临床微生物检验_实验六
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抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度 并与该药对测试菌的 MICR
v I
S d1 d2 抑菌圈直径（mm)
纸片扩散法材料与判断
抗菌药物纸片：直径6.0--6.35mm，吸水量为
20μl的滤纸。
培 养 基：MH琼脂，pH7.2--7.4，琼脂
涂片、干燥、紫外杀菌、固定
1.初染： 石炭酸复红溶液 加热至冒白烟 5min
2.媒染： 3%盐酸酒精溶液 3min
3.复染：碱性美蓝溶液 1min
结果观察
结核分枝杆菌的形态 抗酸染色阳性 蓝色背景下菌体红色。 菌体细长略弯曲 有时可见分枝，呈单、成堆或成束排列。
结核杆菌（抗酸染色）
结核杆菌（抗酸染色）
抑菌圈直径的测量
金黄色葡萄球菌抗菌药物敏感性评价
抗菌药物 纸片含药量
青霉素 苯唑西林 万古霉素 庆大霉素 环丙沙星 克林霉素
10U 1ug 30ug 10ug 5ug 2ug
抑菌环直径(mm)
R
I
S
≤28
-
≥29
≤10
11-12
≥13
-
-
≥15
≤12
13-14
≥15
厚度4mm
菌液浓度和接种：0.5麦氏浊度，15min内接
种完毕。
结果判断与报告：S（敏感）、I（中介）、
R（耐药）
质
控：采用标准菌株进行
药敏质控。
质量控制：采用质控菌株
肠杆菌科细菌：大肠埃希菌ATCC25922
ATCC35218
纸
铜绿假单胞菌：大肠埃希菌ATCC25922
片
ATCC35218
扩
铜绿假单胞菌ATCC27853
>24 >15
影响因素
u 培养基的质量 u 药敏纸片的质量 u 菌液的浓度、纯度、接种菌量 u 孵育的温度和观察时间 u 操作质量，等
分枝杆菌与抗酸染色
目的要求
1.掌握抗酸染色的原理、方法和结果判断。 2.掌握结核分枝杆菌的形态。
试剂和器材
卡介苗、抗酸染色液、玻片，等
抗酸染色原理
细胞壁含有大量脂质，主要是分枝菌酸 ，一 般不易着色，如果经加温或延长染色时间而着 色，一旦着色，能抵抗强脱色剂盐酸酒精的脱 色，所以又称抗酸杆菌。
第二天实验内容
1.K-B法药敏试验 结果分析
琼脂稀释法药敏试验（1 份/组）
1. 配制不同浓度抗菌药物 2. 配制含不同浓度抗菌药物 的MH平板（共11个平板） 3. 点种金葡菌及铜绿于以上 MH平板中
药敏结果判断
用刻度尺量取抑菌环直 径，抑菌环 的边缘以肉 眼见不到细菌明显生长 为限。
根据CLSI标准: 敏感(susceptible,S) 耐药(resistant,R) 中介(intermediate,I)
抗酸染色的注意事项：加热
报告方式： 萋尼氏染色镜检结果分级报告标准 抗酸杆菌阴性 (－)：连续观察300个油镜视野未
发现抗酸杆菌。 报告抗酸杆菌菌数：1～9条/300视野。 抗酸杆菌阳性（1＋）：1～9条/100视野。 抗酸杆菌阳性（2＋）：1～9条抗酸杆菌/10视野
抗酸杆菌阳性（3＋）：1～9条抗酸杆菌/每视野。 抗酸杆菌阳性（4＋）：≥10条抗酸杆菌/每视野
散 法
不 动 杆 菌 等： 大肠埃希菌ATCC25922
ATCC35218
铜绿假单胞菌ATCC27853
葡 萄 球 菌 属：金黄色葡萄球菌ATCC25923
大肠埃希菌ATCC35218
肠 球 菌 2020-10-10 属：粪肠球菌ATCC29212
9
纸片扩散法的步骤
1. 水解酪蛋白（MH）培养基，pH7.2～7.4，制备成琼脂厚度 4mm，直径90mm的平板；
临床微生物检验
实验六
实验目的
问1 题掌 作握 方抗 法菌、药结物果敏判感读试及验其的影原 响理 因、 素操 2
2
掌握抗酸染色法的原理、操作方法 及其注意事项
3
掌握镀银染色及TPPA、TRUST试验 原理、方法、结果判断和临床意义
第1天实验内容
1.药敏试验
药敏纸片选择：
1个MH平板/人
金黄色葡萄球菌：PG、OX、VA、CLI、CIP、GEN 铜绿假单胞菌：CAZ、GEN、PIP、CIP、IMP AK
2.抗酸染色
什么是CLSI?
