红曲霉固体发酵豆粕及其产物分析
刘安军，尚校兰，朱振元，满金浩
（天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457）
摘要：以豆粕为原料，利用红曲霉菌株（Monascus purpureus）进行固态发酵，豆粕与水的质量比为1:1时得到的发酵产物的质量较高。
并测定了发酵前后的产物色价、蛋白质类型、蛋白质含量、多肽含量及发酵产物中Monacolin K的含量，结果表明红曲霉固体发酵所得豆粕的色价不高；蒸汽加热会使豆粕中的蛋白质变性，溶解度显著降低，红曲霉发酵豆粕的过程使可溶性蛋白质含量增加，且使大分子蛋白质变成小分子肽类，从而提高了蛋白质的功能特性；发酵产物存在莫纳可林K，但含量不高。
用红曲霉固体发酵豆粕生产红曲霉色素或莫纳可林K不可取。
关键词：豆粕；红曲霉；发酵；大豆多肽；莫纳可林K
中图分类号：TQ920；文献标识码：A；文章篇号:1673-9078(2009)01-0149-03
Analysis of the Solid-State Fermented Soybean meal by Monascus
LIU An-Jun, SHANG Xiao-Lan, ZHU Zhen-Yuan, MAN Jin-Hao
（College of Food Science and Biotechnology, TianJin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China）Abstract: M. rubber (Monascus purpureus) mediated solid state fermentation of the soybean meal was studied. The high-value fermented soybean meal was obtained with the ratio of soybean meal to water being of 1:1. The color-value, the comparison of the protein type, the contents of protein, and the detection of polypeptide before the fermentation and after the fermentation was determined and the contents of Monacolin K in the fermented product were determined. The results showed that the color-value of the solid-state fermented soybean mea was low and the solubility of the protein in the fermented soybean was reduced due to denaturation by steam heating. Through the solid-state fermentation, the contents of the soluble protein increased and the proteins decomposed to peptides and thus improve the function of the protein. Low content of Monacolin K was found in the fermented soybean meal, which indicated that the solid state fermentation of soybean meal by Monascus was unsuitable to the production of Monascus Pigment and Monacolin K.
Key words: soybean meal; monascus; fermentation; soybean polypeptide; Monacolin K
豆粕是目前畜牧养殖业使用量很大的一种优质蛋白源，具有较高的粗蛋白含量及较平衡的氨基酸组成。
但由于大豆蛋白质分子结构复杂，分子量较大，存在着消化率和生物学效价不及动物性蛋白质的问题。
