红曲霉发酵制备洛伐他丁

红曲霉洛伐他汀的液态发酵及其分离纯化研究陈景智;王力超;李亮;叶秀云;林娟【摘要】通过培养基和发酵条件的优化提高红曲霉R”-30的洛伐他汀产量,并通过分离纯化制备高纯度的洛伐他汀.研究碳源、氮源、金属离子、培养基初始pH 值、接种菌龄、接种量、装液量、摇床转速以及温度等对洛伐他汀产量的影响;进一步采用硅胶柱和Sephadex LH20柱层析对发酵液中洛伐他汀进行分离纯化.结果表明,最佳培养基配方为:甘油30 g/L,黄豆粉15 g/L,ZnSO4·7H2O 6.6g/L,KH2PO4 0.17 g/L,MgSO4·7H2O 1.5 g/L;最适发酵条件为:培养基初始pH 5.0,接种龄64 h,接种量8％(体积分数),温度30℃,转速150 r/min,装液量50mL/250 mL;在此条件下发酵12d,洛伐他汀产量达615.3 mg/L,比优化前(312 mg/L)提高了97.2％;发酵液经NaOH碱提,柱层析分离纯化后,洛伐他汀纯度达93％,得率达45％.【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2019(045)002【总页数】8页(P31-38)【关键词】红曲霉;洛伐他汀;培养基;发酵条件;分离纯化【作者】陈景智;王力超;李亮;叶秀云;林娟【作者单位】福州大学,福建省海洋酶工程重点实验室,福建福州,350116;福州大学,福建省海洋酶工程重点实验室,福建福州,350116;福州大学,福建省海洋酶工程重点实验室,福建福州,350116;福州大学,福建省海洋酶工程重点实验室,福建福州,350116;福州大学,福建省海洋酶工程重点实验室,福建福州,350116【正文语种】中文红曲，在我国已有1000多年历史，是古代食疗两用的中药材[1]，红曲中含有多种功能性成分，如红曲色素、氨基丁酸、洛伐他汀、麦角甾醇等[2]，还含有淀粉酶、蛋白酶、果胶酶、酯化酶等多种酶类物质[3-5]，具有很好的研究意义。

第23卷第4期2008年12月安　徽　工　程　科　技　学　院　学　报Journal of Anhui University of Technology and Science Vol.23.No.4Dec.,2008收稿日期:2008-08-26　作者简介:危勤涛(1983—),男,湖北仙桃人,硕士研究生.通讯作者:张庆庆(1954—),女,安徽怀宁人,副教授,硕导.文章编号:1672-2477(2008)04-0040-04红曲霉液态发酵产洛伐他汀条件的研究危勤涛,张庆庆3,刘　辉,黄　鹏(安徽工程科技学院微生物发酵安徽省工程技术研究中心,安徽芜湖　241000)摘要:对红曲霉GM026产洛伐他汀的液态发酵培养基成分和发酵条件进行了研究,结果表明,最佳培养基组成:甘油9%,大豆粉0.75%,NaNO 30.2%,MgSO 4・7H 2O 0.05%,KH 2PO 40.15%;最佳发酵条件:培养温度26℃,初始p H =5.0,接种量7%,250mL 三角瓶装液量为50mL ,摇床转速170rad/min 。

