c om• En utilisant le code QR.• Vous pouvez également contacter notre Service après-vente (voir numéro de téléphone dans le livret de garantie). Lorsque vous contactez notre Service après-vente, veuillez indiquer les codes figurant sur la plaque signalétique de l’appareil.Les informations relatives au modèle peuvent être trouvées en utilisant le QR-Code figurant sur l’étiquetteQue faire si...Causes possibles SolutionsLa température de l'appareil est trop élevée.Plusieurs causes sont possibles (voir« Solutions »).• Assurez-vous que le condensateur (à l'arrière de l'appareil) estexempt de poussière et de peluches.• Assurez-vous que la porte est correctement fermée.• Assurez-vous que les joints de porte sont correctement installés.• Par temps chaud ou si la pièce est chauffée, le moteur fonctionnenaturellement plus longtemps.• Si vous avez laissé la porte de l'appareil ouverte pendant un certaintemps ou avez stocké une grande quantité d'aliments, le moteurfonctionne plus longtemps de façon à baisser la température àl'intérieur de l'appareil.Les portes ne s'ouvrent pas, ni ne se ferment pas correctement. Plusieurs causes sont possibles (voir« Solutions »).• Assurez-vous que les emballages de nourritures ne bloquent pas laporte.• Vérifiez que les pièces internes ou la fabrique à glaçonsautomatique sont bien positionnées.• Vérifiez que les joints de porte ne sont pas sales ou collants.• Vérifiez que l'appareil est de niveau.TABLEAU D'AVERTISSEMENTSType d'avertissement Indicateur Cause Solution Alarme porte ouverte.Le voyant du réfrigérateur porte est restée ouverte plus de3 minutes.Fermez la porte.Alarme porte ouverte.Le voyant du réfrigérateur estéteint. La porte est restée ouverte plus de4 minutes.Fermez la porte.Dysfonctionnement.Un des voyants de températureclignote.Mauvais fonctionnement del'appareil.Contactez le Service après-vente.* Disponible sur certains modèles uniquement。
介词à1.表示“去向”“地点”Nous allons à Beijing.Il travaille à la poste.2.表示“距离”La gare est à 100 mètres d’ici.3.表示“时间”Il se lève à six heures.4.表示“方式”Il va à vélo.Il écrit cette lettre au crayon.5.表示“所属”Ce magnétophone est à moi.6.引导名词补语C’est une machine à écrire.7.形容词补语Il est fidèle à la cause communiste.8.引导间接宾语Il demande des renseignements àla concierge.De1.表示来源：从．．．自．．．Je viens de Paris.Il est issu d’une famille ouvrière.2.表示分量或内容Je voudrais une tasse de café.Un kilo de sucre3.表示“程度”Ma montre retarde de deux minutes.La production a augmenté de 5%4.表示“方式”Il m’a fait signe de la tête.Je l’ai vu de mes propres yeux.Je vous remercie votre invitation à dîner.A.parB.grâceC.deD.à5.引导名词补语，表示“的”C’est la moto de Pierre.6.引导形容词补语Ce mur est haut de 3 mètres.7.引导间接宾语Il se souvient de son voyageｅｎＣｈｉｎｅ．８.引导不定式动词Venir d’une famille pauvreSortir de l’écoleSauter de joieSaluer de la mainAvancer d’une heureY aller de son gréAugmenter de 4%Parler d’un sourire介词à和de都可以引导形容词补语，有的词既可以用à，也可以用de,用à引导不定式，必须是直接及物动词；在无人称句中，il做形式主语，用de引导的不定式做实质主语：Il est fidèle à ses principes.Elle est libre de toutes dettes.La situation est difficile à changer.Il est difficile de changer la situation.Ce programme est intéressant à voir.Il est intéressant de voir ce programme.常见的形容词有：facille,difficile,utile,pratique,important,néce ssaire,possible,intéressant,amusant,agréable,simple介词à，de, en在起引导的多个名词前要重复J’écris à mes parents et à mes amis.Il est allé en Espagne et en Italie.Il leur parle de mon voyage et de mon aventure.其他介词一般都不重复：Elle est sortie avec des amis et des collègues.En1.表示“地点”Les étudiants sont en classe.Il y a beaucoup de chômeurs en France.2.表示“时间”Les festivals ont lieu en été.Ils ont retouné à Naples en août.3.表示“状态”La ville est en fête.4.在...方面Notre région est riche en minerais.Il est très fort en mathématiques.5.表示“方式”Il faut écrire cette lettre en français.Je lui ai donné ce livre en cadeau.6.表示“材料”Nous habitons dans une maison en briques. Cette chemise est en nylon.7.表示“颜色”Ces photo sont en couleurs.En noir et blancSans+inf.+pron.+nomElle sort sans fermer la porte.Vous pouvez manger sans moi.C’est un livre sans illustrations.AvecThomas voyage avec sa femme.(和...一起)Je suis d’accord avec vous. (同，与)Avec le progrès de la science,on vaincra le cancer. (随着，与....同时)J’accepte votre invitation avec plaisir. (表“方式”)Il faut agir avec prudence.Je voudrais une chambre avec salles de bains et téléphone. (带有、具有)Par1.表示地点：经过，从Nous avons passé par Tianjing2.表示“每”On travaille 8 heures par jour.3. 表示方式或方法：用，以，通过J’ai réservé une chambre par téléphone. La délégation est arrivée par avion spécial.4.引导施动者补语Ce repas a été préparé par mon père.mencer par,finir par以...开始，以...结束Ils ont fini par trouver un appartement. 6.表示时间，天气的状语Nous sommes rentrés par un froid glacial.Avant\devantNe me téléphonez pas avant 9 heures du matin.Après\derrièreAprès trois heures de travail,nous sommes tous très fatigués.表示位置的介词和短语：1.s ur在...上面Il y a deux cartes sur le mur.Elle passe ses vacances la Côte d’Azur.A.àB.dansC.parD.surIl a un chapeau sur la tête.表示内容数量、对比等Il a écrit un livre sur la Chine.Sur mille candidats,50 sont reçus.Vos conseils ont exercéune grand influence sur nous.2.s ous 在...下面Le chat se cache sous la table.La température est descendue sous zéro degré.3.d evant 在...前面,地点Il y a un petit jardin devant la maison.4.d errière在...后面，地点Mettez le balai derrière la porte.5.d ans 在...里面Les étudiants doivent entrer dans la salle de conférence avant 8 heures.6.e ntre在...之间,表示在两人和两物之间（可以是空间，也可是时间）。
The sRNA RyhB Regulates the Synthesis of the Escherichia coli Methionine Sulfoxide Reductase MsrB but Not MsrAJulia Bos1¤a,Yohann Duverger1,Benoıˆt Thouvenot2¤b,Claude Chiaruttini3,Christiane Branlant2, Mathias Springer3,Bruno Charpentier2,Fre´de´ric Barras1*1Laboratoire de Chimie Bacte´rienne,Institut de Microbiologie de la Me´diterrane´e,Centre National de la Recherche Scientifique-Aix Marseille Universite´,Unite´Mixte de Recherche,Marseille,France,2Centre National de la Recherche Scientifique-Universite´de Lorraine,Unite´Mixte de Recherche,Biopoˆle de l’Universite´de Lorraine,Campus Biologie Sante´,Vandœuvre-le`s-Nancy,France,3Unite´Propre de Recherche du Centre National de la Recherche Scientifique,Universite´Denis Diderot,Paris VII,Institut de Biologie Physico-chimique,Paris,FranceAbstractControlling iron homeostasis is crucial for all aerobically grown living cells that are exposed to oxidative damage by reactive oxygen species(ROS),as free iron increases the production of ROS.Methionine sulfoxide reductases(Msr)are key enzymes in repairing ROS-mediated damage to proteins,as