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一、实验目的1. 掌握紫外诱变技术的原理和方法。
2. 了解紫外诱变在微生物育种中的应用。
3. 通过实验，筛选出具有较高产酶能力的突变菌株。
二、实验原理紫外诱变技术是利用紫外线照射微生物，使微生物DNA发生突变，从而获得具有优良性状的菌株。
紫外线照射能导致DNA分子中碱基对的改变、缺失或插入，进而影响基因的表达，产生新的遗传性状。
三、实验材料1. 菌种：产淀粉酶枯草芽孢杆菌。
2. 器材：紫外线照射装置、超净工作台、电磁力搅拌器、低速离心机、培养皿、涂布器、10mL离心管、（1、5、10mL）吸管、250mL三角瓶、恒温摇床、培养箱、直尺、棉签、橡皮手套、洗耳球。
3. 培养基和试剂：无菌水、75%酒精、0.5％碘液、碘片1g、碘化钾2g、蒸馏水200mL、可溶性淀粉2g、牛肉膏1g。
四、实验方法1. 菌种活化：将产淀粉酶枯草芽孢杆菌接种于牛肉膏蛋白胨培养基中，37℃培养24小时，得到活化菌种。
2. 菌悬液制备：将活化菌种接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃、180r/min 振荡培养3小时，制成菌悬液。
3. 紫外诱变：将菌悬液置于紫外照射装置下，距离20~30cm，照射时间分别为1、2、3分钟，设置对照组（未照射）。
4. 细菌复苏：将照射后的菌悬液涂布于牛肉膏蛋白胨培养基平板上，37℃培养24小时，观察菌落生长情况。
5. 初筛：挑选生长速度较快、菌落形态异常的菌落，进行进一步的淀粉酶活性测定。
6. 淀粉酶活性测定：将挑选的突变菌株接种于可溶性淀粉培养基中，37℃培养24小时，用碘液检测淀粉酶活性。
7. 验证与保存：对具有较高淀粉酶活性的突变菌株进行验证，并保存于甘油管中。
五、实验结果1. 紫外线照射时间对菌落生长的影响：照射1分钟时，菌落生长速度明显降低；照射2分钟时，菌落生长速度有所下降；照射3分钟时，菌落生长速度明显下降。
2. 淀粉酶活性测定结果：经过筛选，发现突变菌株A的淀粉酶活性最高，为对照组的1.5倍。
紫外线对枯草芽孢杆菌生产菌株的诱变与筛选马加强;吴明;马礼鹏;刘博【摘要】枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种革兰氏阳性菌，具有种类多、分泌蛋白能力强、安全性好等优点，是一种重要工业酶和工业制剂的菌种，被广泛应用于医药、食品、农业、饲料、造纸和纺织等多种领域。
为了进一步提高枯草芽孢杆菌的发酵能力，采用紫外线照射的方法诱导筛选高产菌株。
对通过紫外线诱导提高枯草芽孢杆菌产淀粉酶、蛋白酶、α－乙酰乳酸脱羧酶（α－acetolactate decarboxy－lase，简称α－ALDC）、3－羟基丁酮（Acetoin）和葡萄糖－1－磷酸（Glucose－1－phosphate，简称G－1－P）能力的条件进行了比较。
%Bacillus subtilis is a kind of gram positive bacteria, which has many advantages, such as abundant varieties, strong ability of secreting protein, good safety and so on.It is a kind of important industrial enzyme and industrial formulation, and