在上述条件下,发酵培养14d ,洛伐他汀产量达到375.853mg/L.关　键　词:红曲霉;洛伐他汀;液态发酵中图分类号:Q815 文献标识码:A洛伐他汀是胆固醇合成限制酶———3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A 还原酶的抑制剂,是目前世界上销售额最大的治疗心血管疾病的药物之一.1979年,日本远腾章教授[1,2]等从红色红曲霉(M onascus ru 2ber )培养物中发现.目前,能产洛伐他汀或者其类似物的微生物已见报道[3],如曲霉菌(A s pergill us )、红曲霉菌(M onascus )、诺卡菌(N ocardi a )、拟无枝菌酸菌(A m ycol atopsis )、毛霉菌(M ucor )和青霉菌(Penicil 2li um ).目前,我国多采用红曲霉固态发酵生产洛伐他汀,涉及洛伐他汀液态发酵的报道相对较少,这主要是由于液态发酵的产量比固态发酵要低数倍[4].与传统的固态发酵法相比,液态发酵法具有规模大,自动化程度高,人力成本低,生产过程易控制等显著优点[5].本研究利用红曲霉GM026进行液态发酵,对其产洛伐他汀的发酵培养基和发酵工艺条件进行探讨.1　材料和方法1.1　菌种红曲霉GM026.1.2　培养基斜面培养基:马铃薯蔗糖琼脂培养基;种子培养基:米粉3%,葡萄糖2%,蛋白胨1.5%,NaNO 30.2%,MgSO 4・7H 2O 0.05%,KH 2PO 40.15%,p H 自然;液体基本发酵培养基:米粉7%,蛋白胨1.5%,NaNO 30.2%,MgSO 4・7H 2O 0.05%,KH 2PO 40.15%,p H 自然.1.3　培养方法斜面培养:26℃斜面培养7d ,平板培养5d.液体种子制备:用500mL 三角瓶装液量100mL ,26℃,150rad/min 恒温培养48h.液体发酵培养:用250mL 三角瓶装液量50mL ,接种量7%,26℃,170rad/min 恒温培养14d.1.4　发酵液中洛伐他汀含量的测定采用毛细管区带电泳法(CZE )[6],熔融石英毛细管柱50μm ×60cm (有效长度50cm ),缓冲体系为60mmol/L 甘氨酸含16%乙醇(p H =10.5),进样压力0.5p si ,进样时间5s ,分离电压16kV ,柱温22℃.2　结果与分析2.1　碳源对洛伐他汀产量的影响本试验首先考察碳源物质对红曲霉GM026产洛伐他汀的影响.以蛋白胨1.5%,NaNO 30.2%,MgSO 4・7H 2O 0.05%,KH 2PO 40.15%为基本培养基,选择葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、甘油、可溶性淀粉、大米粉等7种碳源进行试验,碳源质量分数为3%.经液态摇瓶发酵培养14d 后,结果如表1所示.表1　不同碳源对洛伐他汀产量的影响碳源洛伐他汀产量/(mg ・L -1)碳源洛伐他汀产量/(mg ・L -1)葡萄糖27.211甘油59.473蔗糖10.352可溶性淀粉35.047麦芽糖7.234大米粉41.182乳糖12.035由表1可以看出,以甘油为碳源时,洛伐他汀的产量高于采用其他碳源时的产量,这说明甘油不仅促进微生物菌体的生长,也促进次级代谢产物洛伐他汀的形成,因此确定甘油为最佳碳源.2.2　碳量对洛伐他汀产量的影响本试验考察碳量对红曲霉GM026产洛伐他汀的影响.分别选取3%、6%、9%、12%、15%甘油5个质量分数水平,经液态三角瓶摇瓶发酵培养14d 后,结果如表2所示.表2　碳量对洛伐他汀产量的影响甘油质量分数/%洛伐他汀产量/(mg ・L -1)甘油质量分数/%洛伐他汀产量/(mg ・L -1)357.25712100.869675.4041599.142995.256由表2可以看出,甘油质量分数为9%和12%时,洛伐他汀产量相差不大,综合考虑洛伐他汀产量和原料利用率,选择碳量为9%.2.3　氮源对洛伐他汀产量的影响本试验考察氮源物质对红曲霉GM026产洛伐他汀的影响.以甘油9%,NaNO 30.2%,MgSO 4・7H 2O 0.05%,KH 2PO 40.15%为基本培养基,选取硝酸钠、氯化铵、硫酸铵、谷氨酸钠、硝酸铵、大豆粉、蛋白胨、酵母膏等8种氮源进行试验,氮源质量分数为1.5%.经液态三角瓶摇瓶发酵培养14d 后,结果如表3所示.表3　氮源对洛伐他汀产量的影响氮源洛伐他汀产量/(mg ・L -1)氮源洛伐他汀产量/(mg ・L -1)硝酸钠96.980硝酸钠67.811氯化铵37.125大豆粉187.087硫酸铵72.008蛋白胨158.884谷氨酸钠54.794酵母膏129.403由表3可以看出,添加无机氮源的产量明显比添加有机氮源的产量低,特别是添加氯化铵的产量在8种氮源中最低.有机氮源中以添加大豆粉的产量最高,它除了作为菌体生长繁殖的营养外,可能还存在着目的产物所需要的调节物、前体物质等.因此确定大豆粉为最佳氮源.2.4　碳氮比对洛伐他汀产量的影响除了碳、氮源利用之间又密切关系外,碳源与氮源之间的比例也能够直接影响微生物的生长和发酵产物的积累.本试验考察碳氮比对产洛伐他汀的影响.以9%甘油为碳源,大豆粉为氮源,配成不同碳氮比(6/1、9/1、12/1、15/1、18/1、21/1)的培养基,经液态三角瓶摇瓶发酵培养14d 后,结果如表4所示.由表4可以看出,碳氮比为12∶1时,洛伐他汀产量最高,因此确定最佳碳氮比为12∶1.表4　碳氮比对洛伐他汀产量的影响碳氮比洛伐他汀产量/(mg ・L -1)碳氮比洛伐他汀产量/(mg ・L -1)6∶1184.24015∶1204.4239∶1199.69518∶1193.79812∶1228.33121∶1169.2042.5　培养基初始p H 对洛伐他汀产量的影响p H 是影响微生物发酵的一个重要因素,本试验对培养基初始p H 值进行优化.配制如下培养基:甘油・14・第4期危勤涛,等:红曲霉液态发酵产洛伐他汀条件的研究9%,大豆粉0.75%,NaNO 30.2%,MgSO 4・7H 2O 0.05%,KH 2PO 40.15%.用1mol/L 的HCl 和1mol/L 的NaO H 调节培养基初始p H 分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0左右,经液态三角瓶摇瓶发酵培养14d 后,结果如表5所示.由表5可以看出,在偏酸性条件下,洛伐他汀的产量最高.在酸性条件和碱性条件下,产量均偏低.因此,确定培养基的初始p H 为5.0.表5　培养基初始p H 对洛伐他汀产量的影响p H 洛伐他汀产量/(mg ・L -1)p H 洛伐他汀产量/(mg ・L -1)4.0205.3146.0230.1954.5222.5867.0168.5905.0248.7018.0133.0995.5243.4092.6　接种量的对洛伐他汀产量的影响将种子液分别按照体积分数为3%、5%、7%、9%、11%的接种量接入装有发酵培养基的250mL 三角瓶中,摇瓶发酵培养14d ,结果如表6所示.