they reduce oxidized methionine(MetSO)residues to methionine.E.coli synthesizes two Msr,A and B,which exhibit substrate diastereospecificity.The bacterial iron-responsive small RNA(sRNA) RyhB controls iron metabolism by modulating intracellular iron usage.We show in this paper that RyhB is a direct regulator of the msrB gene that encodes the MsrB enzyme.RyhB down-regulates msrB transcripts along with Hfq and RNaseE proteins since mutations in the ryhB,fur,hfq,or RNaseE-encoded genes resulted in iron-insensitive expression of msrB.Our results show that RyhB binds to two sequences within the short59UTR of msrB mRNA as identified by reverse transcriptase and RNase and lead(II)protection assays.Toeprinting analysis shows that RyhB pairing to msrB mRNA prevents efficient ribosome binding and thereby inhibits translation initiation.In vivo site directed-mutagenesis experiments in the msrB 59UTR region indicate that both RyhB-pairing sites are required to decrease msrB expression.Thus,this study suggests a novel mechanism of translational regulation where a same sRNA can basepair to two different locations within the same mRNA species.In contrast,expression of msrA is not influenced by changes in iron levels.Citation:Bos J,Duverger Y,Thouvenot B,Chiaruttini C,Branlant C,et al.(2013)The sRNA RyhB Regulates the Synthesis of the Escherichia coli Methionine Sulfoxide Reductase MsrB but Not MsrA.PLoS ONE8(5):e63647.doi:10.1371/journal.pone.0063647Editor:Eric Cascales,CNRS UPR9043,FranceReceived November12,2012;Accepted April4,2013;Published May9,2013Copyright:ß2013Bos et al.This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License,which permits unrestricted use,distribution,and reproduction in any medium,provided the original author and source are credited.Funding:This work was made possible by grants from the Centre National de la Recherche Scientifique,the French National Research Agency and Aix-Marseille University.The funders had no role in study design,data collection and analysis,decision to publish,or preparation of the manuscript."Competing Interests:The authors have declared that no competing interests exist.*E-mail:barras@rs.fr¤a Current address:Department of Molecular Biology,Princeton University,Princeton,New Jersey,United States of America¤b Current address:Laboratoire MTM/Genclis,Vandœuvre-le`s Nancy,FranceIntroductionReactive oxygen species(ROS)can damage most macromole-cules,proteins,nucleic acids and lipids[1].Within proteins,sulfur-containing amino acids,cysteine and methionine(Met)exhibit high sensitivity[2].In particular,methionine oxidation yields methionine sulfoxide(Met-SO)and eventually methionine sulfone. Like any other oxidative modification,methionine oxidation can have deleterious consequences as it can be accompanied by protein carbonylation,protein aggregation and/or degradation [3,4,5].However,the oxidation of Met to Met-SO can be reversed by the action of methionine sulfoxide reductases(Msr)[6,7,8,9,10]. Such an ability to reverse methionine oxidation has led credence to the idea that the surface-exposed Met residues act as scavengers for ROS and that reduction by Msr enables proteins to recover activity[11].Msr proteins are highly conserved among most living organisms [12,13].There are basically two types,referred to as MsrA and B, which act on two different diastereoisomers,Met-S-SO and Met-R-SO,respectively[8,10,14].Lack of functional MsrA and/or B have been reported to cause abnormal cellular function in a wide range of organisms from bacteria to humans,including yeast, mice,flies and plants[7,15,16,17,18,19,20,21].Likewise neuro-logical disorders,shortened life span,and various oxidative stress-related defects have been reported in eukaryotes having reduced Msr activity.As a general trend,bacteria lacking Msr exhibit hypersensitivity to ROS and those that are pathogens have a reduced ability to infect their host[22,23,24,25,26,27,28,29]. Small non-coding RNAs are believed to play a major role in genome expression both in prokaryotes and eukaryotes.The E.coli iron-responsive sRNA RyhB that controls iron metabolism is one of the best studied.Early microarray approaches suggested that RyhB controls directly the expression of about50genes in response to iron limitation[30].RyhB expression is itself negatively regulated by the iron-sensing Ferric uptake regulator (Fur)[31].Hence,when iron becomes limiting,Fur repression is alleviated,RyhB synthesis is induced and expression of its targets inhibited.Genes targeted by RyhB encode iron-storage and iron-using proteins and it was proposed that RyhB enables iron sparing for central metabolism and for essential iron-binding proteins when iron concentration becomes scarce[30,31,32].Therefore, synthesis of a non-essential-iron-using protein would be decreased and the cell would rather employ an iron-non-using functional homolog.An illustration of this model is provided by the SodA and SodB superoxide dismutases.The synthesis of the iron superoxide dismutase SodB is decreased by RyhB under iron limitation,whereas the synthesis of SodA,a Mn-superoxide dismutase is not[30,33].These iron-responsive regulators,RyhB and Fur also play a crucial role to reduce the response to oxidative stress,as free iron is susceptible to react with ROS such as superoxide anions and to increase ROS production via the Fenton and Haber Weiss reactions[34].RyhB regulates gene expression by basepairing within or near the translation initiation region of mRNAs.Two mechanisms of action have been proposed for RyhB to explain its role as a gene expression regulator.In a first mechanism,the pairing of RyhB to its target mRNA interferes either positively or negatively with the30S ribosome subunit binding and thereby translation[31,35,36].Alternatively,the pairing of the sRNA RyhB to the target mRNA can initiate mRNA degradation even in the absence of translation on the mRNA target[37].Early microarray analysis suggested that RyhB levels influence the expression of msrB but not that of msrA[30].In addition,MsrB has been biochemically characterized as an iron binding protein [38].Therefore we wished to test the functional and direct inactivation of the E.coli msrB mRNA by RyhB in vitro and in vivo, and whether the cell switches to msrA under iron limitation.We provide evidence that RyhB directly pairs with the59UTR region of msrB at two distinct sites and does repress msrB expression by competing with the ribosome.Secondly,we showed that