has been widely used in many fields, such as medicine, food, agriculture, feed, paper and textile.In order to further improve the fermentation ability of Bacillus subtilis, the high yield strain was induced by UV irradiation.The conditions for improving the production of amylase, protease,α-ALDC, acetoin, glucose-1-phos-phate were compared by ultraviolet radiation.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2016(044)017【总页数】4页(P18-20,72)【关键词】枯草芽孢杆菌;紫外线诱导;酶制剂;3-羟基丁酮;葡萄糖-1-磷酸【作者】马加强;吴明;马礼鹏;刘博【作者单位】中央民族大学生命与环境科学学院，北京100081;中央民族大学生命与环境科学学院，北京100081;中央民族大学生命与环境科学学院，北京100081;中央民族大学生命与环境科学学院，北京100081【正文语种】中文【中图分类】S182枯草芽孢杆菌是一种革兰氏阳性菌，呈直杆状，内生芽孢，好氧，其菌落不透明，呈白色或微黄色，表面粗糙，可将体内生产的蛋白分泌到胞外。
运用紫外诱变获得并筛选植酸酶高产菌株摘要本文介绍了运用紫外诱变技术获得植酸酶高产菌株的方法，并对其进行筛选、鉴定及酶活测定。
通过实验验证，成功选育出一株植酸酶高产菌株，其酶活达到了较高水平。
介绍植酸酶是一种具有解除植物中植酸盐抗营养因子作用的酶。
在动物、人类体内，它能够释放无机磷以提高对磷的利用效率。
因此，植酸酶在生物技术和农业生产中具有极高的价值。
目前，获得植酸酶高产菌株的方法有很多，例如基因工程、长期培养筛选等。
然而，这些方法对设备、时间、技术水平等要求比较高，成本也比较高。
相比之下，运用紫外诱变技术获得植酸酶高产菌株更具优势。
紫外诱变是一种传统的微生物术语。
它是指用紫外线辐射处理微生物，产生突变，从而改变微生物的某些性状的过程。
它有着速度快、操作简便、筛选效果显著等优点。
实验材料和方法实验菌株以原繁压菌作为研究对象。
原繁压菌是一种常见的生物菌株，可用于生物技术、医药、环保等领域。
实验中使用的原繁压菌来自于某生物技术公司。
实验设备和试剂实验设备包括无菌工作台、高压灭菌器、紫外线灯、恒温振荡培养箱、分光光度计等。
试剂包括琼脂、LB培养基、植酸盐、硝酸钠、Na2HPO4等。
实验步骤1.取10微升的原繁压菌液放置于琼脂平板上，待其全面涂布后将其放入无菌工作台上恒温培养。
2.取1平板用紫外线灯辐照1分钟，同时对照组以同样方式处理。
3.将受照试验组培养菌悬浮于LB液体培养基中，恒温振荡培养，选取菌株后进行次级发酵。
4.通过过筛试验及酶活测定鉴定所获得的高产菌株。
实验结果及分析经过实验验证，紫外诱变成功激发原繁压菌中某些菌株的植酸酶高产潜力。
在恒温振荡扩大培养的过程中，筛选和鉴定了一类植酸酶高产菌株。
经过次级发酵，该高产菌株平均比对照组酶活测定提高了50%左右，酶活达到了200u/g左右。
本实验成功地运用了紫外诱变技术获得植酸酶高产菌株。