通过微生物发酵，大豆蛋白能形成大豆多肽和小分子物质的混合物，具有溶解度好、黏度低、比蛋白和氨基酸更易消化等特点[1~3]。
红曲霉(Monascus)广泛应用于食品工业中，红曲色素长期作为食品着色剂；其发酵产物中含多种有效活性物质，其中莫纳可林K(Monacolin K)具有降低血清胆固醇及防癌等功效。
本文首次对红曲霉固体发酵豆粕的色价、发酵前后蛋白质类型、含量及Monacolin K的含量进行了研究[4~6]。
1 材料与方法
收稿日期：2008-08-03
作者简介：刘安军，博士，教授，从事食品生物技术教学与科研工作 1.1 材料
豆粕，市售；红曲霉，天津科技大学功能性食品实验室。
1.2 仪器和药品试剂
电热恒温培养箱、HYG-Ha回转式恒温调速摇瓶柜、超净工作台、立式压力蒸汽灭菌器、DZF-6020型真空干燥箱、高速粉碎机、JR-2集热式磁力加热搅拌器、紫外可见分光光度计、Lab Alliance高效液相色谱仪、凯氏定氮装置、DYY-8B型稳压稳流电泳仪、凝胶成像装置、高速离心机、电子精密天平、pH计、土豆、葡萄糖、琼脂条、牛肉浸膏、蛋白胨、酵母浸粉、丙三醇、硝酸钠、硫酸镁、硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸、硼酸、氢氧化钠、盐酸、甲醛、乙酸乙酯、甲醇、乙醇。
1.3 红曲霉发酵豆粕粉的制备
1.3.1 红曲霉培养基的活化
PDA斜面培养基的制备：将土豆去皮洗净，切成小块，放在水中[m(土豆):V(水)＝1:5]煮沸0.5 h，用纱
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布过滤，滤液加水稀释至原来的体积。
再加2％葡萄糖，2％琼脂，pH 自然。
分装于试管中，121 ℃灭菌30 min 后铺斜面。
将红曲霉在PDA 培养基上培养6~8 d 进行活化。
1.3.2 红曲霉液体种子的培养
液体种子培养基的配制：7%丙三醇、3%牛肉浸膏、0.8%蛋白胨、0.8%硝酸钠、3%葡萄糖、0.1%硫酸镁、pH 自然。
将新鲜菌种斜面加入适量无菌水，用孢子铲将斜面中的孢子刮掉，制成菌悬液，接入带有玻璃珠的种子培养基三角瓶中，于30 ℃150 r/min 摇床培养4~5 d 。
1.3.3 红曲霉固体发酵豆粕的培养
将红曲霉液体种子按20%接种量接种于具有不同料水比的灭菌的豆粕培养基上，于30℃的恒温培养箱中培养7d 。
1.3.4 烘干粉碎
将发酵产物于60 ℃的真空干燥箱中烘干，用高速粉碎机磨成粉。
1.4 红曲霉发酵豆粕色价的测定
称取样品1.000 g,放入100 mL 具磨口塞锥形瓶中，加入70%乙醇50 mL, 摇匀后放入60 ℃磁力加热搅拌器内保温萃取2 h ，取出冷却(必要时补充定容)，离心取上清液，吸取上清液10 mL 放入25 mL 容量瓶中，加入70%乙醇稀释定容至25mL,用1cm 比色皿以70%乙醇作空白，在分光光度计上取波长505nm,测定样品萃取稀释液的吸光度，将测得的样品平均吸光度乘以125(稀释倍数)，即作为发酵产物的色价。
1.5 蛋白质含量的测定及蛋白肽的电泳分析
取2 g 样品, 按GB/T5009.5-85操作，用微量凯氏定氮法进行粗蛋白的测定。
按豆粕与蒸馏水之比1:10(m/V )的比例稀释, 于55 ℃磁力加热搅拌器中提取2 h ；4000 r/min 离心10 min,取上清液, 采用隆丁区分法[7]，进行小分子肽类的测定。
采用18%的分离胶对上述上清液进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
1.6 Monacolin K 的含量的测定[8] 1.6.1 标准曲线的绘制
将0.2mg/mL 的标准溶液,分别稀释成5.0、10.0、20.0、40.0、60.0、120.0、200.0 μg/mL 的标准溶液系列。
1.6.2 样品的处理
以乙酸乙酯为溶媒的操作过程为：精确称取发酵产物2.500 g 于200 mL 三角烧瓶中，加入乙酸乙酯50 mL ，置摇床1 h(50 ℃,150 r/min)，取乙酸乙酯层挥干，
残渣用甲醇溶解，并定容至10 mL ，用45 μm 微孔滤膜过滤，滤液为供试品溶液。
1.6.3 色谱条件
色谱柱：Lanbo Kromasil C18 (5 μm ，4.6mm ×250 mm)；柱温：室温；流动相：甲醇:水=80:20(V/V)，加入0.1%的磷酸；流速：1 mL/min ；检测器：紫外检测器；波长：237 nm 2 结果与分析