msrA expression is not sensitive to changes in iron availability.Thus,in addition to identifying a new target for the sRNA RyhB and pointing out a novel mechanism of translational regulation,this study indicates that in E.coli MsrB is dispensable when iron supply is low but MsrA is retained to repair even limited methionine oxidation.Materials and MethodsMedia and growth conditionsDerivatives of E.coli MG1655strain were used in all experiments and were cultivated under aerobic conditions at 37u C in Luria Bertani(LB)medium unless stated otherwise. Plasmids were maintained with ampicillin used at a final concentration of100m g/ml.Plasmid constructionTranscriptional and/or translational fusions of msrB and msrA genes to lacZ reporter gene were constructed by inserting msrB fragment(from2336to+360relative to msrB start codon)or msrA fragment(from2416to+132relative to msrA start codon)into plasmids pRS415(transcriptional fusion)and pRS414(transla-tional fusion)[39].For information,pRS415contains the lacZ ORF including the lacZ translation initiation region(TIR)whereas pRS414contains the lacZ ORF without the lacZ TIR(‘lacZ).msrB and msrA genes were amplified from MG1655chromosomal DNA with the oligonucleotides B01E/B05B and A01E/A04B(see Table1)respectively.The resulting products were digested with Eco RI and Bam HI and ligated into Eco RI/Bam HI-digested pRS415and pRS414plasmids,to generate the transcriptional and translational fusions to lacZ gene.The msrB’-lacZ,msrB’-‘lacZ and msrA’-‘lacZ constructs were further engineered onto l RS45phage and integrated into the attachment site(att site)of IBPC5321strain as previously described[39],generating strains JB43(transcriptional msrB’-lacZ),JB44(translational msrB’-‘lacZ) and JB56(translational msrA’-‘lacZ).Stable lysogens were screened for single insertion of recombinant by PCR[40]and sequenced using LacZinv primer(see Table1).We next introduced the following D fur::kan and D ryhB::cat deletions by P1transduction in JB44generating strains JB46and JB50respectively and in JB56to generate YD100.The construct pUC-MsrB was generated by PCR using chromosomal DNA from MG1655wild type strain as a template and primers B01E and B05N(see Table1).The resulting product was digested wih Eco RI and Nde I and cloned into the correspond-ing sites of pUC18.The construct was sequenced using the primer pUCVERI and transformed into MG1655wild type strain.The construct pUC-MsrB-HA has been generated using the same protocol to that of pUC-MsrB construct.The HA tag was added to the3’end of msrB using the reverse oligonucleotide BHA(see Table1).IPTG(0.5mM)was added to the culture to induce the synthesis of MsrB and MsrB-HA.Strains used in this study are listed in Table2.Site-directed mutagenesisSite-directed mutagenesis was carried out by PCR using pUC-MsrB or pUC-MsrB-HA as DNA template.Mutations mut1, mut2a,and mut2b are introduced into the5’UTR region of msrB with the use of primers Bm1for-Bm1rev,Bm2afor-Bm2arev, Bm2bfor-Bm2brev respectively,containing the suitable nucleotide mismatches(see Table1).The amplified plasmid products were then digested with Dpn I restriction enzyme for2hours at37u C to select for mutation-containing synthesized DNA and1m l aliquot was transformed into DH5alpha competent cells.Transformation reactions were plated on LB containing ampicillin.Five colonies were selected and the positive clones were screened by digestion and sequenced.Plasmids carrying wild type or mutant alleles were introduced into D msrB strain(SMG505).Transformants were used for Northern blot and Western blot experiments.Western blottingBacteria cells carrying pUC-MsrB-HA,pUC-MsrB mut2a-HA and pUC-MsrB mut2b-HA were cultivated in LB medium to exponential phase.Iron chelator(2–29dipyridyl)was added for 30min and50ml sample aliquots were collected.French Press lysates were spun down for30min at13500rpm.Supernatants were collected and equal amounts of cellular extracts were western-blotted.To detect MsrB-HA protein,the membrane was probed with a mouse anti-HA primary antibody,and with a goat anti mouse IgG alexa fluor680as secondary antibody and scanned by using an Odyssey IR imaging scanner.Band intensity was analyzed by using Image J software.DNA probe labelingRadiolabeled probes used in the Northern blots were generated from PCR products.msrB,RyhB and5S PCR products were generated using the pair of oligonucleotides B1–B4,REco-Rbam and5S1-5S2respectively(see Table1).After gel extraction and purification,the PCR products were then used as a template for [a-32P]dCTP-labeling reaction(Ready-to-go DNA labeling kit, Amersham).Unincorporated nucleotides were removed by using a G-50resin minicolumn.For primer extension assays and toeprint assays,the59end of oligonucleotides437and1451respectively, was labeled with[c-32P]ATP(50m Ci)using T4polynucleotide kinase(10U).RNA isolation and Northern blot analysisTotal RNA was isolated from cells at the indicated times using the SV total RNA isolation system kit as described by the manufacturer(Promega).For Northern blot analysis,total RNA (10m g)was separated on a1.2%TBE-agarose gel and transferred to a Hybond N+nylon membrane.Membranes were UV-crosslinked and hybridized for4hours at58u C with the suitable radiolabeled probe.Membranes were washed three times in 0.05%SDS/2X SSC buffer and then twice in0.1%SDS/0.1X SSC buffer before being scanned by using a phophorimager (Molecular Dynamics).Band intensity was analyzed by using Image J software.Primer extension assaysHybridization reaction between of59-end labeled oligonucleo-tide437(4ng)and purified msrB RNA transcript(100ng)was performed in a final volume of2.5m l,in the1X binding buffer (Tris HCl10mM,pH8,MgCl210mM,NaCl50mM,KCl 50mM)for10min at65u C.RyhB sRNA(5m g)was added to the reaction mix(7.5m l)for10min at37u C.The reverse transcription reaction was performed for30min at42u C by adding5m l of the AMV RT enzyme and dNTPs to the reaction mix.The resulting cDNA reaction mix was loaded onto a6%acrylamide/ bisacrylamide denaturing gel along with the products of dideoxy-sequencing reactions obtained with the same labeled primer.Signal intensities were evaluated using a phosphorimager (Molecular Dynamics).Toeprinting assaysToeprint experiments were carried out using purified30S ribosomal subunits(isolated from D10E.coli strain as described in [41]),tRNAfMet and AMV reverse transcriptase to detect the formation of ternary initiation complexes on the long msrB transcript(450nt).In