该方法操作简便，快速，能够筛选出带有目的性的高产菌株。
本实验结果可以为利用微生物生产高附加值产品提供实验参考。
紫外诱变及其突变株的性能测试1材料与方法1.1材料菌种：四铃啤酒酵母仪器：分光光度计、恒温振荡器、水浴锅、离心机、显微镜、蒸馏装置、分析天平。
培养基：麦芽汁培养基，麦芽汁固体培养基。
（麦芽汁由四铃啤酒厂提供）1.2试验方法1.2.1酵母菌的活化取菌种接种至装有麦芽汁液体培养基的锥形瓶130r/min振荡培养，于28℃恒温培养箱培养14h，得到正常生长阶段的酿酒酵母菌悬液。
然后接种于斜面麦芽汁固体培养基上，采用28℃恒温培养14h，得到完全活化的正常生长的酵母菌。
1.2.2酿酒酵母菌对数生长期的测定1.2.2.1菌悬液的制备取1OmL菌液离心收集菌体，洗涤2次后，菌体悬浮于1OmL生理盐水中，制得菌悬液。
取活化的菌悬液各1mL接种于36支含9mL的麦芽汁液体培养基中，摇匀，130r/min振荡培养，每隔2h取试管3个，放入冰箱，全部培养结束用722型分光光度计于波长600nm处测各管菌液的吸光度值，以空白的麦芽汁培养液为对比，根据所得数据做出酿酒酵母菌的生长曲线。
（此图视为参考）1.2.3紫外线诱变试验用麦芽汁液体培养基将处于对数生长期的菌悬液稀释，使菌种的浓度达到lx106个／mL。
(此处菌悬液浓度的确定采用三种方法：1.显微镜直接计数法;2.平板菌落计数法；3.光电比浊计数法)备注：平板直接计数法：如果过少菌液不易涂布开，过多则在涂布完后或在培养时菌液仍会在平板表面流动，不易形成单菌落，且培养周期长，耗时多，工作量大，但是也是我们的强项，可以锻炼大一的动手能力。
2：显微镜直接计数法：比较直观，我们可以直接显微观察，多人工作计数。
耗时较短，且工作量较小，并且我系其他实验组采用此方法计数，可供参考。
3：光电比浊法：虽然绘制标准曲线要求较高，但是工作量较小，且一次绘制好标准曲线好后，以后可以用，准确率较高。
比较三种方法，我倾向于第一种和第三种，二者相比较，可以校正方案。
实验步骤：打开30W紫外灯预热30min，使其功率达到稳定。
一、实验目的1. 通过紫外线诱变技术，提高微生物的产酶能力。
2. 筛选出具有较高酶活性的突变菌株。
二、实验原理紫外线诱变是一种物理诱变方法，通过紫外线照射微生物细胞，导致DNA分子发生突变，从而产生具有新的遗传特性的菌株。
本实验采用紫外线照射枯草芽孢杆菌，通过透明圈法初筛，筛选出具有较高淀粉酶活性的突变菌株。
三、实验材料1. 菌种：枯草芽孢杆菌2. 器材：紫外线灯、培养皿、涂布器、吸管、恒温摇床、培养箱、直尺、棉签、橡皮手套、洗耳球3. 培养基：可溶性淀粉培养基、牛肉膏培养基、0.5%碘液四、实验方法1. 紫外线照射：将枯草芽孢杆菌接种于牛肉膏培养基中，培养至对数生长期。
将培养好的菌液用无菌水稀释至一定浓度，取适量菌液均匀涂布于培养皿上，放入紫外灯照射箱中，照射距离为20-30cm，照射时间为1-3分钟。
照射过程中，严格控制死亡率在50%-80%。
2. 初筛：将照射后的菌落用无菌水洗涤，制成菌悬液。
取适量菌悬液涂布于可溶性淀粉培养基上，37℃培养24小时。
观察透明圈的大小，筛选出具有较大透明圈的突变菌株。
3. 酶活性测定：采用淀粉酶活力测定方法，测定筛选出的突变菌株的淀粉酶活性，并与原始菌株进行对比。
五、实验结果1. 紫外线照射后，部分菌株出现透明圈，且透明圈大小不一。
2. 经过初筛，筛选出10株具有较大透明圈的突变菌株。
3. 酶活性测定结果显示，筛选出的10株突变菌株的淀粉酶活性均高于原始菌株，其中菌株A的淀粉酶活性最高，达到原始菌株的1.8倍。
