WB操作步骤及经验

Western Blot 相关实验方法与试剂（湿转法）

人工肝实验室学习 姚瑶

（一） 目的蛋白提取：

（1）单层贴壁细胞总蛋白的提取：

1、倒掉细胞培养液，加入Hanks液洗涤一次后倒掉，根据所用细胞决定是否用胰酶消化，加入适量（约5ml）新鲜细胞培养液后，将贴壁细胞吹起，并转移至4支离心管内，配平后，1500转离心10min。

2、倒掉上清，用4度预冷PBS溶液洗涤沉淀，1500转离心10min。

共洗三次，每次十分钟。

3、倒掉上清，吸净，每管加入50ul 细胞裂解液RIPA，吹散，加入后由于DNA的释放可迅速变粘稠，故应尽快转移至1.5ml EP管内，-20℃裂解30min。

4、超声波细胞裂解仪上将各管裂解15s。（可不做）

5、4℃，12000转离心10min。

6、将上清转移至0.5ml EP管中，每管100ul，冰浴待用。

（2）组织中总蛋白的提取：

1、取约100mg肝组织于研磨器内，加入500ul 细胞裂解液RIPA，研磨后吸出于1.5ml EP管内，再加入500ul RIPA，研磨后吸出于上EP管内。冰上裂解30min。 2、配平后，4℃，14000转离心10min。

3、将上清分装于0.5ml EP管内，每管100ul，冰浴待用

（二）蛋白含量的测定：

1、稀释标准品：10ul标准品C液+90ul PBS溶液，混匀。

2、按0、1、2、4、8、12、16、20ul将稀释后的标准品加入于96孔板内，并用PBS将各孔补足20ul。

3、将第2、3排96孔板分别加入样品1ul、0.5ul，（可采用倍比稀释法），并用PBS将各孔补足20ul。

4、配制工作液：按A液：B液=50：1配制适量工作液，每孔加入200ul。

免疫印迹（WB）实验操作具体步骤及详细说明

一、试剂和溶液

转印缓冲液：0.025M Tris base , 0.187 M 甘氨酸 , 25%甲醇 氨基黑溶液：0.1%

酸性黑 10B 1×TBST：25mM Tris-HCl ( pH 8.0 ) , 0.2 M NaCl , 0.1%Tween 20 封闭液：TBST 配制的 5%牛奶 抗体稀释液：TBST 配制的 5%牛奶 显色系统：ECL 显色

二、实验步骤

1. 电泳：将裂解液进行 SDS-PAGE 电泳，80v，30 分钟，120v，90 分钟；

2. 转膜：PVDF 膜在甲醇中浸泡约 30 秒左右，滤纸浸泡在转印缓冲液预湿，半干法转印到 PVDF 膜上， 10v，150 分钟；

3. 染色：氨基黑染色 5 分钟，甲醇褪去背景色，观察条带；

4. 膜活化：将 PVDF 膜置于甲醇活化 1min，用纯水洗膜 2 次后再用 TBST 洗涤 3 次；

5. 封闭：将膜条置于 5%牛奶或 2% BSA 中，室温混摇 2h；

6. 一抗孵育：将待检抗体用 3%牛奶或 2% BSA 稀释到合适浓度（参照抗体说明书，根据客户预实验结 果，稀释度上下浮动一个数量级都为正常），将膜放入对应的已稀释待检样品中，置 4℃混摇孵育过 夜；

7. 洗涤：取出膜放在 TBST 中洗涤 3×5min；

8. 二抗孵育：将膜取出放入稀释好的 HRP 标记的二抗（参照二抗说明书进行稀释）中，室温混摇 2h；

9. 洗涤：取出膜放在 TBST 中洗涤 3×5min；

10. ECL 显色：将膜取出放入混匀的 ECL 显色液中，孵育 3min，将膜取出贴在有荧光角标的胶片上，迅 速用保鲜膜包好；

11. 曝光：把底片放在暗盒中，根据荧光强度分别对 X 光胶片作不同时间段的曝光，曝光结束后，将底片 取出，1min 显影，30s 清洗，1min 定影，30s 清洗，晾干；

RNA提取的操作步骤

准备试剂：氯仿，异丙醇，75℅乙醇，无RNase的水或0.5℅SDS(溶液均需用DEPC处理过的水配制)

操作步骤:

1. 匀浆处理:a.组织 将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。

b.单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml，用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。

c．细胞悬液 离心收集细胞，每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol，反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。

2．将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。

3．可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃10000×g离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。

6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。

7. 把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。

8. 2-8℃10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

Western Blotting试验步骤

一， 组织蛋白提取

1. 准备组织细胞裂解液：1000ul RIPA+10ul PMSF, 装于1.5mlEP管中，充分混合。

注：如发现RIPA有沉淀，放室温半小时或常温水域使其溶解，若PMSF为粉剂，将其配置成100 mM液体备用。

2. 组织准备：将组织从-80℃冰箱取出，放入1.5mlEP管，用小剪刀将组织建成碎片，用研磨杵研磨/玻璃匀浆器5ml匀浆充分。加RIPA裂解液（按每20mg组织加裂解液150-200微升的量添加），研磨/匀浆5分钟（在冰浴下研磨/匀浆），冰上静止30分钟。

注：1）若用玻璃匀浆器可先加3/2的裂解液，匀充分，倒到EP管，再加剩下的裂解液，把匀浆器壁上的匀浆液充分倒出来。

3. 将裂解后的样品10000-14000g离心3-5分钟，取上清，分装至200ulEP管（一般有约400ul的上清？）即可进行PAGE、Western和免疫印迹等操作。

二， 提取液中总蛋白的测定

用BCA法测定，试剂盒：索莱宝BCA蛋白浓度测定试剂盒。

1. 配工作液：根据标准品和样品数量，按50体积BCA试剂加1体积Cu试剂（50:1）配制成BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内温度。

注：BCA工作液每个孔要加入200ul，标准曲线8个孔，

2. 稀释标准品（BSA）：取10微升BSA标准品用PBS稀释至100微升（样品一般可用PBS稀释），使终浓度为0.5mg/ml。将标准品按0,2,4,6,8,12,16,20微升加到96孔板的蛋白标准品孔中，加PBS补足至20ul。

3. 稀释样品：最好多做几个梯度，如做2倍，4倍，8倍稀释），加稀释好的样品20微升到96孔板的样品孔中。由于移液器在取小量时的误差，标准线前面的点可能不很准确，所以尽可能让样品点落在标准线1/2以后。

4. 在各孔中加入200微升的BCA工作液，37℃放置15-30分钟。用酶标仪测定A562nm， 根据标准曲线计算出蛋白浓度。使用温箱孵育时，应注意防止因水分蒸发影响检测结果。