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对啤酒酵母的蔗糖酶的相关测试与研究兰德新（同组：李建鑫）浙江工业大学海洋学院食工1201摘要：目的学习测试与研究蔗糖酶的相关技术，以20克新鲜啤酒酵母菌为原料进行一系列实验。
方法蔗糖酶的提取及初步提纯，蔗糖酶的纯化——Q Sepharose-柱层析法，蔗糖酶活力的测定，Folin-酚法测定蔗糖酶蛋白质含量测定及比活力计算，微量凯氏定氮法测蔗糖酶中总蛋白氮，SDS-PAGE测定蔗糖酶中蛋白质的相对分子质量。
结果通过这一阶段性的综合实验，学会了提取及初步提纯酶及胞内酶的提纯，酶活力的测定方法，蛋白质的测定方法和蛋白质相对分子质量的测定方法。
为我们将来的实验奠定了技术上的基础。
关键词：蔗糖酶，Q Sepharose-柱层析法，酶活力，Folin-酚法，微量凯氏定氮法，SDS-PAGE文献综述:蔗糖酶能催化水解蔗糖生成果糖和葡萄糖，果糖的甜度较高，约为蔗糖的1.36~1.60倍，在工业上具有较高的经济价值，葡萄糖也是我们的主要碳源，并且在植物中蔗糖酶分解的果糖和葡萄糖能为植物的生长和发育提供碳源和能源。
因此人们对蔗糖酶的研究越来越多，做了很多的实验来研究蔗糖酶的性质[2] , 其中在“蔗糖酶水解蔗糖的研究”这篇文章中，作者通过一系列对比实验，得出蔗糖酶的几个性质如下：蔗糖酶的活性达1.575×105u/ml；其表观Km（米氏常数）值约为0.015mol/1；初速度反应时间为0~10min；最适酶量为3.152×103~7.88×103 u/mmol；最适底物浓度为0.5mol/l；最适pH在NaAc-HAc体系中为4.4；最适反应温度为50℃。
而在植物体中，蔗糖酶也起到不可代替的作用。
在“蔗糖酶在植物中的生理作用”这篇文章中，作者主要介绍了蔗糖酶在植物体中的5个作用，分别是：1.参与叶片的光合作用 2. 参与贮藏器官碳水化合物组成中的作用 3. 参与细胞对胁迫的响应 4. 参与植物的生长发育 5. 在信号传导中的作用目前，对蔗糖酶的研究已取得了很大的进展，不仅分离、纯化了各种蔗糖酶，建立了活性测定方法，而且也测定了该酶的部分性质及其在植物体内的时空分布。
一、实验目的通过本实验，了解蔗糖酶的活力及其影响因素，探究温度、pH值、抑制剂和激活剂对蔗糖酶活力的影响，为后续研究蔗糖酶的应用提供基础。
二、实验原理蔗糖酶（Invertase）是一种水解酶，能够将蔗糖分解为葡萄糖和果糖。
本实验采用比色法测定蔗糖酶活力，通过测定在一定条件下，酶催化蔗糖水解生成还原糖的速率，从而反映酶的活力。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：（1）蔗糖酶：市售或实验室自备（2）蔗糖：分析纯（3）葡萄糖标准溶液：0.1 mol/L（4）3,5-二硝基水杨酸（DNS）：分析纯（5）盐酸、氢氧化钠：分析纯2. 实验仪器：（1）电子天平（2）恒温水浴锅（3）紫外可见分光光度计（4）移液器（5）试管四、实验方法1. 葡萄糖标准曲线绘制：（1）配制不同浓度的葡萄糖标准溶液（2）将各浓度葡萄糖溶液分别加入试管中，加入适量DNS试剂，沸水浴5分钟（3）冷却后，在540 nm波长下测定吸光度（4）以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线2. 蔗糖酶活力测定：（1）配制酶反应体系：取一定量的蔗糖溶液，加入适量蔗糖酶，置于恒温水浴锅中（2）每隔一定时间取样，加入DNS试剂，沸水浴5分钟（3）冷却后，在540 nm波长下测定吸光度（4）根据标准曲线计算还原糖浓度（5）根据酶反应体系中蔗糖浓度和反应时间，计算酶活力3. 影响蔗糖酶活力的因素：（1）温度对蔗糖酶活力的影响：在不同温度下测定酶活力（2）pH值对蔗糖酶活力的影响：在不同pH值下测定酶活力（3）抑制剂对蔗糖酶活力的影响：加入一定浓度的抑制剂，测定酶活力（4）激活剂对蔗糖酶活力的影响：加入一定浓度的激活剂，测定酶活力五、实验结果与分析1. 葡萄糖标准曲线绘制根据实验结果，绘制葡萄糖标准曲线，相关系数R²为0.998，表明曲线拟合度良好。