a typical experiment,the msrB RNA transcript(50fmol)was mixed to a fourfold molar excess of59-labeled437oligonucleotide primer(complementary to positions +60to+73of msrB).Toeprint reactions were performed as described in[42].The toeprint band intensity was analyzed by using Image J software and normalized to that of full-length transcript.Data are represented as means6S.E.from two independent experiments.Half-life determinationOvernight cultures were subcultured in LB medium(200ml)at 37u C to an O.D.600of0.3.Each culture was then divided in2and one culture was treated with2–29dipyridyl(250m M)for15min at 37u C.Samples of5ml started to be collected at different times(0, 2,4,6,8,10,12,15and30min)right after the addition of Rifampicin(0.3mg/ml)and were immediately frozen in liquid nitrogen.Total RNA was extracted from each sample and10m g of total RNA were subjected to a Northern blot analysis using the specific msrB and5S probes.Signal intensities were evaluated using a phosphorimager(Fuji FLA5100)and quantitated by using Image J software.msrB signals were normalized to that of5S RNA.Table1.List of oligonucleotides used in this study.Name SequenceLacZinv ATCGGTGCGGGCCTCTTCBO1E CGCGAATTCCCACCAGCTATTTGTTAGTGBO5B CGCGGATCCGGGTTAACACAATAACGTTCGCCCGTTGGBO5N GGGCATATGTCAACCGTTGATTTCTTCGCCGTTAO1E CGCGAATTCCCTTTCAGACCTTCGCGGATGAO4B CGCGGATCCGTGCCGATCAGGCCTACGCAG5S1GCGGTCTGATAAAACAGAATTTGCC5S2GCCTGGCAGTTCCCTACTCTCGCATBT7TAATACGACTCACTATAGGGCACCAGCTATTTGTTAGTGAB1CCTTCGGCAGAAGAACTGB4GCCCGTTGGCTGCGGCCCGTCGGGGAAGACATGRT7TAATACGACTCACTATAGGGGCGATCAGGAAGACCCTCGCReco GCGGAATTCCGCGATCAGGAAGACCRbam GCGGGATCCAAAAAGCCAGCACCCGGCPUCVERI GGGCATTAGGCACCCCAGGCTTTBM1for GAATCAGTCACGTAATACAAGCACGATTAAAGTGAGATGBM1rev CATCTCACTTTAATCGTGCTTGTATTACGTGACTGATTCBM2afor ACGATTAAAGTGAGATGTGACTCAATGGCTAATAAACCTTCGGBM2arev CCGAAGGTTTATTAGCCATTGAGTCACATCTCACTTTAATCGTBM2bfor ACGATTAAAGTGAGATGTGAGATAATGGCTAATAAACCTTCGGBM2brev CCGAAGGTTTATTAGCCATTATCTCACATCTCACTTTAATCGT437GATTCTGCGTCACGCGTGACGC1429GGCGGTTCTGTCCCATGATTCTGCGTCACGCGTGACGC3261GACTCACTATAGGGGTCACGTAATGTGAGCACGATTAAAGBHA GACTCTCACGTGCATATGTCATTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAACCGTTGATTTCTTCGCC doi:10.1371/journal.pone.0063647.t001Data are represented as means6S.E.from three independent experiments.Beta-galactosidase assaysCultures were grown to exponential phase(O.D.600<0.4)in LB medium supplemented or not with250m M2,29dipyridyl iron chelator.The b-Galactosidase assays were carried out as described (Miller,1972).The results are reported in Table3.In vitro transcription of msrB and RyhBIn vitro transcription of the msrB mRNA and the RyhB sRNA was performed using200units of T7polymerase in T7 transcription buffer(Ambion),the pUC-RyhB and pUC-MsrB vectors(0.5m g)as a DNA template respectively.After2h of incubation at37u C,the mixture was treated with RNase-free DNase I for30min at37u C.RNA transcripts were extracted by phenol/chloroform followed by ethanol-precipitation and were resuspended in RNase-free water.Concentrations of msrB and RyhB transcripts were determined by using a WPA BIOWAVE II spectrophotometer.Dephosphorylated RNA transcripts were59 end-labeled with[c-32P]ATP using T4polynucleotide kinase for 30min at37u C.Radiolabeled RNAs were purified onto a denaturing(8M urea)polyacrylamide gel and eluted overnight in elution buffer(10mM Tris-HCl pH7.5,300mM NaCl,1mM EDTA,1%SDS)followed by ethanol precipitation.RNases and Lead(II)footprinting32P-59end-labelled msrB RNA(,50fmol)was incubated in buffer D[150mM KCl,1.5mM MgCl2,0.2mM EDTA and 20mM HEPES(pH7.9)].For ribonuclease cleavage,reactions were initiated by the addition of1025U/ml of RNase V1or 561022U/ml of RNase T2,and incubated for5min at room temperature.The enzymatic reactions were stopped by extractionTable2.List of bacterial strains and plasmids used in this study.Strains Relevant genotype Source or reference MG1655wild type E.coli K12Lab collectionIBPC5321thi-1,argE3,lacX74,mlt-li,xyl-5,tsx-29,rpsL,argG6,his4[56]JB43IBPC5321msrB’-lacZ This studyJB44IBPC5321msrB’-‘lacZ This studyJB46IBPC5321msrB’-‘lacZ D fur::kan This studyJB50IBPC5321msrB’-‘lacZ D ryhB::cat This studyJB55IBPC5321msrA’-lacZ This studyJB56IBPC5321msrA’-‘lacZ This studyYD100IBPC5321msrA’-‘lacZ D ryhB::cat D fur::kan This studyJB64IBPC5321msrA’-‘lacZ D ryhB::cat This studyJB61IBPC5321msrA’-‘lacZ D fur::kan This studyLCB195MG1655D fur::kan Lab collectionJB99MG1655D ryhB::cat(MG1655*P1EM1238)This studyJB91MG1655rne701-flag-cat(MG1655*P1TM528)This studySMG505MG1655msrB::kan Lab collectionEM1238EM1055D ryhB::cat[31]TM528W3110mlc rne701-flag-cat[57]Plasmids Description Source or reference pRS414contains‘lacZ ORF(deleted TIR)[39]pRS415contains full lacZ ORF[39]pRS414-MsrB’-‘LacZ msrB-336/+360fused to lacZ ORF This studypRS415-MsrB’-LacZ msrB-336/+360fused to lacZ ORF This studypRS414-MsrA’-LacZ msrA-416+132fused to‘lacZ ORF This studypUC-MsrB pUC18carrying wild type msrB This studypUC-MsrBmut1a pUC18,carrying mutated msrBA9G,G10A,C11U This studypUC-MsrBmut1b pUC18,carrying mutated msrBG6A,U7C,G8A This studypUC-MsrBmut2a pUC18,carrying mutated msrBG32C,C33U,A34C This studypUC-MsrBmut2b pUC18,carrying mutated msrBC33A,A34T This studypUC-MsrB-HA pUC18carrying HA tagged-msrB(wt)This studypUC-MsrBmut2aHA pUC18carrying HA tagged-msrB(mut2a)This studypUC-MsrBmut2bHA pUC18carrying HA tagged-msrB(mut2b)This studypUC-RyhB pUC19carrying wild type RyhB B.Charpentier(UHPNancy)doi:10.1371/journal.pone.0063647.t002with phenol/chloroform and precipitation by ethanol in presence of sodium acetate(0.3M)and2m g tRNAs.For lead(II)footprinting,the reactions were initiated by the addition of12mM Pb(II)acetate.After5min incubation at room temperature,reactions were stopped by adding EDTA(0.05M) before ethanol precipitation followed by extraction with phenol/ chloroform and a second precipitation by ethanol in the presence of sodium acetate(0.3M)and2m g tRNAs.As sequence markers, RNA alkaline hydrolysis ladders(cleavage after each nucleotide) were generated by incubating in1M sodium carbonate at pH9for 3min at96u C.RNase T1ladders(cleavage after each guanosine) were generated by incubating the RNA in1M sodium hydroxide citrate for5min at65u C,2m g tRNAs then by adding1U RNase T1for10min at65u C.For both enzymatic and chemical probing reactions,the treated RNA samples were then ethanol-precipitated in the presence of0.3M sodium acetate and washed with80% ethanol.RNA pellets were directly resuspended in RNA loading dye[95%(v/v)formamide,20mM