不同来源白首乌rDNAITS序列分析

贵州桐梓何首乌rDNA ITS序列分析许朋;牛宪立;姬可平【摘要】以改进的CTAB法对何首乌总基因组DNA进行提取,采用通用引物对不同来源的何首乌rDNA ITS序列进行PCR扩增、测序和序列分析.结果表明,何首乌rDNA完全序列片段长度共约652 bp,其中ITS1的长度为202 bp,5.8S的长度为161 bp,ITS2长度为232 bp,与其近缘种ITS序列间存在明显差异.其rDNA ITS序列在分子水平上为鉴别何首乌提供了参考依据.【期刊名称】《生物信息学》【年(卷),期】2014(012)001【总页数】6页(P27-32)【关键词】何首乌;ITS序列;PCR【作者】许朋;牛宪立;姬可平【作者单位】遵义医学院珠海校区,广东珠海519041;遵义医学院珠海校区,广东珠海519041;遵义医学院珠海校区,广东珠海519041【正文语种】中文【中图分类】R978.1+6何首乌(Polygonum multiflorum Thunb)为蓼科植物，分布于河南、四川、贵州、广东等地区。

中草药何首乌的干燥块根部分，具有滋补肝肾、益精血、抗氧化、抗肿瘤、降低胆固醇、抑制动脉粥样硬化、抑菌消炎及增强记忆等多种功效［1］，在临床上应用十分广泛。

药用何首乌近缘种包括木藤蓼(Fallopia aubertii)，齿叶蓼((Fallopia denticulate)，毛脉蓼(Fallopia multiflora var.cilliinerve)等，这些近缘种与何首乌不仅在外形上很相似，化学成分也有部分相同，在药材使用上存在互混、互代、以假充真等现象，因而影响了用药的安全性和有效性，常规方法很难把它们区分开，所以考虑寻找一种有效的能够区分何首乌及其近缘种的分子手段［2］，能够很好的在分子水平上鉴别何首乌。

核糖体rDNA内转录间隔区ITS作为一种遗传标记，具有可遗传性和可识别性，已经被广泛应用于中药材鉴定和品质评价、植物种质资源鉴定、与亲缘关系、系统发育等不同方面的研究。

rDNA ITS序列分析在植物种属鉴定中的应用和研究黄凤玲遵义医学院珠海校区（广东珠海，519041）摘要：rDNA ITS序列分析方法用于植物系统种属鉴定与进化研究有较高的可靠性。

由于高等植物rRNA基因上的18SrDNA、ITS及5SrDNA片段常具有变异位点[1]，通过DNA序列测定核基因组的rDNA ITS 序列，根据测序结果进行比较就可以鉴定植物的种属关系，对于植物的鉴定有非常重要的意义和作用。

关键词：rDNA ITS序列；植物；种属鉴定分子生物学研究发现，生物种类所依赖的资源—“物种”的多样性是由于其基因多态性的结果，而基因多态性又直接体现在DNA分子水平上的检测。

21世纪以来，现代分子生物学技术在植物的研究取得突破性进展，一些分类地位不明确、亲缘关系不清楚的物种通过该技术便得到验证，为不同植物的分类、鉴定等提供了更丰富、更可靠的手段。

其中，核糖体基因（rDNA）的内转录间隔区（ITS）在植物的种、属鉴定的研究得到广泛的应用。

1 rRNA基因（rDNA ）的基本结构及ITS区高等植物中有4种rRNA,即 5.8SrRNA、18SrRNA、28SrRNA和5SrRNA，前三者的基因组成一个转录元，是高度重复的串联序列单位。

近年来，随着分子生物学技术在生物系统研究等领域的广泛应用，以PCR为基础的各种分子生物学技术在植物鉴定方面的应用报道日益增多。

rRNA基因（rDNA ）是目前分子系统研究中普遍采用的分子标记基因之一，它是一种中等重复并有转录活性的家族。

核糖体RNA及其相邻的间隔区合称为rDNA [2]。

rDNA中存在着广泛的保守区域，可以用作引物的结合位点，它们的不同区域可反映物种不同的进化水平。

真核细胞rDNA有几十甚至数千个拷贝，其中2个内部转录间隔区ITS-1、ITS-2将18S、5.8S、28S分隔开；不同的选择压力作用于rDNA区域，造成单个重复单位序列不同的保守性。