美国临床实验室标准化协会 Clinical and Laboratory Standards Institute
什么是ATCC?
美国典型培养物（标准菌种）收藏所 American Type Culture Collection
K-B药敏法敏感试验
掌握：纸片扩散法（K-B 法）原理 操作方法、结果判读和影响因素
2. 挑取孵育16 ～ 24小时已分纯菌落，置于生理盐水管中， 振荡混匀后校正浓度至0.5麦氏标准。
纸片扩散法的步骤
3. 用无菌棉拭子蘸取菌液，在试管内壁旋转挤去多余 菌液；
4. 然后在MH琼脂表面均匀涂布接种3次，每次旋转平 板60度；
5. 最后沿平板内缘涂抹1周； 6. 平板在室温下干燥3～5min，用无菌镊子或商品化
熟悉：纸片扩散法的质量控制
主要试剂和器材
菌种：金葡或铜绿 MH 培养基、0.5 麦氏比浊管（比浊仪） 无菌生理盐水、各种药物纸片等
纸片扩散法（K-B 法）原理
将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼 脂平板上
纸片中所含的药物吸收琼脂中水分溶解后不断向纸 片周围扩散形成递减的梯度浓度
在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制 从而形成无菌生长的透明圈即为抑菌圈
结核杆菌（抗酸染色）
结核杆菌（抗酸染色）
结核分枝杆菌的分离培养
培养基（L-J培养基=罗氏培养基） 培养条件（专性需氧、较长时间） 菌落特征
固体培养基---典型菌落为干燥、坚硬、表面呈颗粒 状、乳酪色或淡黄色，形似菜花样。
菜花样菌落
结核杆菌（L-J培养基）
课后小结
药敏结果的判断及CLSI标准
的纸片分配器将含药纸片紧贴于琼脂表面，各纸片 中心距离应大于24mm，纸片距平板内缘大于 15mm。
纸片扩散法的步骤
7. 35℃孵育16～24小时量取抑 菌圈直径；
8. 根据抑菌环的直径，按照 CLSI标准判读，报告敏感、 中介、耐药。
①
②
③
④
⑤
⑥
药物敏感试验操作示意图
注意事项
●纸片及培养基要放置室 温平衡; ●菌液浓度要准确; ●平板涂布要均匀; ●各抗菌纸片中心距离应 大于24mm; ●纸片中心距平板内缘应 大于15 mm; ●纸片贴上后，不能移动。
v I
S d1 d2 抑菌圈直径（mm)
纸片扩散法材料与判断
抗菌药物纸片：直径6.0--6.35mm，吸水量为
20μl的滤纸。
培 养 基：MH琼脂，pH7.2--7.4，琼脂
涂片、干燥、紫外杀菌、固定
1.初染： 石炭酸复红溶液 加热至冒白烟 5min
2.媒染： 3%盐酸酒精溶液 3min
3.复染：碱性美蓝溶液 1min
结果观察
结核分枝杆菌的形态 抗酸染色阳性 蓝色背景下菌体红色。 菌体细长略弯曲 有时可见分枝，呈单、成堆或成束排列。
结核杆菌（抗酸染色）
结核杆菌（抗酸染色）
抑菌圈直径的测量
金黄色葡萄球菌抗菌药物敏感性评价
抗菌药物 纸片含药量
青霉素 苯唑西林 万古霉素 庆大霉素 环丙沙星 克林霉素
10U 1ug 30ug 10ug 5ug 2ug
抑菌环直径(mm)
R
I
S
≤28
-
≥29
≤10
11-12
≥13
-
-
≥15
≤12
13-14
≥15
厚度4mm
菌液浓度和接种：0.5麦氏浊度，15min内接
种完毕。
结果判断与报告：S（敏感）、I（中介）、
R（耐药）
质
控：采用标准菌株进行
药敏质控。
质量控制：采用质控菌株
肠杆菌科细菌：大肠埃希菌ATCC25922
ATCC35218
纸
铜绿假单胞菌：大肠埃希菌ATCC25922
片
ATCC35218
扩
铜绿假单胞菌ATCC27853
>24 >15
影响因素
u 培养基的质量 u 药敏纸片的质量 u 菌液的浓度、纯度、接种菌量 u 孵育的温度和观察时间 u 操作质量，等
分枝杆菌与抗酸染色
目的要求
1.掌握抗酸染色的原理、方法和结果判断。 2.掌握结核分枝杆菌的形态。
试剂和器材
卡介苗、抗酸染色液、玻片，等
抗酸染色原理
细胞壁含有大量脂质，主要是分枝菌酸 ，一 般不易着色，如果经加温或延长染色时间而着 色，一旦着色，能抵抗强脱色剂盐酸酒精的脱 色，所以又称抗酸杆菌。
第二天实验内容