六、讨论与分析1. 紫外线照射能够有效诱导枯草芽孢杆菌产生淀粉酶活性突变菌株，且突变频率较高。
2. 初筛过程中，透明圈大小与淀粉酶活性具有一定的相关性，透明圈越大，酶活性越高。
3. 实验结果表明，通过紫外线诱变技术，可以有效地提高枯草芽孢杆菌的产酶能力，为微生物育种提供了一种新的方法。
七、结论1. 紫外线诱变技术是一种有效提高微生物产酶能力的方法。
2. 本实验筛选出的突变菌株具有较高淀粉酶活性，为后续的发酵生产和应用提供了有利条件。
紫外诱变大肠杆菌str(链霉素)抗性突变株的筛选一、目的要求1 、观察紫外线对链霉素产生抗性的诱变效应2 、学习并掌握物理诱变育种的方法。
二、基本原理紫外线的波长在200~380 nm 之间，但对诱变最有效的波长仅仅是在253~265 nm，一般紫外线杀菌灯所发射的紫外线大约有80%是254 nm。
紫外线诱变的主要生物学效应是由于DNA 变化而造成的，DNA 对紫外线有强烈的吸收作用，尤其是碱基中的嘧啶，它比嘌呤更为敏感。
紫外线引起DNA 结构变化的形式很多，如DNA 链的断裂、碱基破坏。
但其最主要的作用是使同链DNA 的相邻嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体，阻碍碱基间的正常配对，从而引起微生物突变或死亡。
经紫外线损伤的DNA，能被可见光复活，因此，经诱变处理后的微生物菌种要避免长波紫外线和可见光的照射，故经紫外线照射后样品需用黑纸或黑布包裹。
另外，照射处理后的孢子悬液不要贮放太久，以免突变在黑暗中修复。
三、实验材料(一) 菌种大肠杆菌(二) 培养基（完全培养基）1. 肉膏蛋白胨培养基牛肉膏 0.5 g蛋白胨 1.0 gNaCl 0.5 g水 100 mLpH 7.2100 KPa 、121℃高压蒸汽灭菌20min。
如配制固体培养基需加琼脂1.5%～2%。
如配制半固体培养基则加琼脂0.7%～0.8%。
(三) 主要药品牛肉膏、蛋白胨、NaCl、可溶性淀粉、链霉素。
(四) 主要器皿试管30支、移液管1mL10支、5mL3支、10mL1支、锥形瓶10个、量筒、烧杯、培养皿30个、离心管、20 W 紫外灯、磁力搅拌器、离心机、紫外诱变箱等。
四、实验内容(一) 诱变1. 菌悬液的制备出发菌株移接新鲜斜面培养基，37℃培养16～24h。
取已培养20 h 的活化大肠杆菌斜面一支，用10 mL 生理盐水将菌苔洗下，取4mL 于5mL离心管中离心(3000 r/min)15min，弃上清液，将菌体用无菌生理盐水洗涤2 次，最后制成菌悬液并倒入盛有玻璃珠的锥形瓶中，强烈振荡10 min，以打碎菌块制成单菌悬液，用血球计数板在显微镜下直接计数。
简述营养缺陷型菌株的筛选方法营养缺陷型菌株是指在一定条件下，无法自主合成某些生物活性物质而需要外源性提供的菌株。
这类菌株在微生物研究和应用中具有重要意义。
本文将介绍几种常用的营养缺陷型菌株的筛选方法。
1. 选择基质筛选法选择基质筛选法是一种简单直接的筛选方法。
首先，根据所需筛选菌株的营养缺陷特点，选择一种含有该营养物质的基质。
然后，将待筛选的菌株接种于这种基质上进行培养。
如果菌株能够生长、繁殖，说明其具有该营养物质的合成能力；如果菌株无法生长、繁殖，说明其存在该营养物质的缺陷。
通过这种方法可以初步筛选出营养缺陷型菌株。
2. 诱变筛选法诱变筛选法是通过诱变剂对菌株进行处理，使其发生突变，进而筛选出营养缺陷型菌株。
常用的诱变剂有化学物质和物理因素。