每一部分都可以用作特殊的生物系统分析。

一种用ITS1区测序鉴定独活药材的方法最近省食品药品检验研究院的一位老师想知道一些栽培的独活药材经过长期的人工种植是否产生了变种（药材成品的外观上差异确实挺大的），于是请我们的实验室尝试了一次从分子生物学角度来探索这些药材是否已经产生了变化。

一、实验目的鉴定6种独活药材的亲缘关系。

二、实验材料1.对照独活DH-0、待测样本DH-1、DH-7、DH-10、DH-14、DH-18药材图片如下：2.研钵、1.5ml离心管、2ml离心管若干。

3.植物/真菌DNA试剂盒（Simgen Cat.No.3200050）4.2×PCR Mix（Simgen Cat.No.7003100）5.ITS1区引物（F:CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAA/R:GCTACGTTCTTCATCGAT）6.超微量电子天平（DENVER INSTRUMENT,TP-213）、电子恒温不锈钢水浴锅（上海宜昌仪器纱筛厂）、旋涡振荡器（越新仪器，XH-C）、台式离心机（eppendorf centrifuge5415D）、超微量分光光度计（Simgen Cat.No.sim100）、电泳仪（北京六一仪器厂，DYY-6C型）、PCR仪（Techne FPROG5Y Progene Thermal）三、实验方法（一）DNA提取1.称取50mg样本于研钵中，加入200μl65℃预热的Buffer PD和2μlβ-巯基乙醇，用力研磨至匀浆状。

2.研磨充分后加入800μl65℃预热的Buffer PD，继续研磨1分钟，使组织完全裂解。

3.转移800μl裂解产物至2ml离心管中，将离心管置65℃水浴30分钟。

水浴期间每隔5~10分钟翻转离心管数次以帮助DNA的释放。

4.加入800μl Buffer EX，用力混合均匀，12000rpm离心5分钟。

5.小心吸取上清，转入一个新的1.5ml管中。

6.在上清中加入等体积的Buffer GP，混合均匀。

贝母属（Fritillaria L.）为百合科百合亚科百合族的重要类群，中国贝母属植物共有24种2变种[1]，主要分布在西南部的青藏高原及横断山区，新疆地区，长江中下游地区及东北地区，其中14种2变种为我国特有种。

分布于青藏高原及横断山区的贝母植物是川贝母及其近缘种，它们在分子系统树上聚为了一支，共囊括了9种和1变种，被称为“川贝母复合群”[2-3]。

川贝母为我国重要的中药资源，是道地药材，其鳞茎具有镇咳祛痰、平喘、抗癌、抗菌消炎等作用。

川贝母近缘种在外形上与川贝母常常混淆，尤其是川贝母与华西贝母，野外形态特征鉴定极为相似，要从形态特征上准确识别川贝母与华西贝母常有一定困难。

在野外采样中，我们在四川西岭雪山和峨眉山分别采得了三种贝母，从形态学上鉴定为川贝母、华西贝母和峨眉贝母。

为了准确识别这三种贝母植物，我们分别测序了三种贝母的nrITS 序列，比较三者的核基因序列的差异，同时从GenBank 数据库中下载了三种贝母所有的nrITS 序列，与采集所得贝母的nrITS 序列进行综合比较分析，在此基础上，通过分子系统发育树探讨了三种贝母的系统位置和分类鉴定。

目前尚未见对峨眉贝母的nrITS 序列的研究报道，本研究旨在为川贝母及其近缘类群的分子分类鉴定提供相应的依据。

1材料与方法1.1样品和试剂川贝母1号、华西贝母1号从西岭雪山采集获得，峨眉贝母1号、2号从峨眉山采集获得，由乐山师范学院黄娇副教授鉴定，所有采集的样品都是来自经硅胶快速干燥的新鲜叶子，其余的序列在GenBank 中下载（见表1）。