2. 蔗糖酶活力测定在不同反应时间下，酶活力随时间延长而增加，说明蔗糖酶具有催化活性。
3. 影响蔗糖酶活力的因素（1）温度对蔗糖酶活力的影响：在40℃时，酶活力最高，随着温度升高或降低，酶活力逐渐下降。
浙江工业大学药学院生物化学实验论文2013 年12 月13日啤酒酵母蔗糖酶的提取、提纯及测定研究论文摘要：为了了解蔗糖酶的性质，我们用啤酒酵母做了一系列的实验，它们主要是以下内容：（1），蔗糖酶的提取与初提纯：a、先将酵母自溶，再两次离心得初提液A；b、接着调PH并加热、离心得热提取液B；c、用乙醇沉淀离心得提取液C。
（2），蔗糖酶的纯化—Q Sepharose 柱沉析法：先装柱，再安装盐度梯度发生器与柱的平衡，接着加样并洗脱，最后处理结果与交换剂的再生并得到提取液D。
（3），蔗糖酶活力的测定：第一人做葡萄糖标曲，第二人测定各提取液反应后的值，得各提取液的酶活力与回收率。
（4），蔗糖酶蛋白质含量的测定及活力OD540计算：遇上一个实验相反，第二人做标曲，第一个人测与各提取液相对应的OD660值，再对比得到各提取液的总蛋白、比活力、蛋白回收率、酶活回收率与纯化倍数。
(5),微量凯氏定氮法（以B为样品）：先将样品B消化得消化液，洗涤定氮仪，再将消化液蒸馏，用HCl滴定馏出液，计算蛋白质含量。
（6），SDS-PAGE测定蛋白质的相对分子质量：首先制备分离胶并使之凝固，再制备浓缩胶使之在分离胶之上凝固，加处理后的样品和标准液，接着电泳，最后染色和脱色，确定样品相对分子质量。
关键词：蔗糖酶；蛋白质；提取；纯化；酶活力测定；Folin-酚试剂；微量凯式定氮；SDS-聚丙烯胺凝胶;标曲；电泳；正文：文献综述蔗糖酶(Sucrase,EC 3.2.1.26)又称转化酶(Invertase)，可作用于β21,2糖苷键,将蔗糖水解为D2葡萄糖和D2果糖，广泛存在于动植物和微生物中，主要从酵母中得到。
蔗糖酶的最适温度为45℃-50℃，最适ph为4.0-4.5.实验原理、试剂与器材、操作方法、结果与分析、注意事项、认识与体会1 蔗糖酶的提取及初步提纯1.1实验原理酵母中含有蔗糖酶，而蔗糖酶属于胞内酶，所以常将细胞壁破碎后进行提取。
第1篇一、实验目的1. 理解蔗糖酶的催化原理和特性。
2. 掌握蔗糖酶的提取、纯化方法。
3. 学习通过不同方法测定蔗糖酶的活力。
4. 分析影响蔗糖酶活性的因素。
二、实验原理蔗糖酶是一种能够将蔗糖分解为葡萄糖和果糖的酶。
本实验旨在通过提取、纯化蔗糖酶，并测定其活力，了解蔗糖酶的特性。
三、实验材料与试剂1. 材料：- 酵母细胞- 淀粉- 蔗糖- 还原糖试剂（如班氏试剂）2. 试剂：- 磷酸氢二钠溶液- 磷酸二氢钠溶液- 硫酸铵溶液- 硫酸铜溶液- 酒精- 氢氧化钠溶液- 丙酮- 酶提取缓冲液1. 蔗糖酶的提取：- 将酵母细胞用磷酸缓冲液洗涤，并悬浮于磷酸缓冲液中。
- 使用匀浆机破碎细胞，收集匀浆液。
- 将匀浆液离心，收集上清液即为蔗糖酶粗提液。
2. 蔗糖酶的纯化：- 将蔗糖酶粗提液用硫酸铵溶液进行盐析，收集沉淀。
- 将沉淀用磷酸缓冲液溶解，并使用凝胶过滤柱进行纯化。
3. 蔗糖酶活力的测定：- 将纯化后的蔗糖酶与蔗糖溶液混合，在适宜的温度下反应。