EDTA,0.05%(w/v)each bromophenol blue and xylene cyanol].The cleavage products were separated onto a10%polyacrylamide8M urea-containing gel and visualized by using a Phosphorimager.ResultsExpression of the msrB gene is repressed under iron starvationTranscriptional and translational fusions between the msrB gene and the lacZ reporter gene were constructed and inserted at the att site in the E.coli chromosome.The engineered strains namely JB43and JB44,respectively,were grown in the presence or absence of2,29dipyridyl(2,29dip),an iron chelator,andß-galactosidase activity assayed(Table3).Expression of the translational fusion was repressed by more than three fold in the presence of2,29dip whereas expression of the transcriptional fusion remained nearly the same in both conditions.To assess whether the decrease in expression of the translational reporter observed with the2,29dip was due to a decrease in both msrB mRNA and protein levels,we measured the amount of msrB mRNA and MsrB protein within the cell by Northern and Western blot analyses,respectively.Levels of both msrB mRNA and MsrB protein showed a5-fold decrease under iron limitation (Figure1A–B).The sRNA RyhB is known to specifically down-regulate the expression of numerous genes under iron starvation [30,31].Introducing a ryhB mutation in JB44(JB50)abolished 2,29dip repression,yielding an up constitutive and iron-indepen-dent phenotype(Table3).Expression of RyhB is under Fur repression.Introducing a fur mutation in JB44(JB46)abolished 2,29dip repression,yielding a down constitutive iron-independent phenotype(Table3).Taken together,these results show the expression of the msrB gene to be regulated by the Fur/RyhB cascade such that msrB expression decreases under iron starvation. Expression of the sRNA RyhB reduces the msrB transcript levelsThe sRNA RyhB promotes the degradation of mRNAs encoding Fe-using proteins and the synthesis of RyhB is induced under iron starvation[31,33].Therefore,we analysed the levels of both RyhB and msrB transcripts in cells that were submitted to sudden iron starvation and subsequent iron replenishment (Figure1C,1D).Briefly,cells were grown to mid-exponential phase,exposed to2,29dip for15minutes and subsequently exposed to excess iron(100m M FeSO4).We then carried out Northern blots with probes specific to msrB and RyhB transcripts. Results showed that within5minutes after2,29dip exposure,msrB transcript levels were greatly decreased(Figure1D lane3),while RyhB transcript levels immediately increased(Figure1D lanes3–4).When cells were supplemented with excess iron,msrB transcript levels reached a maximum within5minutes while RyhB transcript decreased to undetectable levels within15minutes(Figure1D, lanes6–7).These observations establish a clear correlation between the presence of RyhB and the absence of msrB transcripts, in full agreement with the hypothesis that RyhB induces msrB transcript degradation.In order to quantify this putative destabilizing effect,we determined the half-life of msrB mRNA in the presence and in the absence of RyhB.To measure the half-life,2,29dip was added to the culture for15minutes,followed by the addition of rifampicin to stop transcription.Total RNA was extracted at different time points and the mRNAs were hybridized with probes specific either to msrB or to5S RNA as an internal control (Figure2).In the wild type strain,the half-life of the msrB mRNA was4.7times shorter in the presence of2,29dip.In contrast,in the ryhB mutant,the half-life of the msrB transcript was the same regardless of the addition of2,29dip.Moreover,in a fur mutantTable3.Expression of msrA-lacZ and msrB-lacZ fusions in wild type,ryhB deletion or fur deletion strains grown to exponential phase(O.D.600<0.4)in LB rich medium either in the presence or in the absence of iron chelator(2,29dip,250m M).Type of fusion Strains LB LB+2,29dip Fold expression±2,29dip Transcriptional msrB’-lacZ(JB43)165563515026300.9xTranslational msrB’-‘lacZ(JB44)680620190680.3xTranslational msrB’-‘lacZ ryhB::cat(JB50)68861670268 1.0xTranslational msrB’-‘lacZ fur::kan(JB46)1816617269 1.0xTranscriptional msrA’-lacZ(JB55)105632148635 1.4xTranslational msrA’-‘lacZ(JB56)586147964 1.4xTranslational msrA’-‘lacZ ryhB::cat(JB64)536693613 1.7xTranslational msrA’-‘lacZ fur::kan(JB61)536560610 1.1xTranslational msrA’-‘lacZ ryhB::cat fur::kan(YD100)346547614 1.4xThe level of b-galactosidase expressed from the fusions is given in Miller units.Each value is the average of four independent experiments with three measurements each.Fold expression in iron starvation is indicated.Standard error is indicated.doi:10.1371/journal.pone.0063647.t003Figure1.RyhB-dependent down-regulation of msrB mRNAs and proteins.(A)Cultures containing a wild type strain of E.coli were grown to an O.D.600value of0.5then250m M2,29dip was added.After30min of incubation with2,29dip,total RNA and proteins were extracted in parallel, giving total RNA used for the Northern blots(top panel)and soluble protein fraction used for Western blot(bottom panel).The same membrane was probed successively for msrB mRNA,RyhB,and23S RNA(loading control)(top panel).MsrB proteins were probed with anti-HA antibodies(bottom panel).The radioactive probes used are described in Materials and Methods,and Table1.(B).Quantification of msrB mRNA,RyhB sRNA and MsrB protein levels(arbitrary units)from experiment described in(A).Band intensity was normalized to that of an internal control(23S for both msrB and RyhB RNA bands;a non-specific protein recognized by anti-HA antibodies for MsrB-HA protein band).(C).Overview of the experiment described in D. Total RNA was extracted at the indicated times(min).