化学物质如亚硝酸钠、硝酸钠等，物理因素如紫外线、γ射线等，这些诱变剂能够引起菌株的DNA发生突变。
在诱变后，将菌株接种到无法自主合成某种生物活性物质的培养基上，观察其生长情况。
如果菌株能够生长、繁殖，说明其突变后具有该物质的合成能力丧失，从而可以筛选出营养缺陷型菌株。
3. 基因敲除筛选法基因敲除筛选法是通过遗传工程手段将特定基因从菌株中删除，以筛选出营养缺陷型菌株。
首先，通过PCR扩增的方法获得待敲除基因的DNA片段，并引入到质粒载体中。
然后，将质粒载体导入到目标菌株中，经过转化或转染等方式使其取得该质粒。
接下来，通过选择性培养基筛选，以抗生素等为筛选标记，筛选出已经发生基因敲除的菌株。
最后，通过基因测序等方法验证所得菌株中目标基因已经被成功敲除，从而得到营养缺陷型菌株。
4. 遗传重组筛选法遗传重组筛选法是通过基因重组技术将特定基因导入到菌株中，使其能够合成原本无法自主合成的物质。
首先，将目标基因与适当的表达载体连接，并经过酶切、连接等操作获得重组质粒。
然后，将重组质粒导入到宿主菌株中，使其取得重组质粒。
最后，通过选择性培养基等筛选方法，筛选出成功获得目标基因的菌株。
竭诚为您提供优质文档/双击可除大肠杆菌培养实验报告篇一：大肠杆菌实验报告大肠杆菌紫外线诱变及抗药性菌株筛选0740063阿噟兰1.前言抗生素能破坏细菌细胞壁的结构，使细菌的繁殖和生长受到抑制。
但某些细菌对抗生素表现出抗性，原因是其基因发生了改变，产生能抵抗抗生素的性状。
在自然情况下，细菌的基因突变率很低，而且突变是不定向的，因此在自然条件下，想要获得有抗性的细菌是很困难的。
当给与适当的物理条件时，其突变率会大大增加。
如当用α射线、β射线、γ射线、Χ射线、中子和其他粒子、紫外线、微波等物理因素辐射时，能够促进遗传物质突变。
DnA对紫外线（uV）有强烈的吸收作用，尤其是碱基中的嘧啶，它比嘌呤更为敏感。
紫外线引起DnA结构变化的形式有DnA链断裂、碱基破坏、胸腺嘧啶二聚体等。
因此，紫外线通常作为诱变剂，用于微生物菌种选育。
一般细胞分裂越旺盛，诱变剂量越大，突变率高，诱变最有效的波长253~265nm。
选择合适的诱变剂量对于获得较高突变率十分关键，过高或过低的辐射剂量会导致菌株死亡或诱变不充分而降低诱变效果。
在紫外线诱变下，菌株发生不定向的突变，想要得到需要的特向变异必须对诱变后的菌株做筛选。
本实验想要得到的是能够抵抗抗生素的菌株，因此可以用抗生素培养基作为筛选培养基对菌种进行筛选。
若菌株没有发生定向突变，则该菌株不能在抗性培养基上正常生长，只有发生了定向突变才可能在筛选培养基上正常生长。
紫外线对于菌株有诱变作用外，对菌株还有较强的致死作用，因为紫外线改变了菌株的基因结构导致菌株无法正常生长繁殖。
因此，通过本实验的操作，在合适的照射剂量的设置下，比较不同不同照射剂量下的致死效果和突变率，并初步分析两者的相关性。
在分析死亡曲线和诱变率曲线的基础上，能了解诱变育种的机理和方法，为做进一步的诱变实验做准备。
2.材料和方法2.1实验材料、仪器和试剂菌种：大肠杆菌仪器：超净台、离心机、高压灭菌锅、培养箱、磁力搅拌器、培养皿、涂布器、移液管、移液器试剂：牛肉膏蛋白胨培养基相关试剂、硫酸卡那霉素水溶液（50mg/ml）、生理盐水2.2实验方法2.2.1制备培养基普通培养基——牛肉膏蛋白胨培养基（400ml）：牛肉膏5g蛋白胨10gnacl5g琼脂20g蒸馏水1000mlph7.0按配方配制好培养基后置于灭菌锅中115℃15min，倒平板，4皿*15ml*5组+2皿*15ml=22皿*15ml=330ml筛选培养基(200ml)：含抗生素50mg/L。