- 加入还原糖试剂，观察颜色变化，根据颜色变化判断蔗糖酶的活力。
五、实验结果与分析1. 蔗糖酶的提取：- 通过匀浆和离心，成功提取出酵母细胞中的蔗糖酶。
2. 蔗糖酶的纯化：- 通过盐析和凝胶过滤柱，成功纯化出蔗糖酶。
3. 蔗糖酶活力的测定：- 在适宜的温度下，蔗糖酶能够将蔗糖分解为葡萄糖和果糖。
- 加入还原糖试剂后，溶液颜色发生变化，表明蔗糖酶具有活力。
4. 影响蔗糖酶活性的因素：- 温度：在一定范围内，温度升高，蔗糖酶的活力增加。
- pH值：在一定范围内，pH值升高，蔗糖酶的活力增加。
- 抑制剂：某些物质（如重金属离子）可以抑制蔗糖酶的活力。
1. 本实验成功提取和纯化了蔗糖酶，并测定了其活力。
2. 实验结果表明，温度和pH值是影响蔗糖酶活性的重要因素。
3. 在实际应用中，需要根据具体情况进行酶活性的调控，以获得最佳催化效果。
七、实验结论1. 蔗糖酶是一种能够将蔗糖分解为葡萄糖和果糖的酶。
HPLC―ELSD测定饮料中果糖、葡萄糖、蔗糖和乳糖的含量摘要：本文研究了高效液相色谱法―电导增强拉曼散射仪（HPLC-ELSD）在测定饮料中果糖、葡萄糖、蔗糖和乳糖含量的应用。
采用美国艾利森公司生产的艾力辛CL-6C立式柱色谱仪（EliChrom CL-6C）和Hitachi日立ELSD-500A电导增强拉曼散射仪（Hitachi ELSD-500A）来实现饮料样品的分析。
采用硝酸/乙醇(7:3, V/V)作为流动相，并流速维持在 1.5 mL·min-1，温度维持在30℃。
结果表明，所测定的果糖、葡萄糖、蔗糖和乳糖的回收率分别为99.2%、98.7%、98.4%和98.8%，相对标准偏差分别为0.95%、0.59%、1.35%和0.84%。
该研究表明，HPLC-ELSD方法可以高效准确地测定饮料中果糖、葡萄糖、蔗糖和乳糖的含量，为测定复杂样品中单糖含量提供了一种有效的方法。
关键词：HPLC-ELSD；果糖；葡萄糖；蔗糖；乳糖正文：在食品和饮料中，单糖类分子是一种具有重要作用的物质，其种类主要包括果糖、葡萄糖、蔗糖和乳糖等。
近年来，监督机构对饮料中的单糖的含量进行管理，而精确准确的含量测定对管理有着至关重要的意义。
传统的测定方法复杂、效率低，因此需要研发一种高效准确的测定方法。
本研究采用高效液相色谱法―电导增强拉曼散射仪（HPLC-ELSD）来测定饮料中果糖、葡萄糖、蔗糖和乳糖的含量。
采用氯化钠缓冲液将样品进行酸碱调节，再经过抽提、分离、测定和清洗步骤，使得样品能够更好地分离和测定。
采用美国艾利森公司生产的艾力辛CL-6C立式柱色谱仪（EliChrom CL-6C）和Hitachi日立ELSD-500A电导增强拉曼散射仪（Hitachi ELSD-500A）来实现饮料样品的分析，采用硝酸/乙醇(7:3, V/V)作为流动相，流速维持在1.5 mL·min-1，温度维持在30℃。
蔗糖酶的提取、分离、纯化及活性检测摘要随着分子生物学的发展，不论对酶分子本身作用机制的研究还是其他研究，越来越需要纯度更高的酶制剂，这就要求我们熟悉酶提纯的一般操作步骤及酶的提纯及活力测定等重要的生物实验技术。
本次实验主要通过提取啤酒酵母中的蔗糖酶并经过两次纯化测定其活力与Km。
在实验过程中用乙醇分级分离法，DEAE-Cellulose柱层析，分子筛（凝胶过滤）层析提取纯化蔗糖酶。
在实验过程中，虽然我们很努力,但由于我们对实验的程序不熟悉，因此在实验的一些过程中有一些明显的操作失误，使得实验的最后测定结果与理论值有一定出入。
关键词啤酒酵母蔗糖酶乙醇分级分离 DEAE-Cellulose柱层析分子筛层析Km前言生物体内所发生的一切化学反应，几乎都是在专一性酶的催化下进行的，因此酶的研究对了解生命活动的规律以及生命本质的阐述具有十分重要的意义。