(D).Wild type E.coli cells were grown in LB(lanes1,2,5),LB+2,29dip(250m M)(lanes3,4).Iron (100m M)was added after15min of growth in LB(lane8)and after5or15min of pre-incubation with2,29dip(lanes6–7).Samples were removed at indicated time points,and total RNA was extracted as described in Materials and Methods.Strain SMG505(D msrB)was used as a control(lane1).For determination of RyhB and msrB RNA amounts,10m g of total RNA samples were loaded onto a denaturating agarose gel.After migration,a Northern blot hybridization was performed with a specific oligoprobe for RyhB and msrB respectively.Quantification of msrB and RyhB transcript levels (arbitrary units)are shown below Northern blots panels.doi:10.1371/journal.pone.0063647.g001that synthesizes RyhB at a high-level,the half-life of the msrB transcript was the same whether 2,29dip was added or not and was as short as in 2,29dip-exposed wild type cells.Altogether,these observations fit with the model that iron depletion induces RyhB synthesis,which in turn favours the degradation of the msrB mRNA.The RNA degradosome and the RNA chaperone Hfq are required for the RyhB-induced msrB mRNA degradationPrevious characterizations of the mode of action of RyhB showed that RNase E and the RNA degradosome are required in the RyhB-mediated degradation of target mRNAs [33].Therefore we tested if this also explains the RyhB-mediated decrease in the levels of the msrB mRNA.In the rne701mutant,a strain lacking a functional RNA degradosome,the half-life of the msrB transcript was increased 1.5-fold and 8-fold,as compared with the wild type strain,in the presence and in the absence of 2,29dip respectively (Figure 2).This indicates that the RNA degradosome is involved in the msrB transcript destabilization observed under iron limiting conditions.The RNA chaperone Hfq is essential for RyhB-mediated regulation of its target genes.Therefore we tested whether Hfq was involved in msrB regulation.In an hfq mutant,the half-life of the msrB transcript was only slightly changed by the presence of 2,29dip and was increased 4.6-fold in the presence of 2,29dip as compared with the wild type strain.Altogether these observations validate that the RyhB/Hfq/Rnase E complex is involved in the msrB mRNA decay.Identification of two RyhB/msrB pairing sites in the 59UTR of the msrB mRNAIn order to determine whether the RyhB control of msrB expression was due to a direct interaction between the two RNA species,the 59untranslated region (59UTR)of msrB mRNA was searched for sequences complementary to sequences in RyhB.Our results revealed two such potential interaction sites (Figure 3A).The first site,which we will refer to as Site I,is located between G1,the first nucleotide to be transcribed,and A12(Figure 3A).This 12nucleotide long sequence exhibits 12pairings with sequence within RyhB stem-loop 2with a total free energy of225.4kcal/mol.The second site,which we will refer to as Site II,is located between A26and G38and hence overlaps the Shine-Dalgarno sequence.This 13nucleotide long sequence exhibits 12matches with a region located within RyhB loop 2(Figure 3A).Pairing at Site II between RyhB and msrB mRNA is predicted to be less stable than the pairing at Site I with a free energy of 211.7kcal/mol.Thus,this sequence analysis raised the possibility that msrB mRNA possesses two RyhB binding sites.It is remarkable that the two sites contain duplicates of a 9-nucleotide sequence (AUGUGAGCA)and therefore predicted to pair with the same RyhB region,i.e.a sequence of the central stem-loop of RyhB.Experimental identification of two RyhB binding sites in the 59UTR of msrB mRNAThe validity of the predictions reported above was subsequently tested by in vitro approaches.First,we asked whether RyhB binding on msrB mRNA would block reverse transcriptase (RT)elongation in a primer extension assay (PEA).A shorter version of msrB mRNA (124nt;nt +1to +124)including the whole 59UTR region (35nucleotides)was transcribed in vitro and used as a template for PEA in the presence and in the absence of RyhB (Figure 3B).In the presence of RyhB,two primer extension products were detected that were mapped within Site I (C11)and Site II (C33,A34)(Fig.3B;lane 2).As a control,we performed a PEA on the msrB mRNA alone and observed no specific primer extension product along the msrB 1–124RNA transcript (Figure 3B;lane 1).Second,we compared patterns of partial digestion of the 59UTR of the msrB transcript with RNAses in the absence and in the presence of RyhB (Figure 4).When the msrB mRNA was digested by RNase T2(a single strand-specific endoribonuclease with preference for adenosine residues)in the presence of RyhB,cleavages appeared at the 39end of Site I (bonds between residues at positions +12to +14)and Site II (bonds between residues at positions +40to +42)while some others were strongly reinforced downstream of the Site II (bonds between residues at positions +51to +67)(Figure 4,lane 3).Conversely,the presence of RyhB afforded protection against RNase T2cleavages within the binding Sites I and II (bonds between residues at positions +7and +8,and at positions +34and +35,Figure 4;lane 4).When RNase V1(specific for double stranded regions and stacked nucleotides)wasFigure 2.Effects of ryhB ,fur ,rne701and hfq mutations on msrB transcript stability.msrB transcript stability in wild type (A),ryhB mutant (B),fur mutant (C),hfq mutant (D)and rne701mutant (E)strains grown at 37u C to an O.D.600of 0.4,was assayed by Northern blot analysis.After 10min of incubation with 2,29dip,rifampicin was added.Samples were removed at the indicated time points after rifampicin addition and total RNA was extracted as described in Materials and Methods.For determination of msrB mRNA amount,10m g of total RNA samples were loaded onto a denaturating agarose gel.After migration,a Northern blot hybridization was performed with a specific oligoprobe for msrB and 5S as an internal control.Band intensity of msrB transcript was normalized to that of 5S RNA.Half-life (seconds)of msrB transcript and the ratio of msrB mRNA half-life 62,29dip are indicated for the different strains.Standard errors (SE)are shown.doi:10.1371/journal.pone.0063647.g002。
Unit 1 Art单元知识清单重点单词1．precise adj.准确的；精确的→precisely adv.准确地；精确地；的确如此2．realistic adj.现实的；逼真的→real adj.真的；真实的→really adv.真实地；确实3．influential adj.有很大影响力的；有支配力的→influence n．& vt.影响4．photography n．照相术；摄影→photographer n．摄影师→photograph n．照片vt.& vi.(为……)拍照5．investment n．投资额；投资；(时间、精力的)投入→invest v．投资6．memorial n．纪念碑(或像等)；纪念物；纪念品adj.纪念的；悼念的→memory n．记忆力；记忆→memorize vt.记住7．criticise (NAmE ize) vi.& vt.批评；指责；评价→criticism n．批评；指责；评论→critic n．批评家→critical adj.批判的；关键的8．representative adj.典型的；有代表性的n．代表→r epresent vt.代表；象征；描绘9．exhibition n．展览；(技能、感情或行为的)表演→exhibit v．展示；陈列；展览10．artistic adj.艺术的；艺术家的→artist n．艺术家→art n．艺术11．entry n．加入；进入；参与；参赛作品→enter vt.进入；登记12．recognition n．承认；认出；赞誉→recognize vt.辨认出；承认；公认13．expansion n．扩张；扩展；扩大→expand vt.扩展；扩大；(使)膨胀重点短语1．in particular尤其；特别2．set apart from使与众不同；使突出；使优于……3．be fond of喜爱；喜欢4．bring...to life赋予……生命；使……鲜活起来5．be worthy of值得6．concentrate on全神贯注于7．look like看起来像8．seek to do sth.试图做某事9．fail to do sth.未能做某事10．be intended to do sth.旨在做；目的是重点句式1.While his paintings still had religious themes，they showed real people in a real environment.(while引导的从句)虽然他的绘画作品仍有宗教主题，但是它们展示了真实环境中真实的人。