2.1 不同粕水比发酵产物的色价比较
在不同粕水比发酵产物的气味、黏度都可以接受的基础上，对其色价进行测定的结果如下。
表1 不同粕水比发酵产物的色价
Table 1 Effect of ratio of soybean meal to water on color-value of
fermented products
粕水比2:1 1.5:1 1:1 1:1.5 1:2 吸光度0.356 0.419 0.554 0.458 0.442色价
44.5 52.37 67.5 57.25 55.25
表1显示：m (豆粕):V (水)=1:1时，发酵产物的色价
最高。
2.2 蛋白质的测定
表2 固体蛋白含量
Table 2 Protein contents of the solid fermented soybean meal
项目 豆粕粉121℃高温灭菌豆粕粉 发酵豆粕粉*蛋白含量/%
22.64
22.63 22.74
表1的发酵豆粕粉是用粕水比1:1时发酵生产的豆粕粉,下
同。
由表2可看出，发酵前后豆粕粉粗蛋白含量基本不变。
表3 上清液蛋白含量
Table 3 Protein contents in the fluid of the solid fermented
soybean meal
项目 豆粕粉121℃高温灭菌豆粕粉 发酵豆粕粉蛋白含量/g 0.23810.0555 0.1111 蛋白提取率/%
52.58
12.26 24.52
从表3知，高温灭菌使蛋白提取率52.58%降至12.26%，说明高温使大豆蛋白变性，可溶性蛋白变为不溶性蛋白；而发酵后蛋白质的提取率又升至24.52％，说明在发酵过程中，不溶性蛋白被分解为可溶性蛋白。
表4 上清液氨基氮含量
Table 4 Amino nitrogen contents in the fluid of the solid
fermented soybean meal
项目 121℃高温灭菌豆粕粉 发酵豆粕粉
氨基氮含量/g
0.0003514 0.0007290
150
表4表明上清液中氨基酸较少。
表5 上清液中多肽含量
Table 5 Polypeptide contents in the fluid of the solid fermented
soybean meal
项目 121℃高温灭菌豆粕粉 发酵豆粕粉
多肽含量/%
2.76 5.52
151
由表5得出：小分子肽含量由2.76%提高到5.52%，说明红曲霉具有分解不溶性蛋白质的功能。
2.3 发酵蛋白肽的电泳结果图分析
1.标准蛋白；
2.豆粕粉上清液；
3. 121℃高温灭菌豆粕粉上清液；
4.发酵豆粕粉上清液 图1 发酵蛋白肽的电泳结果图分析 Fig.1 SDS-PAGE of the fermented polypeptide
图1结果表明：高温使大豆蛋白变性，而发酵过程使不溶性蛋白中一小部分分解为可溶性蛋白。
2.4 发酵产物中Monacolin K 含量的测定
图2 莫纳可林K标准品的色谱图
Fig.2 HPLC chromatogram of the Monacolin K in standard
图3 莫纳可林K的标准曲线图 Fig.3 Standard curve of Monacolin K
图2为莫纳可林K 标准品的色谱图，图3为根据图2作出的莫纳可林K 的标准曲线图,图4为红曲霉发酵样
品的色谱图。
从图4可知，红曲霉固体发酵豆粕中Monacolin K 的峰面积为224921，代入线性回归方程y=26731x+7811.9中得出红曲霉固体发酵豆粕中Monacolin K 的含量为32.49 μg/g 。
图4 红曲霉发酵样品的色谱图
Fig.4 HPLC chromatogram of the Monacolin K in fermented
product
3 结论
红曲霉固体发酵所得豆粕的色价不高，说明红曲霉菌对豆粕的利用率较低。
高压蒸汽加热会使豆粕中的蛋白质变性，溶解度显著降低，红曲霉发酵豆粕的过程使可溶性蛋白质含量增加，说明红曲霉具有分解豆粕中不溶性蛋白质的能力；且使之由大分子的蛋白质变成小分子肽类，从而提高了蛋白质的功能特性。
高效液相色谱检测发酵产物存在莫纳可林K ，但含量不高。
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