表6　接种量对洛伐他汀产量的影响接种量/%洛伐他汀产量/(mg ・L -1)接种量/%洛伐他汀产量/(mg ・L -1)3189.2459271.0155239.60811245.3877286.290由表6可以看出,接种量为7%时,洛伐他汀产量最高,因此确定最佳接种量为7%.2.7　装液量对洛伐他汀产量的影响250mL 三角瓶分别装入不同量(30mL 、40mL 、50mL 、60mL 、70mL )的发酵培养基,摇瓶发酵培养14d ,结果如表7所示.表7　装液量对洛伐他汀产量的影响装液量/(mL ・250mL -1)洛伐他汀产量/(mg ・L -1)装液量/(mL ・250mL -1)洛伐他汀产量/(mg ・L -1)30289.34660253.18440294.70970212.36750314.098由表7可以看出,装液量为50mL 时,洛伐他汀产量达到最大,因此确定250mL 三角瓶中最佳装液量为50mL.2.8　摇床转速对洛伐他汀产量的影响250mL 三角瓶,装液量为50mL ,置于旋转式摇床上,以不同转速(110rad/min 、130rad/min 、150rad/min 、170rad/min 、190rad/min )30℃摇瓶发酵培养14d ,结果如表8所示.表8　摇床转速对洛伐他汀产量的影响摇床转速/(rad ・min -1)洛伐他汀产量/(mg ・L -1)摇床转速/(rad ・min -1)洛伐他汀产量/(mg ・L -1)110202.712170341.468130294.639190327.329150312.04由表8可以看出,在摇床转速为170rad/min 时,洛伐他汀产量最高,因此确定最佳摇床转速为170rad/min.2.9　培养温度对洛伐他汀产量的影响本试验考察温度对洛伐他汀产量的影响,以寻找最佳温度保证顺利地进行目的产物的生产.将发酵培养基分别置于不同温度(24℃、26℃、28℃、30℃、32℃)的培养箱中经液态三角瓶摇瓶发酵培养14d 后,结果如表9所示.由表9可以看出,培养温度对GM026产洛伐他汀十分敏感,在26℃时最为合适,因此确定最佳温度为26℃.・24・安　徽　工　程　科　技　学　院　学　报2008年表9　培养温度对洛伐他汀产量的影响温度/℃洛伐他汀产量/(mg ・L -1)温度/℃洛伐他汀产量/(mg ・L -1)24364.47530244.76326375.85332196.02328353.3673　讨 论通过对红曲霉GM026产洛伐他汀的发酵培养基和发酵条件的探索,得到最佳发酵条件为:甘油9%,大豆粉0.75%,NaNO 30.2%,MgSO 4・7H 2O 0.05%,KH 2PO 40.15%,p H =5.0,培养温度26℃,初始p H =5.0,接种量7%,装液量为50mL/250mL 三角瓶,摇床转速170rad/min.在优化过后的发酵条件下,发酵培养14d 后洛伐他汀产量达到375.853mg/L.在工业上,考虑到甘油的成本问题,必须研究甘油促进红曲霉产洛伐他汀的机理,寻找其他物质替代甘油或者采用复合碳源来进行洛伐他汀生产.参考文献:[1]　Endo A ,Monacolin K.A new hypocholesterolemic agent produced by a Monascus spe 2cies [J ].Antibiotics ,1979,32(8):8522854.[2]　Endo A ,Monacolin K.A new hypocholesterolemic agent that specifically inhibits 3-hydroxy -3-methyglutaryl co 2enzyme a reductase[J ].Antibiotics ,1980,33(3):3342336.[3]　PflaumZlatko ,Milivojevic Dusan ,SenicaDavid.Process of the obtaining of HM G 2Co A reductase inhibitors of high pu 2rity US :6695906[P].United States Patent .2002204214.[4]　贾波.红曲霉深层发酵生产Monacolin K 的研究[D ].杭州:浙江工业大学,2003.[5]　陈晔,朱华,许赣荣.红曲霉9901液态发酵产莫纳可林K 的发酵条件[J ].食品与发酵工业,2004,30(1):57261.[6]　Min L ,Liu 2Y in F ,Wei Z ,et al.Quantitative analysis of lovastatin in capsule of Chinese medicine Monascus by capillaryzone electrophoresis with UV 2vis detector[J ].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis ,2007,43:3872392.Conditions for submerged fermentationin lovastatin production by monascusWEI Qin 2tao ,ZHAN G Qing 2qing ,L IU Hui ,HUAN G Peng(Dept.of Bioch.Engn.,Anhui Provincial Engineering Technology Research Center of Microbial Fermentation ,Anhui University of Technology and Science ,Wuhu 241000,China )Abstract :The medium compositions for submerged fermentation and t he fermenting conditions of monas 2cus producing lovastatin were st udied.The result s indicated t hat t he best medium compositions were as fellows :glycerol 9%,soybean powder 0.75%,NaNO 30.2%,MgSO 4・7H 2O 0.05%,KH 2PO 40.15%.And t he optimal fermenting conditions were as fellows :t he temperat ure was 26℃,t he initial p H was 5.0,t he inoculum ′s size was 7%,t he installing liquid volume was 50mL of medium in 250mL t riangle bottle ,t he shaking speed was 170rad/min.After 14d of incubation ,t he yield of lovastatin ar 2rived at 375.853mg/L under t he optimized condition and medium.Key words :monascus;lovastatin ;submerged fermentation・34・第4期危勤涛,等:红曲霉液态发酵产洛伐他汀条件的研究。