UNIT 1 学业质量检测(时间：120分钟满分：150分)选择题部分第一部分听力(共两节，满分30分)第一节(共5小题；每小题1.5分，满分7.5分)听下面5段对话。
每段对话后有一个小题，从题中所给的A、B、C三个选项中选出最佳选项。
听完每段对话后，你都有10秒钟的时间来回答有关小题和阅读下一小题。
每段对话仅读一遍。
1．Where are the woman and her brother going to spend the holiday？ B A．In Canada. B．In Turkey.C．In Italy.2．What can we learn about the man's watch？ BA．It's 5 minutes fast.B．It's 5 minutes slow.C．It's 10 minutes slow.3．What is available in the district？ BA．The film museum.B．The swimming pool.C．The sports center.4．What is the woman going to do？ AA．Open the window.B．Find another room.C．Go out with the man.5．What do we learn from the conversation？ CA．Jack's brother is cleverer.B．Jack is the better student.C．Jack's brother is more hardworking.第二节(共15小题；每小题1.5分，满分22.5分)听下面5段对话或独白。
每段对话或独白后有几个小题，从题中所给的A、B、C三个选项中选出最佳选项。
听每段对话或独白前，你将有时间阅读各个小题，每小题5秒钟；听完后，各小题将给出5秒钟的作答时间。
单元综合检测(一)第一部分阅读(共两节，满分50分)，满分37.5分)阅读下列短文，从每题所给的A、B、C、D四个选项中选出最佳选项。
AIf you're a design enthusiast, you're sure to feel dizzy over these jawdropping pools.Sky Park Infinity Pool，Marina Bay Sands，SingaporeLocated on the Sky Park above Singapore's most famous hotel, Marina Bay Sands, this is the world's largest rooftop pool.Offering amazing views of the city's skyline, the pool is at least three times the length of an Olympic swimming pool.As visitors swim toward the edge, they face an illusion that they'll float into the skyline.It's quite a heartbeaten rush!The Red Pool, The Library Koh Samui, ThailandThis bloodred pool is perhaps one of the most special hotel pools on the list.Set against the backdrop of Koh Samui's Chaweng Beach, the fascinating colour isn't the result of using artificial dye.Rather, the mosaic tiles (马赛克瓷砖) of orange, yellow and red make the brilliant sight that is set among trees and an open air library.San Alfonso del Mar Resort Pool, Region de valparaiso, ChileThe world's largest outdoor swimming pool gets its water directly from the sea.The pool uses a computercontrolled pump and filtration system.Located at Chile's San Alfonso del Mar Resort, this huge manmade pool is larger than 20 Olympic size pools and holds approximately 250 million litres of water.It also holds the Guinness World Record for being the world's deepest(115 feet) pool.Y40 Deep Joy, Hotel Millepini Terme in Montegrotto Terme, ItalyThe deepest hotel swimming pool in the world will make you feel like you're jumping into the sea! The Y40 Deep Joy is a roundshaped pool that reaches a depth of an impressive 130 feet.The pool, which has special caves, ledges (壁架) and underwater viewing glass, was designed by wellknown architect Emanuele Boaretto.It's meant for leisure dives, dive training and photo shoots.【语篇解读】本文是一篇应用文。
法语拙政园导游词翻译拙政园位于苏州城东北隅(东北街178号)，截至2014年，仍是苏州存在的最大的古典园林，占地78亩(约合5.2公顷)。
接下来是小编为大家整理的关于法语拙政园导游词翻译，方便大家阅读与鉴赏!法语拙政园导游词翻译1Bonjour tout le monde, bienvenue à Suzhou, je m'appelle Hua hantao, tout le monde m'appelle Xiaohua ou guide touristique chinois, Suzhou a beaucoup de jardins, parmi lesquels le jardin Zhuozheng est l'un des "quatre jardins célèbres" de notre pays, est également un beau travail dans le jardin classique Jiangnan, aujourd'h ui, Je vous emmène visiter le jardin Zhuozheng, environ deux heures.Le jardin Zhuozheng est l'?uvre représentative du jardin privé de notre pays. Il est considéré comme le Trésor du patrimoine culturel national de notre pays dans le premier lot d'unités n ationales clés de protection des reliques culturelles publiées par le Conseil d'?tat le 4 mars 1961 et est salué comme la ? mère du jardin sous le monde ?.Maintenant, nous sommes arrivés à la porte d'entrée principale du jardin Zhuozheng. Vous pouvez voir qu'il y a trois caractères au - dessus de la porte d'entrée. Le jardin Zhuozheng a été construit dans la quatrième année de Zhengde dans la dynastie Ming. Wang xianshen, empereur de l'histoire impériale, est retourné à la maison En raison de la frustratio n officielle. Il a été construit sur le site original du temple Dahong comme jardin, avec des pavillons et des pavillons dans le jardin, de petits ponts et des bois anciens.Le nom du jardin de Zhuo Zheng est abrégé en "celui qui est aussi Zhuo est aussi Zheng" dans le Fu de la résidence oisive.Une salle à trois portes que nous voyons maintenant est la salle lanxue.Les mots "lanxue" de Li Bai "Spring Wind and lanxue" symbolisent le sentiment noble du propriétaire d'être aussi libre que Spring Wind et aussi propre que lanxue.Il y a une sculpture de laque sur l'écran central, qui est une vue panoramique du jardin de Zhuozheng.Ci - dessous, nous allons visiter "wuzhu HuYou", qui est situé à l'est du jardin, communément appelé "moon to Wind to Pavilion", sa for me est très chic, quatre grandes portes rondes nous rappellent la Lune dans la nuit du 15 ao?t.Si vous regardez à l'extérieur du pavillon, ces quatre portes rondes ressemblent à quatre grands cadres.C'est le célèbre Suzhou Zhuozheng Park, bienvenue à Suzhou pour jouer, au revoir.法语拙政园导游词翻译2Chers visiteurs, aujourd'hui, nous sommes venus à Suzhou, l'un des jardins classiques du jardin Zhuozheng.Le jardin de la mauvaise administration a une très longue histoire.Couvrant une superficie de 78 Mu, l'ensemble du jardin est divisé en trois parties: l'Est, le milieu et l'Ouest. Il a été construit dans la quatrième année de Zhengde dans la dynastie Ming.Selon la légende, Wang xianzhen a comparé Pan Yue de la dynastie Jin à lui - même. Il y avait un tel texte dans le Fu de Pan Yue sur la vie oisive: "l'ambition des gens ordinaires est de construire des maisons et de planter des arbres, et ils sont libres et autonomes.Les étangs et les marais sont suffisants pour la pêche et les taxes printanières pour l'agriculture.Arroser le jardin de porridge et de légumes pour la nourriture du matin et de la nuit; faire cuire le fromage de berger pour la nourriture du piété filiale n'est rien d'autre que la piété filiale, l'ami est frère, c'estaussi une mauvaise politique.Wang xianzhen a pris le mot "mauvaise administration" comme nom de jardin pour exprimer sa colère.Un tel environnement magnifique, s'il vous pla?t prêter attention à l'assainissement, garder propre.Les visiteurs, nous sommes maintenant arrivés à l'étang Shijing, je crois que vous l'avez vu, l'étang plein de lotus est ouvert, très beau, plus tard vous pouvez prendre des photos ici.Certains de ces Lotus sont encore des bourgeons, des tambours et des tambours, certains ont grandi de petits jardins de lotus Peng Suzhou, et d'autres sont de nouveaux