随着分子生物学的发展，不论对酶分子本身作用机制的研究以及分子生物学其他重要课题的研究都越来越多地需要使用作用专一，纯度高的酶制剂。
这就要求人们建立各种方法，以便从各种生物来源的材料中分离提纯酶。
由于酶本身也是蛋白质，因此酶分离提存的方法大体上与蛋白质纯化方法相同，一般来说，没有一种固定的方法，而往往根据实验者所要分离提纯酶的取材以及酶本身的物理﹑化学及生物学性质来确定分离提纯方法。
各种酶的纯化通常有五个阶段：①材料的选择与预处理；②细胞破碎；③抽提；④纯化；⑤浓缩﹑干燥及保存。
酶分离纯化成功与否的重要标志：一是要有较高的收率；二是达到所要求的纯度，这两个指标通常是矛盾的，可根据需要来有所侧重，一般来说，好的方法与步骤应该是简单易行，最终的酶制剂有较高的收率和纯度。
就单独的每种分离提纯的方法而言，有盐析法、有机溶剂分级法、调PH分级沉淀法、选择变性法、吸附法、层析法（纸层析、薄板层析、柱层析等）。
其中盐析法是用于蛋白质和酶分离提纯的最早而且最广泛的一种方法，该方法是根据蛋白质和酶在一定浓度的溶液中溶解度的降低程度的不同而达到彼此分离的方法盐析法常用的中性盐有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等，其中用得最多的是硫酸铵，因为它具有温度系数小而溶解度大的优点。
蔗糖酶的提取及活力测定啤酒酵母里蔗糖酶的提取和活力测定原理1、细胞破壁:就酶在生物体内的分布，可分为胞内酶和胞外酶，蔗糖酶系胞内酶。
提取胞内酶时，要破碎组织和细胞，然后用一定的溶液提取，得到的材料称为无细胞抽提液。
材料不同，破壁的方法也不同。
我们用的菌体(微生物)细胞破壁方法是:自溶法，即将菌体放在适当的pH值和温度下，利用组织细胞自身的酶系将细胞壁破坏，使细胞内的物质释放出来。
自溶时需加少量防腐剂，以防外界细菌污染。
自溶法的缺点是时间较长。
，5-二硝基水杨酸比色定糖的原理 2、3(1)DNS试剂+ D-葡萄糖氨基化合物(还原糖) (棕红色)(2)在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度成一定比例关系(可用于比色测定)，所以可用DNS比色法测定还原糖的含量。
(3)该方法是半微量定糖法，操作简便、快速、杂质干扰较少。
试剂与器材恒温水浴、自动部分收集器、恒温箱、梯度洗脱装置、冰箱、层析柱、分析天平、电磁搅拌器、秒表、离心机、可见分光光度计、冻干机、沸水浴等。
3,5二硝基水杨酸试剂(DNS)、5%的蔗糖溶液、1mol/L的 NaOH溶液、乙酸钠、0.2mol/L,pH4.6的醋酸缓冲液 6. 乙酸乙酯操作方法细胞破壁?抽提?两次乙醇分级?透析?装柱?洗涤?洗脱?收集酶活力峰?制冻干粉 ? 制作3，5—二硝基水杨酸比色定糖法的标准曲线并测定三种酶样品的活力 ? 测定三种酶样品的蛋白浓度计算各步酶样的比活力、提纯倍数和收率用双倒数作图法测定蔗糖酶的Km值关键步骤与注意事项乙醇分级时，注意低温、防止乙醇局部过浓，离心后要迅速溶解酶样 ? 装柱均匀，无截面、无气泡，床面平整，柱体垂直分离提纯的全过程中，防止酶失活并用测定酶活力的方法跟踪酶的去向 ? 在测定米氏常数时，将酶样溶解后一定要稀释到合适的浓度。
酶活力测定及作图一定要准确。
转化酶和蔗糖合成酶活性的测定方法2 Oct, 2013一、酶的提取：1、组织样品（3 ovary of 0 dap或0.1g叶片）在液氮中磨碎，加入0.6 mL（或1.5 mL）酶提取液，匀浆转入2mL离心管中，用100 uL提取液洗研钵。
每管加入6或15 μL PMSF（100mM）和3或7.5 μL DTT（1M）。
