WB详细操作步骤
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Western blot实验
检测蛋白表达，抗体很重要，用到的有一抗、二抗、内参抗体
WB步骤
1 蛋白样本处理：
(1)一部分采用完全变性的方法（加入β-巯基乙醇）：加入适量5×SDS-PAGE loading
buffer，100ºC沸水加热处理5min，使蛋白充分变性，12000 rpm离心5 min，取上清备用。
(2) 一部分采用非完全变性的方法（未加入β-巯基乙醇）：加入适量5×SDS-PAGE
loading buffer，100ºC沸水加热处理5min，使蛋白充分变性，12000 rpm离心5 min，取上清备用。
2 分离胶浓缩胶配方如下：
分离胶的浓度要根据蛋白的大小来决定，如下表所示：
SDS-PAGE分离胶浓度（%） 最佳分离范围（kD）
6 50-150
8 30-90
10 20-80
12 12-60
15 10-40
不同浓度的分离胶与5%浓缩胶，配方如下：
分离胶 5%浓缩胶
试剂 8% 10% 12% 15% 试剂 体积
去离子水（mL) 5.52 4.8 3.96 2.76 去离子水（mL) 4.0
30%丙烯酰胺（mL) 3.24 3.96 4.8 6.0 30%丙烯酰胺（mL) 1.0
1.5mol/lTris.cl(PH8.8)（mL) 3.0 3.0 3.0 3.0 1.0mol/lTris.cl(PH6.8)（mL) 1.0
10%SDS（mL) 0.12 0.12 0.12 0.12 10%SDS（ μL) 80.0
10%AP（mL) 0.12 0.12 0.12 0.12 10%AP（ μL) 60.0
TEMED（ μL) 7.2 4.8 4.8 4.8 TEMED（ μL) 8.0
总体积（mL) 12.0 12.0 12.0 12.0 总体积（mL) 6.0
3 制胶：加入分离胶溶液至2/3处，加水饱和正丁醇封胶，室温放置40 min后加浓缩胶至顶，插入梳子，静置10 min。
4 加样：预染蛋白marker 8l，样品每孔上样组织蛋白。
5 电泳：80V恒压使溴酚蓝至分离胶处，恒压100V，90 min，溴酚蓝到达较底部时，停止电泳。
6 转膜：SDS-PAGE电泳结束后，将PVDF膜在甲醇中浸泡10 s，蒸馏水中漂洗1
min，然后将聚丙烯酰胺凝胶、滤纸以及处理过的PVDF膜在Transfer Buffer中浸泡10 min，制备转膜“三明治”，夹子的黑色面在下，然后是海绵—滤纸—胶—PVDF膜—滤纸—海绵—夹子的透明面，将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。
7 漂洗：转膜后将PVDF膜水洗3次，10 min/次。
8 封闭：使用含5%脱脂奶粉的封闭液封闭转印膜1 h，然后TBST洗3次，10 min/次。
9 一抗孵育：用TBST稀释一抗，适当的比例，4℃孵育过夜。
10 漂洗：1×TBST漂洗3次，10 min/次。
11 二抗孵育：加入适当稀释的二抗，室温孵育1 h。
12 漂洗：1×TBST漂洗3次，10 min/次。
13 显色：将显色液A液和B液混合，加2 mL至膜上，用ChemiScope mini化学发光仪检测、拍照。