微生物紫外线诱变育种的一般流程微生物紫外线诱变育种啊，这可挺有趣的呢。
一、出发菌株的选择。
这就像是选种子一样，咱们得挑个好的出发菌株。
这个菌株得是那种本身就有点潜力的，比如说它在某些方面已经表现得还不错了，像是生长速度还行啦，或者对环境有一定的适应能力之类的。
要是一开始就选个病恹恹的菌株，那后面再怎么诱变可能都白搭。
就好比你要培养一个运动员，你得先找个身体素质有点基础的人，不能找个整天生病的呀。
二、菌悬液的制备。
把选好的菌株弄成菌悬液，这就像是把种子泡在水里，让它们能均匀地分布。
这个菌悬液的浓度可不能太浓也不能太稀哦。
太浓了呢，紫外线可能照不均匀，就像一群人挤在一起，有些地方晒得到太阳，有些地方晒不到。
太稀了呢，那最后得到的突变体可能就太少了。
一般来说，咱们得根据经验或者查一些资料来确定这个合适的浓度。
在制备菌悬液的时候，还得注意保持菌株的活性，就像照顾小宝贝一样，环境得适宜，营养也不能少，可不能让它们在这个时候就挂掉了。
三、紫外线照射。
这可是关键的一步呢。
就像是给这些微生物来一场刺激的阳光浴，不过这个阳光可是紫外线。
咱们得把菌悬液放在紫外线灯下照射。
这个照射的时间和距离都很有讲究哦。
照射时间太短，可能诱变效果不明显，微生物还是老样子。
照射时间太长呢，那微生物可能就被紫外线给“晒死”啦，就像人在太阳下晒太久会中暑一样。
距离也很重要，离得太近，紫外线强度太大，离得太远，强度又不够。
而且在照射的时候啊，最好能让菌悬液不断地晃动，这样能保证每个微生物都能比较均匀地接受紫外线的洗礼。
四、后培养。
经过紫外线照射后的微生物可都是“受过伤”的小宝贝啦。
这时候要把它们放到合适的培养基里进行后培养。
这个培养基就像是一个温馨的小窝，给它们提供营养，让它们慢慢恢复，并且在这个过程中表现出那些因为诱变而产生的新特性。
在这个阶段，咱们得密切观察微生物的生长情况，看看有没有出现一些特别的变化，比如说生长速度突然变快了，或者对某种物质的代谢能力变强了之类的。
细菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选鉴定实验报告⼯业微⽣物育种实验细菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选鉴定关于菌株的⼏个概念：野⽣型菌株：从⾃然界分离到的微⽣物在其发⽣突变前的原始状态。
营养缺陷型：野⽣型菌株经过⼈⼯诱变或⾃然突变失去合成某种营养的能⼒，只有在基本培养基中补充所缺乏的营养因⼦才能⽣长。
原养型：营养缺陷型菌株经回复突变或重组后产⽣的菌株，其营养要求在表型上和野⽣型相同关于培养基：基本培养基（minimal medium，MM）：仅能满⾜微⽣物野⽣型菌株⽣长需要的培养基，⽤[－]来表⽰。
完全培养基（complete medium，CM）：凡可满⾜⼀切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半组合培养基。
⽤[＋]来表⽰。
补充培养基（supplemental medium，SM）：凡只能满⾜相应的营养缺陷型⽣长需要的组全培养基，它是在基本培养基中加⼊该菌株不能合成的营养因⼦⽽组成。
摘要：本实验选⽤紫外线为诱变剂，来诱发⼤肠杆菌突变，并⽤青霉素法淘汰野⽣型，逐个测定法检出缺陷型，获得100#⼤肠杆菌菌株，最后经⽣长谱法鉴定出该菌株为脯氨酸缺陷型。
关键词：⼤肠杆菌紫外线营养缺陷型青霉素逐个测定法⽣长谱法⼀、实验⽬的1、了解营养缺陷型突变株选育的原理。