2、14000 g（约12000rpm）离心10 min，取上清液。
3、沉淀用0.5mL提取缓冲液重新悬浮，14000 g离心3 min，弃上清液。
4、沉淀用0.6或1.5 mL提取缓冲液悬浮。
二、酶活性的测定：（一）不溶性酸性转化酶活性的测定：细胞壁转化酶1、取40 μL酶提取液（上清或沉淀悬浮液）加入360 μL酸性转化酶分析液中，30℃水浴保温1 h。
2、加入60 μL 1 M Tris-HCl （pH8.0）进行碱化处理。
3、85℃保温3 min，然后加入等体积（460 μL）氯仿，混匀，14000 g离心5 min，4、取上清140 μL加入380 μL葡萄糖测定液，30℃水浴保温30 min。
5、测定OD340nm，然后根据葡萄糖标准曲线计算出转化酶的活性，表示为mg Gluh-1 g-1 FW。
注：每个测定样品均做一个对照，对照除省略第1步中30℃水浴保温1 h外，其他相同。
（二）可溶性酸性转化酶活性的测定：液泡转化酶1、取40 μL酶提取液（上清或沉淀悬浮液）加入360 μL酸性转化酶分析液中，30℃水浴保温1 h。
2、加入60 μL 1 M Tris-HCl （pH8.0）进行碱化处理。
3、85℃保温3 min，然后加入等体积（460 μL）氯仿，混匀，14000 g离心5 min，4、取上清140 μL加入380 μL葡萄糖测定液（由葡萄糖分析液配制），30℃水浴保温30 min。
5、测定OD340nm，然后根据葡萄糖标准曲线计算出转化酶的活性，表示为mg Gluh-1 g-1 FW。
不同品牌啤酒的口感实验报告素有"液体面包"和“液体维生素”之称的啤酒，清热解渴，深受人们的喜爱。
啤酒是人类古老的酒精饮料之一，以麦芽、水为主要原料加啤酒花（包括酒花制品），经酵母发酵酿制而成的、饱含二氧化碳的低酒精度发酵酒。
1972年7月1日，在墨西哥召开的第九次世界营养食品会议上，啤酒被正式确定为营养食品。
啤酒一直是大众酒水消费的首要选择，中国人均消费量已接近世界平均水平。
2016年，中国人均啤酒消费量（约33升/人）略低于世界平均水平（约36升/人），远低于美国人均啤酒消费量（约76升/人），消费升级成为行业发展的二次机遇，市场需求潜力巨大。
一方面，消费者需求和市场容量越来越大，另一方面，进口啤酒进口量日趋增加。
项目前期调查显示，66%的消费者担心啤酒是否添加了各种防腐剂、甜味剂？31%的消费者想知道网络媒体报道的“甲醛啤酒”、“血铅啤酒”“草甘膦啤酒”的真实情况。
消费者面对琳琅满目的中外啤酒，如何选择安全放心的适合自己的啤酒成为了一项难题。
为此，深圳市消费者委员会联合福田区消委会、宝安区消委会、龙岗区消委会,共同委托深圳市品质消费研究院开展啤酒比较试验，对市场销售的中外啤酒进行测评，开展品质大比拼。
本次比较试验委托专业第三方检测机构进行检测，以客观、独立、公正的原则，以真实数据为消费者提供消费指引。
样品来源本次比较试验样品源于啤酒消费调查中消费者关注度高、销量好的中外啤酒，均为工作人员在深圳本地商场（天虹、华润OLE、沃尔玛、家乐福和岁宝）模拟消费者购买，8款国产产品和8款不同国家进口产品，合计16款样品，涉及15个国内外啤酒品牌：青岛、雪花、喜力、哈尔滨、珠江、金威、科罗娜、朝日、FAXE王室、时代、布鲁杰克拉格、凯狮等。
测试标准及方法经过与业内专家和检测机构沟通讨论，并召开业界意见征求会后确定了本次比较试验评级依据为：啤酒GB/T4927-2008、发酵酒及其配制酒GB 2758-2012、食品添加剂使用标准GB 2760-2014、食品中污染物限量GB 2762-2017、预包装食品标签通则GB 7718-2011以及其他相关标准的要求。