植物DNA 提取试剂盒、琼脂粉、Gold View ™、Marker DL 2000plus 、2×Taq Master Mix 购自康为世纪生物科技有限公司；ITS 序列扩增引物购自上海生物工程技术服务有限公司。

所用各种试剂均为分析纯。

1.2实验方法1.2.1样品总DNA 提取根据康为世纪植物DNA 提取试剂盒所述步骤进行操作，提取样品中的DNA 。

[基金项目] 浙江省档案局科研项目(2007-9)[作者简介] 燕勇(1974-),男,学士,主管技师,主要从事微生物检验工作。

=论著>r DNA -I TS 序列分析在真菌鉴定中的应用燕勇,李卫平,高雯洁,沈志英,王恒辉,陈黎霞(浙江省嘉兴市疾病预防控制中心,浙江嘉兴 314050)[摘要] 目的:通过对3株真菌的rDNA -I T S 序列进行分析,以探讨、说明基于核糖体RNA 基因(即rDNA )内转录间隔区(In ternal T ranscribed Spacer ,I T S)的多态性的序列分析(rDNA -I T S 序列分析)在真菌鉴定中的应用。

方法:通过PCR扩增与测序的方法测得待检真菌菌株的rDNA -ITS 序列,从GENBANK 获取相似序列,使用BLA S T 和DNAMAN 工具对r DNA -I TS 序列进行比对分析。

结果:1号真菌菌株与X y l a riales sp 1LM 40(属炭角菌目)同源性高,但尚不能鉴定到具体的属、种;2号真菌菌株可鉴定到种,为草酸青霉Penic illi u m oxa li cu m;3号真菌菌株可鉴定到种内组水平,为近平滑假丝酵母III 组(最新命名为Candida m etaps il o si s)。

结论:相对于传统的真菌形态学鉴定方法,rDNA -ITS 序列分析用于真菌鉴定更客观、省时、简便、快速,但目前也存在一定的应用限制(受基因库的完善程度、高度同源性序列的多少以及具体物种ITS 区的可变程度等影响)并不能鉴定出所有真菌,宜与传统的形态学鉴定方法相结合用于真菌鉴定。

[关键词] r DNA;内转录间隔区(ITS);PCR;测序;真菌;鉴定[中图分类号] R 44615 [文献标识码] A [文章编号] 1004-8685(2008)10-1958-04Application of r DNA I TS sequence analysis in fungus identificationYan Yong,L iW ei -p ing ,Gao W ei -jie ,Shen Zhi -y in g,W ang H eng-hui ,Chen L i -x iao (Jiax ing Cente r for D i sease Contro l and P reventi on ,Ji ax i ng 314050,Chi na)[Abstract] O bjective :T o introduce and illu m i nate t he applicati on o f r DNA I T S sequence ana l ysis i n f ungus i dentifica ti on on basis o f sequence and l eng t h poly m orph i s m s o f i nterna l transcr i bed spacer(I TS)i n ri bosoma l RNA gene(rDNA )1M ethods :T he three pend i ng fungus stra i ns c rDNA I T S sequences tested by PCR a m plifi cati on and sequenc i ng m e t hods were analyzed and co m-pared w ith si m ilar sequences fro m G E N BANK by N CB I BLAST on li ne too l and DNAMAN so ft w are 1Resu lts :N o 11f ungus stra i n had a h i gh hom ology w it h X y l a riales sp 1L M 40,bu t w as no t yet i den tifiab le on genus or spec ies l eve l o f taxonom ic c l assifi ca -ti on 1N o 12strai n w as i den tified as P en icilliu m oxalicu m,a genus l eve l 1N o 13strai n w as i dentified as Cand i da m etapsil os i s ,ne w desi gnati on of Candida parapsilosis group III ,a g roup l eve l i n spec ies re l a ti ve l y 1Conc l u si on :Compared w ith the traditiona lm or -pho l og ical i den tificati on m ethods ,the r DNA ITS sequence ana lysis i s m ore ob j ective ,ti m e-sav ing ,convenient ,and fast for fun -gus identificati on ,butw it h so m e appli ed li m its currently 1D epended on the perfecti on deg ree o f gene database ,the nu m ber o f h i gh-deg ree homo l ogy sequence ,t he var i ability ex tent of ITS reg i on of biolog ical i nd i v i duals and so on it can be app lied 1T hen ,it does not identif y all f ung ,i and shoul d be co m bi ned w ith the trad iti ona lm orpho l og i ca l identificati on m et hods for f ungus identificati on 1[K ey words] r DNA;Inte rnal transcr i bed spacer(ITS);PCR;Sequenc i ng ;F ungus ;Identifi cation 真核生物基因组中编码核糖体的基因包括28S r DNA 、5S r DNA 、18S rDNA 和518S r DNA 4种,它们在染色体上头尾相连、串联排列,相互之间由间隔区分隔。