1.K-B法药敏试验 结果分析
琼脂稀释法药敏试验（1 份/组）
1. 配制不同浓度抗菌药物 2. 配制含不同浓度抗菌药物 的MH平板（共11个平板） 3. 点种金葡菌及铜绿于以上 MH平板中
药敏结果判断
用刻度尺量取抑菌环直 径，抑菌环 的边缘以肉 眼见不到细菌明显生长 为限。
根据CLSI标准: 敏感(susceptible,S) 耐药(resistant,R) 中介(intermediate,I)
抗酸染色的注意事项：加热
报告方式： 萋尼氏染色镜检结果分级报告标准 抗酸杆菌阴性 (－)：连续观察300个油镜视野未
发现抗酸杆菌。 报告抗酸杆菌菌数：1～9条/300视野。 抗酸杆菌阳性（1＋）：1～9条/100视野。 抗酸杆菌阳性（2＋）：1～9条抗酸杆菌/10视野
抗酸杆菌阳性（3＋）：1～9条抗酸杆菌/每视野。 抗酸杆菌阳性（4＋）：≥10条抗酸杆菌/每视野
散 法
不 动 杆 菌 等： 大肠埃希菌ATCC25922
ATCC35218
铜绿假单胞菌ATCC27853
葡 萄 球 菌 属：金黄色葡萄球菌ATCC25923
大肠埃希菌ATCC35218
肠 球 菌 2020-10-10 属：粪肠球菌ATCC29212
9
纸片扩散法的步骤
1. 水解酪蛋白（MH）培养基，pH7.2～7.4，制备成琼脂厚度 4mm，直径90mm的平板；
临床微生物检验
实验六
实验目的
问1 题掌 作握 方抗 法菌、药结物果敏判感读试及验其的影原 响理 因、 素操 2
2
掌握抗酸染色法的原理、操作方法 及其注意事项
3
掌握镀银染色及TPPA、TRUST试验 原理、方法、结果判断和临床意义
第1天实验内容
1.药敏试验
药敏纸片选择：
1个MH平板/人
金黄色葡萄球菌：PG、OX、VA、CLI、CIP、GEN 铜绿假单胞菌：CAZ、GEN、PIP、CIP、IMP AK
2.抗酸染色
什么是CLSI?
美国临床实验室标准化协会 Clinical and Laboratory Standards Institute
什么是ATCC?
美国典型培养物（标准菌种）收藏所 American Type Culture Collection
K-B药敏法敏感试验
掌握：纸片扩散法（K-B 法）原理 操作方法、结果判读和影响因素
2. 挑取孵育16 ～ 24小时已分纯菌落，置于生理盐水管中， 振荡混匀后校正浓度至0.5麦氏标准。
纸片扩散法的步骤
3. 用无菌棉拭子蘸取菌液，在试管内壁旋转挤去多余 菌液；
4. 然后在MH琼脂表面均匀涂布接种3次，每次旋转平 板60度；
5. 最后沿平板内缘涂抹1周； 6. 平板在室温下干燥3～5min，用无菌镊子或商品化
熟悉：纸片扩散法的质量控制
主要试剂和器材
菌种：金葡或铜绿 MH 培养基、0.5 麦氏比浊管（比浊仪） 无菌生理盐水、各种药物纸片等
纸片扩散法（K-B 法）原理
将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼 脂平板上
纸片中所含的药物吸收琼脂中水分溶解后不断向纸 片周围扩散形成递减的梯度浓度
在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制 从而形成无菌生长的透明圈即为抑菌圈
结核杆菌（抗酸染色）
结核杆菌（抗酸染色）
结核分枝杆菌的分离培养
培养基（L-J培养基=罗氏培养基） 培养条件（专性需氧、较长时间） 菌落特征
固体培养基---典型菌落为干燥、坚硬、表面呈颗粒 状、乳酪色或淡黄色，形似菜花样。
菜花样菌落
结核杆菌（L-J培养基）
课后小结
药敏结果的判断及CLSI标准
的纸片分配器将含药纸片紧贴于琼脂表面，各纸片 中心距离应大于24mm，纸片距平板内缘大于 15mm。
纸片扩散法的步骤
7. 35℃孵育16～24小时量取抑 菌圈直径；
8. 根据抑菌环的直径，按照 CLSI标准判读，报告敏感、 中介、耐药。
①
②
③
④
⑤
⑥
药物敏感试验操作示意图
注意事项
●纸片及培养基要放置室 温平衡; ●菌液浓度要准确; ●平板涂布要均匀; ●各抗菌纸片中心距离应 大于24mm; ●纸片中心距平板内缘应 大于15 mm; ●纸片贴上后，不能移动。
