饲料粗蛋白的检测方法（凯氏半微量定氮法）
1 原理
凯氏法测定试样含氮量，即在催化剂存在下，用浓硫酸破坏有机物，使含氮物转化成硫酸铵，加入强碱（NaOH）并蒸馏使氨逸出，用硼酸吸收后，用标准盐酸溶液滴定测出含氮量，将结果乘以换算系数6.25，计算出粗蛋白质含量。
2 仪器设备
2.1实验室用样品粉碎机或研钵
2.2分样筛：孔径0.45mm（40目）
2.3分析天平：感量0.0001g
2.4消煮炉或电炉
2.5滴定管：酸式25mL
2.6凯氏烧瓶：100mL
2.7凯氏蒸馏装置：半微量水蒸汽蒸馏式
2.8锥形瓶：150mL
2.9容量瓶：100mL
3 试剂
3.1硫酸：分析纯
3.2硫酸铜：分析纯
3.3硫酸鉀：分析纯
3.4硒粉：分析纯
3.5氢氧化钠：分析纯40g溶于100mL蒸馏水配成40%水溶液。
3.6硼酸：分析纯2g溶于100mL蒸馏水配成2%水溶液。
3.7混合指示剂：甲基红分析纯0.1%乙醇溶液，溴甲酚绿分析纯0.5%乙醇溶液，两溶液等体积混合，阴凉处保存期三个月以内。
3.8 0.02N盐酸标准溶液：1.67mL盐酸分析纯溶于1000mL 蒸馏水中。
3.8.1 0.02N盐酸标准溶液的标定（碳酸钠法）
精确称取0.04g于270—300°C灼烧至恒重的基准级无水碳酸钠，准确至
蒸馏水(新做蒸馏水或蒸0.0001g，无损失地转入100 mL三角瓶中，加入无CO
2
馏水煮沸数分钟放凉后使用)50mL溶解，并加入混合指示剂10滴，用盐酸标准
溶液滴定至溶液由绿色变为暗红色，煮沸2分钟，冷却后继续滴定至溶液呈暗红色，同时做空白试验。
3.8.2盐酸标准溶液当量浓度的计算
G
N =
(V
1-V
2
)×0.05299
式中：G——无水碳酸钠的重量，g；
V
1
——盐酸标准溶液消耗的体积，mL；
V
2
——空白试验所消耗盐酸标准溶液的体积，mL；
0．05299——每毫克当量碳酸钠的克数；
注：标定各浓度间的相对偏差不大于0.2%。
3.9蔗糖：分析纯
3.10硫酸铵：分析纯，干燥。
4 试样的选取与制备
选取具有代表性的试样用四分法缩减至200g，粉碎后全部通过40目筛，装于密封容器中，防止试样成分变化。
5 测定方法及步骤
5.1试样的消煮
称取0.5—1g试样（粗蛋白含量在25%以下称取1g，粗蛋白含量在25%以上称取0.5g），准确至0.0002g，放入凯氏烧瓶中，加入硫酸铜0.4g，无水硫酸钾6g，硒粉0.004g，与试样混合，再加浓硫酸12.5mL，在消煮炉上小心加热，待样品焦化，泡沫消失，加强火力，至溶液澄清后，再加热至少1h。
5.2氨的蒸馏（半微量水蒸汽蒸馏法）
将上述消煮液冷却，无损失地转入100 mL容量瓶中，冷却后定容为试样分解液，取20 mL 2%硼酸溶液，加混合指示剂2滴，使半微量蒸馏装置的末端浸入此溶液，准确移取试样分解液10 mL注入反应室中，塞好入口玻璃塞，再加入10mL 40%NaoH溶液，小心提起玻璃塞使之流入反应室（加碱时流速不可过快，否则会引起硼酸吸收液倒流），塞好玻璃塞，并在入口处加水密封好，防止漏气，蒸馏，自吸收液变为蓝色开始计时，4分钟后，使冷凝管末端离开吸收液面，再
蒸馏1分钟，用蒸馏水洗净冷凝管末端，洗液均流入吸收液。
5.3滴定
吸收氨后的吸收液立即用0.02mol/L的标准溶液滴定，溶液由蓝色变成灰红色为终点，记录所耗标准溶液的体积。
5.4空白测定
称取蔗糖0.5g代替试样，重复上述操做，以校正药品不纯所发生的误差，消耗0.02mol/LHCL应不超过0.3mL。
6 测定结果的计算与分析
6.1计算公式如下：
）×(N×0.014×6.25) ×100
（V-V
粗蛋白（%）=
W×V/V′
式中：V-----滴定试样时所需酸标准溶液体积，mL；
------滴定空白时所需酸标准溶液体积，mL；
V
N-------盐酸标准溶液当量浓度；
W------试样重量，g；
V-------试样分解液总体积，mL；
V′------试样分解液蒸馏用体积，mL；
0.0140------氮的毫克当量数；
6.25-----氮换算成蛋白质的平均系数。
6.2重复性
每个试样取两个平行样，以其算数平均值为结果；
粗蛋白含量在25%以上，允许相对偏差为1%；粗蛋白含量在10-25%之间，允许相对偏差为2%；粗蛋白含量在10%以下，允许相对偏差为3%；
7 测定步骤的检验
精确称取0.2g硫酸铵，代替试样，按上述步骤操作，按上述公式计算（不乘系数6.25），测得硫酸铵含氮量为21.19±0.2%，否则应检查加碱，蒸馏和滴定各步骤是否正确。
8 注意事项
8.1试样消煮时，先低温加热，避免泡沫溢出，待泡沫消失后，再逐渐增加温度，使之微沸，避免剧烈沸腾，否则会使氮分子损失。
8.2 加碱必须过量，碱除了与铵盐和剩余的硫酸作用，还与硫酸铜作用生成蓝色氢氧化铜，然后分解为黑色氧化铜。
8.3消化过程中，若硫酸损失过多，可酌量补加硫酸，勿使瓶内干涸。