2、学习并掌握细菌氨基酸营养缺陷型的诱变、筛选与鉴定⽅法。
⼆、实验原理筛选营养缺陷型菌株⼀般具有四个环节：诱变处理、营养缺陷性的浓缩、检出、鉴定缺陷型。
本实验选⽤紫外线为诱变剂，来诱发突变，并⽤青霉素法淘汰野⽣型，逐个测定法检出缺陷型，最后经⽣长谱法鉴定细菌的营养缺陷型。
三、实验器材离⼼机，紫外线照射箱，冰箱，恒温箱，⾼压灭菌锅；三⾓烧瓶，试管，离⼼管，移液管，培养⽫，接种针四、实验材料(⼀)菌种E.coli(⼆)培养基、1LB培养液：酵母膏，0.5g；蛋⽩胨，1g；NaCl，0.5g；⽔，100ml，pH7.2 121℃灭菌15min22×LB培养液：其它不变，⽔，50ml。
实验十用梯度平板法筛选大肠杆菌抗药性突变株【实验目的】：了解并熟悉抗药性突变株的筛选原理和方法【实验原理】：经诱变处理后的微生物群体中，虽然突变的数目大大增加，但所占的比例仍然是整个群体中的极少数。
为了快速、准确地得到所需的突变体，必须设计一个合理的筛选方法，以杀死大量的未发生突变的野生型，而保留极少数的突变型。
梯度平板法是筛选抗药性突变型的一种有效简便方法，其操作要点是：先加入不含药物的培养基，立即吧培养皿斜放，待培养基凝固后形成一个斜面，再将培养皿平放，倒入含一定浓度药物的培养基，这样就形成一个药物浓度梯度由浓到稀的梯度培养基，然后再将大量的菌液涂布于平板表明上。
经培养后，在高浓度药物处出现的菌落就是抗药性突变型菌株。
【材料和器皿】：（1）菌种：大肠埃希氏菌（2）培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，2×（2倍浓度）牛肉膏蛋白胨培养液（分装于小三角瓶中，每瓶装20ml），生理盐水。
（3）器皿：培养皿，涂布棒，移液管，滴管，离心机【方法和步骤】：1 制备菌液从已活化的斜面菌种上挑一环大肠埃希氏菌于装有5ml牛肉膏蛋白胨培养液的无菌离心管中（接2支离心管），置37℃条件下培养16h左右，离心（3500r/min，10min），弃去上清液后再生理盐水洗涤2次，弃去上清液，重新悬浮于5ml的生理盐水中。
并且将2支离心管的菌液一并倒入装有玻璃珠的三角瓶中，充分振动以分散细胞，制成108/ml的菌液。
然后吸3ml菌液于装有磁力搅拌棒的培养皿中。
2 紫外线照射（1）预热紫外灯：紫外灯功率为15W，照射距离30cm。
照射前先开灯预热30min。
（2）照射：将培养皿放在磁力搅拌器上，先照射1min后再打开皿盖并计时，当照射达2Min 后，立即盖上皿盖，关闭紫外灯。
3 增殖培养（在暗室红灯下操作）照射完毕，用无菌滴管将全部菌液吸到含有3ml 2×牛肉膏蛋白胨培养液的小三角瓶中，混匀后用黑纸包裹严密，置37℃培养过夜。
紫外诱变技术及抗药性突变菌株的筛选
姓名：张鑫淼班级：生工1301
一．实验目的
以紫外线处理细菌细胞为例，学习微生物诱变育种的基本技术。
了解细菌抗药性突变株的筛选方法
二．实验材料
菌株：大肠杆菌（Escherichia coli）
培养基：营养肉汤（nutrient broth）固体和液体培养基
试剂：2mg/ml链霉素，（Str）母液，无菌生理盐水。
仪器：1ml的移液管17个，10ml移液管11个，无菌试管9个，无菌培养皿15个，无菌三角瓶7个（其中一个内有无菌的玻璃珠20~40粒），无菌漏斗（内有两层擦镜纸），无菌离心管1个，离心机，紫外诱变箱等
营养肉汤蛋白胨10g牛肉膏3g氯化钠5g蒸馏水1000mLpH 7.4