近10年白首乌研究进展作者：孙彦敏王辉徐凌川来源：《中国中医药信息》2015年第07期摘要：白首乌是一种传统的滋补中药材，盛产于山东、辽宁、江苏等地，主要含有甾体类化合物、多糖、苯乙酮和多种挥发油等成分，具有补肝肾、强筋骨、益精血、乌须发及延年益寿之功效。

本文综述了近10年有关白首乌生物学研究、化学成分和药理作用的研究文献，为白首乌相关研究及开发提供科学依据。

关键词：白首乌；生物学研究；化学成分；药理作用；综述DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.07.041中图分类号：R285；R284 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）07-0131-06Research Progress of Baishouwu in the Last Decade SUN Yan-min， WANG Hui， XU Ling-chuan （College of Pharmacy， Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan 250355， China）Abstract：Baishouwu is a traditional tonic Chinese medicinal herb which is rich in Shandong，Liaoning and Jiangsu Privences. Baishouwu mainly contains steroids， polysaccharose，acetophenone， and essential oil， with the efficacy of nourishing liver and kidney， tonifying essence and blood， blackening the beard and hair， and prolonging life. This article retrieved relevant literature in the last decade about biological study， chemical constituents， and pharmacological activities of Baishouwu， with a purpose to provide a scientific basis for its rational researches and development.Key words：Baishouwu；biological study；chemical constituent；pharmacological activity；review白首乌系萝藦科（Asclepiadaceae）鹅绒藤属植物耳叶牛皮消Cynanchum auriculatum Royle ex Wight、隔山牛皮消C.wilfordii （Maxim.） Hemsl.及戟叶牛皮消（泰山白首乌）C.bungei Decne.植物的块根，味甘、苦，性微温，具补血、补气、抗衰老、降血脂、降胆固醇及促进乌发生长的作用，被历代医家视为摄生防老珍品，目前多为山东、辽宁等地野生，或江苏滨海等地栽培品。