红曲霉固态发酵生产洛伐他汀工艺条件研究李晶;马贵民;冯晓明;陈淑范;张玲;胡瑞君;郭敏【摘要】通过对洛伐他汀生产菌红曲霉M7固态发酵工艺条件的研究，确定了固态发酵的最佳工艺条件为：发酵温度26～28℃，发酵时间18～20d，发酵基质初始含水量50%，发酵基质初始pH值自然。

%The fermentation conditions for Lovastatin production by Monascus M7 in solid fermentation were studied.The best solid fermentation conditions weredetermined:fermentation temperature,26~28℃;fermenta-tiontime,18~20d;medium water content,50%;natrual initial pH.【期刊名称】《安徽农学通报》【年(卷),期】2014(000)017【总页数】2页(P29-30)【关键词】红曲霉;洛伐他汀;固态发酵【作者】李晶;马贵民;冯晓明;陈淑范;张玲;胡瑞君;郭敏【作者单位】黑龙江生物科技职业学院食品生物系，黑龙江哈尔滨 150025;黑龙江生物科技职业学院食品生物系，黑龙江哈尔滨 150025;黑龙江生物科技职业学院食品生物系，黑龙江哈尔滨 150025;黑龙江生物科技职业学院食品生物系，黑龙江哈尔滨 150025;黑龙江生物科技职业学院食品生物系，黑龙江哈尔滨 150025;黑龙江生物科技职业学院食品生物系，黑龙江哈尔滨 150025;天津科技大学，天津 300222【正文语种】中文【中图分类】TS201.3洛伐他汀是红曲霉培养物中具有生理活性功能的产物之一，由于其是胆固醇合成限制酶3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的抑制剂，可以抑制生物体内胆固醇的合成［1-2］，所以近年来洛伐他汀类药物的开发一直是人们研究功能性红曲的热点。