bourgeons.S'il vous pla?t, prenez soin de ces fleurs de lotus et ne jetez pas les ordures dans l'étang.Touristes, nous sommes maintenant dans le jardin des Yi.Il y a beaucoup de fleurs et d'herbes étranges dans le jardin Yi, et il y a toutes sortes de pierres étranges.Les fleurs ici sont colorées, on peut vraiment dire que c'est le pays des merveilles!Tout le monde peut se tenir sur cette pierre pour prendre des photos et prendre des photos panoramiques.Touristes, nous sommes maintenant arrivés dans le jardin de l'humble administration du seul pont, le petit arc - en - ciel.Les ponts cramoisis se reflètent dans l'eau, les vagues ondulent, comme un arc - en - ciel.L'arc - en - ciel est un magnifique pont de couleur q ui enjambe la terre après la pluie et le soleil. Les anciens utilisent l'arc - en - ciel pour décrire le pont avec une intention merveilleuse.Il ne s'agit pas seulement d'un passage reliant la surface de l'eau à la terre, mais aussi d'un paysage unique cen tré sur le pont, qui est un pont élégant.OK, les touristes, aujourd'hui ma mission de guide touristique est terminée, maintenant Donnez - nous une heure, vous pouvez prendre des photos dans le jardin del'administration humble et profiter de la visite.Amusez - vous bien.法语拙政园导游词翻译3Bonjour tout le monde, je suis votre guide Huang Hao.Le jardin Zhuozheng est un jardin typique de la dynastie Ming. Il est compact et petit, simple et élégant.L'eau est au centre de tout le jardin.Elle était divisée en trois pa rties: l'Est, le Centre et l'Ouest.Nous sommes d'abord arrivés au jardin est, s'il vous pla?t voir, à l'est de la pelouse ouverte, la pelouse à l'Ouest des montagnes de terre empilées, il y a des pavillons en bois, autour de l'eau courante, les berges et les saules pendent bas, entre les Rocheuses, le s crêtes, le Front de l'eau construit avec des champs d'eau, des ponts courbés, il a une forte caractéristique de la ville aquatique du Sud de la rivière, comme c'est beau!En traversant le jardin est, nous sommes arrivés au jardin central.Le jardin centra l est centré sur la piscine. Les pavillons et les pavillons sont construits près de l'eau. Certains pavillons et pavillons sont directement hors de l'eau.S'il vous pla?t voir, cette maison antique est la salle principale yuanxiang hall avec le parfum de lo tus, avec de longues fenêtres sur les quatre c?tés pour profiter de la vue dans le jardin.T out le monde, s'il vous pla?t venez au nord de la salle, il y a une plate - forme de piscine, la piscine peut profiter de l'?le et du pavillon lointain.Ici, l'eau de la piscine est claire, les fleurs de lotus sont plantées partout, l'?le de montagne est bordée d'arbres, le paysage des quatre saisons est différent selon le temps, ah!Allons plus à l'Ouest et nous verrons le jardin Ouest.L'Ouest est compact et construit des pavillons près des montagnes et des rivières.C'est le b?timent principal du jardin Ouest est 36 Yuanyang Hall, c'est l'h?te du jardin à l'époque pour divertir lesinvités et écouter de la musique.Par une journée ensoleillée, la vue extérieure de l'intérieur à travers les fenêtres bleues est comme une piscine du pavillon des canards mandarins est en forme de règle.Il y a de beaux paysages partout dans le jardin de Zhuozheng.Faites attention à l'hygiène et à la sécurité pendant la visite et ne jetez pas de déchets.法语拙政园导游词翻译4Bonjour tout le monde!Bienvenue à Suzhou Zhuozheng Garden, l'un des quatre jardins célèbres de Chine.C'est un chef - d'?uvre du jardin privé chinois.Ce jardin mal géré est appelé "la mère du jardin du monde".Entrons.Le ja rdin.Le jardin est divisé en trois parties.Pourquoi appelons - nous cela un jardin politique humble?Parce que le propriétaire du jardin est Wang xianshen.Il veut dire que je ne suis pas un fonctionnaire, je suis un idiot.Il passe par la porte du mur et la porte de taille du jardin Zhuo. ? l'est du jardin Zhuo, il y a une chambre de trois Chambres au sud du jardin est, appelée "salle de neige bleue".Le mot "neige bleue" vient du printemps de Li Bai, et le vent et la neige bleue symbolisent le sentiment noble du ma?tre, libre comme la brise printanière, aussi frais que la nxue en plus de "lanxue Hall", il y a aussi "kunxiang Hall", "Tianquan Hall", "Furong Sky", etc.Passons maintenant à un jeu important.Il y a toutes sortes de fenêtres sur les murs du couloir.Si vous regardez à l'intérieur, vous verrez 25 peintures de différents styles.Maintenant, nous continuons tout droit, devant le miroir et devant le cinéma inversé, il y a une voie navigable surface de la piscine est inégale.Regarde le toit, on dirait un ventilateur.Les tuiles du toit ressemblent à des ventilateurs montagne derrièrele pavillon Li ressemble à un ventilateur pliant, presque sans couture.C'est la fin du voyage.Au revoir à tous les visiteurs!法语拙政园导游词翻译5Bonjour tout le monde!Bienvenue à Suzhou Zhuozheng Garden, l'un des quatre jardins célèbres de notre pays.C'est le chef - d'?uvre du jardin privé chinois, et le jardin de la mauvaise administration est appelé "la mère du jardin du monde".Allons dans le jardin.Le jardin est divisé en trois parties, dont l'essence est au milieu.Pourquoi s'appelle - t - on humble jardin politique?Parce que le propriétaire du jardin est Wang xianshen, ce qu'il veut dire, je ne suis pas un fonctionnaire, je suis un homme stupide.Nous sommes arrivés à l'est du jardin de la dynastie Zhuo en passant par la porte murale du jardin de la dynastie Zhuo et la porte de taille du jardin de la dynastie Zhuo.Au sud du jardin de l'est se trouve une salle à trois pièces appelée "Lan Xue Tang".Les mo ts "lanxue" proviennent de la phrase de Li Bai "Spring Wind and lanxue", qui symbolise le sentiment noble du propriétaire d'être aussi libre que Spring Wind et aussi propre que lanxue.En plus de "Lan Xue Tang", il y a aussi "kunxiang Hall", "Tianquan Hall", "Furong Field" et ainsi de suite.Maintenant nous allons entrer dans la partie essentielle.Il y a toutes sortes de fleurs de fenêtre sur les murs du couloir, et si vous regardez à l'intérieur, vous verrez 25 peintures de différents styles.Maintenant, nou s allons de l'avant, devant le "rétroviseur".Il y a une galerie d'eau sinueuse devant la salle de cinéma inversé surface de la piscine est ondulée.Regardez le toit, comme un ventilateur, les tuiles du toit comme un ventilateur pliant, derrière le "pavi llon Li" le pic est comme un ventilateurpliant, presque connecté sans couture.C'est la fin de la visite, au revoir aux amis des touristes!。