营养琼脂蛋白胨10g牛肉膏3g氯化钠5g琼脂15～20g蒸馏水1000mL
三．实验原理
以微生物的自然变易作为基础的筛选菌种的机率并不很高。
因为自发突变率小，一个基因的自发突变率仅为10-6~10-10左右。
为了加大突变频率，可采用物理或化学的因素进行诱发突变。
物理因素中目前使用得最方便且十分有效是UV，UV诱变一般采用15w 的紫外灭菌灯，其光谱比较集中在253.7nm处，这与DNA的吸收波长一致，可引起DNA 分子结构发生变化，特别是嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体，从而引起菌种的遗传特性发生变易。
在生产和科研中可利用此法获得突变株。
链霉素属氮基糖昔类抗生素，其杀菌机理是作用于核糖体小亚基，使其不能与大亚基结合组成有活性的核糖体，从而阻断细菌蛋白质的合成。
细菌对链霉素产生抗药性的作用机理一般是由于编码核糖体蛋白S12的rpsL基因或其他基因发生突变，导致相应的核糖体蛋白发生改变，是蛋白质合成不再受链霉素抑制。
四．实验内容与操作步骤
（一）出发菌株菌悬液的制备
1. 出发菌株移接新鲜斜面培养基，37℃培养16~24h；
2. 将活化后的菌株接种于液体培养基，37℃ 110rpm振荡培养过夜（约16h），第二天，以20~30%接种量转接新鲜的营养肉汤培养基，继续培养2~4h；
3. 取1ml培养液与1.5ml离心管中，10000rpm离心3~5min，弃去上清液，加1ml无菌生理盐水，重新悬浮菌体，再离心，弃去上清，重复上述步骤用生理盐水恢复成菌悬液；
4. 将上述菌悬液倒入装有小玻璃珠的无菌三角瓶内（预先加入9ml无菌生理盐水），振荡20~30min，以打散细胞；
5. 取诱变前的0.5ml 菌悬液进行适当稀释分离，取三个合适的稀释度倾注营养琼脂平板，每一梯度倾注两皿，每皿加1ml菌液，37℃倒置培养24~36h，进行平板菌落计数。
同时选取合适浓度的菌悬液0.1ml涂布营养琼脂+Str平板（Str终浓度8ug/ml），37℃倒置培养24~36h,进行诱变前抗药菌落计数。
（二）UV诱变
1. 将紫外灯打开，预热30min；
2. 取直径6cm的无菌培养皿（含转子），加入菌悬液5ml，控制细胞密度为107~108个/ml；
3. 将待处理的培养皿置于诱变箱内的磁力搅拌仪上，静止1分钟后开启磁力搅拌仪旋纽进行搅拌，然后打开皿盖，分别处理5s、10s、15s、30s、45s，照射完毕后先盖上皿盖，再关闭搅拌和紫外灯；
4. 取0.5ml处理后的菌液进行适当稀释分离，取三个合适的稀释度倾注营养琼脂平板进
行计数（避光培养）。
（三）链霉素抗性突变株的筛选、
1.取1ml诱变处理好的菌悬液接入20ml液体营养肉汤液体培养基进行后培养，37℃120rpm 摇瓶培养；
5. 对后培养以后的菌悬液进行适当稀释，分别取三个合适的稀释度个1ml，倾注营养琼脂平板，37℃倒置培养24~36h，进行平板菌落计数。
同时，选取合适浓度的菌悬液0.1ml,涂布营养琼脂+Str平板（Str终浓度8ug/ml），37℃倒置培养24~36h，进行诱变后抗药菌落计数，观察紫外诱变的效果。
五．实验结果及分析
1.对平板菌落进行计数，并计算死亡率
死亡率=（照射前活菌数/ml—照射后活菌数/ml）/（照射前活菌数/ml）
2.对诱变前后药物平板进行计数，计算大肠杆菌链霉素抗性的突变频度。
自发突变频度=（诱变前样品中Str抗性菌数）/（诱变前活菌数）
诱变突变频度=（后培养以后样品中Str抗性菌数）/（后培养以后样品中的抗性菌数）。