通过对洛伐他汀生产菌红曲霉M7固态发酵工艺条件的研究，确定了固态发酵的最佳工艺条件为：发酵温度26～28℃，发酵时间18～20d，发酵基质初始含水量50%，发酵基质初始pH值自然摘要：红曲是一种可降低低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）胆固醇水平的草药补充剂。

为了评价红曲及治疗性生活方式改变治疗不能耐受他汀类药物治疗的患者的血脂异常的有效性和耐受性，美国宾夕法尼亚大学医学院栗山医院的Becker等进行了一项随机对照试验。

通过对红曲霉固态发酵生产洛伐他汀发酵过程的观察，对发酵过程中菌体生长、洛伐他汀的积累、物料含水量及重量等性质的变化有了初步的认识，得出了发酵周期为１２ｄ，影响固态发酵的两个关键参数的最适值：物料厚度为４．５ｃｍ，初始含水量５０％。

发现固态发酵较液体发酵有明显优势，在我们的实验条件下固态发酵洛伐他汀的产率为液体发酵的２０倍以上。

选择乙醇为浸取洛伐他汀的初始溶剂，并确定了其最适浓度为７０％。

云南普洱茶的独特品质和悠久历史,是我国茶文化的重要组成部分.普洱茶是以云南普洱地区所产的云南大叶种茶晒青毛茶为原料,经过后发酵(或人工后发酵)形成的符合普洱茶云南省地方标准的散茶和紧压茶的总称.普洱茶的降血脂功效近年来越来越受到各界人士的关注.红曲霉次级代谢产物洛伐他汀能够特异性抑制合成胆固醇的限速酶(HMG-CoA还原酶),因此具有降血糖、降血脂等功效。

本文从高产洛伐他汀的红曲霉菌株筛选出发,获得一株生产洛伐他汀能力较高的菌株H8红曲霉。

通过HPLC-MS 法对发酵液中的洛伐他汀进行结构鉴定,确定为开环酸型洛伐他汀。

通过碱水解方法成功将洛伐他汀内酯型标准品水解转化为开环酸形式,开环收率可达91.6％。

建立H8红曲霉摇瓶发酵洛伐他汀动力学模型,采用Logistic方程描述菌体生长的动力学过程,Leudeking-Piret方程描述了产物合成的动力学过程,Leudeking-Piret-Like方程描述了底... 展开红曲霉次级代谢产物洛伐他汀能够特异性抑制合成胆固醇的限速酶(HMG-CoA还原酶),因此具有降血糖、降血脂等功效。