rDNA-ITS序列分析在植物病原真菌分类鉴定中的应用李依韦;银玲【摘要】This paper summarizes the rDNA-ITS sequence analysis technology principle, technical characteristics and identification of plant pathogenic fungi classification application.%综述了rDNA-ITS序列分析技术的原理、技术特点及在植物病原真菌分类鉴定研究中的应用.【期刊名称】《内蒙古民族大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2012(027)001【总页数】2页(P66-67)【关键词】rDNA-ITS;植物病原真菌;分类鉴定【作者】李依韦;银玲【作者单位】内蒙古民族大学生命科学学院,内蒙古通辽028042;内蒙古民族大学生命科学学院,内蒙古通辽028042【正文语种】中文【中图分类】Q819腐霉属是一类重要的植物病原菌，绝大多数腐霉生活于土壤、湖泊等水生环境中，是植物的主要病原真菌，作物在生长期极易感染真菌病，从而严重影响作物的品质和产量.本文概括了rDNA-ITS序列分析技术的原理、技术特点及在植物病原真菌分类鉴定研究中的应用.对绝大多数真核生物来说,rDNA具有高度重复性,.由以下四部分组成即18SrDNA,5.8S rDNA、28S rDNA编码区及ITS,这个重复的合成单位包括如下几个区段（由5′至3′方向）:非转录区（NTS）;外转录间隔区（ETS）;18S rRNA基因（18 SrDNA）;内转录间隔区1;5.8S rRNA基因;内转录间隔区2;28SrRNA基因.真菌ITS区域长度一般在650～750 bp之间.核糖体序列的测定和比对为大量生物的系统发育和亲缘关系的鉴定提供了有价值的数据,特别是核糖体内转录间隔区,已被广泛应用于亲缘关系较近的系统发育研究〔1,2〕.rDNA上的5.8S、18S和28S rRNA基因有高度保守性,因为不存在成熟的核糖体,所以ITS片段在发育过程中的适应性非常强,所以能经受更多的变异位点，具有序列多态性的特点,即使是近缘的种属也能够通过ITS序列上的不同而加以鉴别.有研究者做过这样的试验,ITS序列在进化上的速度相对18SrDNA来说大得多，大约是其10倍以上.ITS1、ITS2均是中度保守区域,其保守性种内几乎相同而种间差异较大.因为具有这一特点所以应用ITS序列可进行真菌物种的分子鉴定以及菌群之间的系统发育分析.因为ITS序列具有上述种种优点而且ITS序列较小所以目前在真菌分类鉴定中得以广泛应用〔3〕.3.1 rDNA-ITS直接测序法 rDNA-ITS直接测序法是目前最有效、最快速的DNA 分析测序方法之一.应用此法获得生物信息量大,所以在腐霉新种的发现中的贡献最为突出.例如在最近利用此技术分析报道了引起橡胶树死皮的病原菌.另外通过对rDNA-ITS序列的测定，使其与相似菌株的同一序列进行比对分析,应用这一技术从形态学角度对腐霉菌的分类起到了修正和补充作用，例如菌株（F-382）在形态上与保存在国际微生物研究所的奇雄腐霉（菌株号为308174）非常相似,通过对其进行rDNA-ITS序列分析比对，结果发现两者的序列一致性仅为68.9%.rDNA-ITS直接测序法也是研究腐霉系统发育的理想方法.例如通过对多种变种的腐霉菌的ITS序列进行分析,构建系统发育模型,从而获得各腐霉种之间的亲源关系〔4〕. 3.2 分子杂交技术及PCR检测技术与传统的病原菌检测方法相比较，分子杂交技术和PCR技术能快速、高效地检测病原菌,近年来倍受关注.分子杂交技术的灵敏性高,可以对微量样品快速地进行分析检测,而且在杂交中特异性高,因此这一技术主要用于腐霉菌的分类鉴定及亲缘关系的比对.例如利用rDNA-ITS1片段的差异性来设计探针,从土壤中检测出Py.ultimum、Py.aphanidermatum和Py.acanthicum 三个致病腐霉菌.该方法简单方便易于操作,仅靠肉眼观察样品和特异性探针的阳性杂交反应便可对未知病原菌进行鉴定.此外,传统的核酸分子杂交还与ELISA技术相结合,快速准确地把病原菌检测出来，大大提高了工作效率.