HPLC法测定红曲霉发酵液中洛伐他汀含量【摘要】目的建立测定红曲霉发酵液中洛伐他汀含量的方法。

方法采用HPLC法，以甲醇作溶剂、摇床振荡（150 r/min）3 h提取洛伐他汀，色谱条件：以甲醇18 mmol/L磷酸溶液（体积比为80∶20）为流动相，流速为1.0 mL/min，检测波长为237 nm。

结果洛伐他汀在5～50 μg/ mL质量浓度范围内与峰面积线性关系良好，加样平均回收率为100.75%，RSD为0.87%。

结论本方法简便有效，重复性好，可作为红曲霉相关产品的质量控制方法。

【关键词】高效液相色谱法；红曲霉；洛伐他汀Abstract:Objective To establish an HPLC method for determining the content of lovastatin in fermentation broth of Monascus. Method Lovastatin could be completely extracted from the fermentation broth by methanol under shaking for 3 h with 150 r/min. Then, samples were analyzed on the HPLC column using methanol18 mmol/L phasphate(80∶20) as mobile phase under the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was 237 nm. Result The method had good linearity over the concentration of 5～50 μg/mL for lovastatin. The average recovery was 100.75% and RSD 0.87%.Conclusion The method is convenient, effective and accurate, which is suitable for the quality control of Monascus products.Key words:HPLC; Monascus; lovastatin红曲霉的应用在我国已有近两千年的历史，红曲霉的早期研究主要集中在其所产的红曲色素和各种酶类，如淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、果胶酶等，因此早期红曲霉主要用于食品着色、酿酒、食品发酵等［1,2］。

红曲霉发酵生产Monacolin K的工程技术研究进展摘要：红曲的药用价值和保健功效日益引人关注，其中洛伐他汀作为红曲主要的调脂因子成为科研热点和红曲产业发展的重点。

概述红曲洛伐他汀的发现、用途、生产方法、提纯、检测方法、毒性物质问题以及生产现状进行综述。

关键词:红曲霉、洛伐他汀、检测、提取、桔霉素1.前言1.1 Monacolin K的发现及结构式Monacolin K是目前较好的降低人体血液中胆固醇的药剂,具有降胆醇、降血脂的作用,又叫洛伐他汀(lovastatin) ,存在于红曲霉及其它真菌如Pleurotus，Phoma，penicillium中。

生产所使用的菌种主要有两类:红曲霉和土曲霉,东方国家如日本及我国多采用红曲霉,欧美等国的研究多采用土曲霉川,最近几年,美国也开始意识到中国食品红曲中的药用价值。

其结构式为：分子式为C24H36O5,Mr为404。

1979年,日本学者远藤章首先从红色红曲霉菌Monascus ruber中发现某些能产生强力抑制胆固醇合成的活性物质,命名为Monacolin K, Monacolin K 类物质不仅可以降低胆固醇,而且对重症胆固醇血症患者也极为有效,特别是对导致动脉硬化最严重的低密度蛋白胆固醇有优先降低的作用,其中以Monacolin K抑制HMG一COA还原酶的活性最高川。

1980年,美国Albert等从土曲霉中发现了与Monacolin K相同的物质侧,命名为mevinolin,现称作洛伐他汀(Lovastatin)。

但是采用土曲霉发酵,菌株的安全性对下游工程的技术要求较高,因此提取收率较低。

由药用红曲霉制成的制剂具有较强的降血脂能力,副作用较低于Lovastatin制剂。

近些年来,我国开展了红曲霉降血脂生理活性物质的研究。

1.2 Monacolin K的基本性状见表1。

1.3Monacolin K抑制胆固醇合成的作用机理生物化学的研究表明,胆固醇合成的关键步骤是甲经戊酸的合成(见结构式)。