由于PCR技术具有高度灵敏性、方便快速等特点,而且根据ITS种间序列设计的特异性引物又容易合成,因此极利于应用特异性引物PCR技术进行病原菌的检测，例如对农作物的常见致病菌-终极腐霉Py. ultimumTrow的检测〔5〕.3.3 RFLP、RAPD和AFLP在腐霉分子研究上的应用限际性长度多态性分析（RFLP)利用酶切的方法对DNA进行序列多态性分析.在真菌的分类鉴定中,RFLP 技术主要用于分析相似种间的亲源关系及种内变异性.例如采用PCR-RFLP图谱分析，把卡地腐霉（Py.carolinianum)的不同菌株快速区分开.随机引物扩增多态性DNA（RAPD)技术，DNA用量少、灵敏度高、实验设备简单、周期短,因此普遍得到应用.例如对瓜果的致病腐霉进行RAPD分析,通过构建发育树,得到不同种属间的亲源关系.RAPD技术受条件限制比较大,在不同条件下测定的结果不容易重复.为了弥补上述两种技术不足,一种检测DNA多态性的新方法——AFLP技术得到发展.AFLP技术是一种在PCR和RFLP的基础上发展起来的DNA指纹技术,具有RFLP技术和RAPD技术不具备的优点，又具备两者的长处.AFLP技术目前广泛应用于植物病原菌鉴定、遗传多态性分析及病原腐霉的诊断和比较各种类的亲源关系上，例如对群结腐霉菌的鉴定〔6〕.3.4 其他分子生物学技术的应用聚合酶链式反应-单链构象多态性分析（PCR-SSCP)是一种有较高开发潜力的技术，目前在植物病原菌分类鉴定中用的还比较少.PCR-SSCP和DNA指纹技术以及DNA直接测序法一样有简单快速的特点,而且更加经济实用、灵敏度会更高,尤其是对于处理大批量的样品时,PCR-SSCP比常规PCR更有优势,只需要一对通用引物就能够同时对多个腐霉种进行鉴定.例如对不同的腐霉菌株采用rDNA-ITS1的PCR-SSCP分析,不同的腐霉种都有特征SSCP 条带,利用这一技术可将腐霉鉴定到种.线粒体DNA（mtDNA）用于腐霉进化和系统研究有一定的优势.例如采用不同种属的腐霉菌的细胞色素Ⅱ（coxⅡ)基因序列来研究腐霉属的系统发育关系；利用线粒体细胞色素氧化酶Ⅱ基因及间隔区基因序列分析,把从形态特征上很难区别的菌株区分开.目前mtDNA分析方法在腐霉的分子研究上应用还较少,将来通过技术革新,有希望在腐霉DNA分析鉴定方面起到更大的作用〔7〕.腐霉菌是一类重要的植物病原菌，其生存的空间非常大而且受侵染的植物种类多，尤其是绝大多数农作物.我国是一个以主要发展农业为主的大国，农作物品质的好坏及产量的高低直接影响着人们的生活水平及健康状态.所以对我国腐霉菌进行分类鉴定是一项长期的基础性工作，寻找一种快速地对植物病原真菌进行分类鉴定的方法是目前的重点工作，为后续治疗及防止植物真菌病做好准备工作.【相关文献】〔1〕赵瑞琳.RAPD在真菌分类鉴定上的应用〔J〕.热带农业科技,2004,27（3）:23-26.〔2〕郑雪松,杨虹,李道棠,等.基因间隔序列（ITS）在细菌分类鉴定和种群分析中的应用〔J〕.应用与环境生物学报, 2003,9（6）:678-684.〔3〕张正光,郭成宝,王源超,等.非洲菊根腐病病原的鉴定与ITS序列分析〔J〕.植物病理学报,2005,35（5）:392-396.〔4〕杨雅云,罗文富,杨艳丽.马铃薯及番茄晚疫病菌的核糖体DNA-ITS区段序列分析〔J〕.云南农业大学学报,2005, 20（2）:188-192.〔5〕张志华,洪葵.核酸序列直接分析在真菌鉴定方面的应用〔J〕.华南热带农业大学学报,2006,12（2）:39-43.〔6〕王源超,张正光,郑小波.核糖体基因ITS作为苎麻疫霉、恶疫霉分类辅助性状的研究〔J〕.菌物系统,2000,19（4）: 485-491.〔7〕徐田军,刘楚吾,刘丽,等.基因间隔序列（ITS）在水产动物种质鉴定和遗传多样性分析中的应用〔J〕.湛江海洋大学学报,2006,26（1）:84-88.。

菌株its序列简介菌株its序列是一种用于分析真菌的种属和物种鉴定的标志性分子位点。

在分类学和生态学研究中，通过检测和比较菌株中的its序列差异，可以对真菌的分类、进化和多样性进行深入的研究。

its序列的定义菌株its序列即真菌内转录间隔区(Internal Transcribed Spacer, ITS)，位于真核生物的rDNA中，包括ITS1、5.8S rRNA和ITS2三个区域。

其中，ITS1和ITS2是高变区，可以用于研究种属和物种间的变异。

ITS序列在物种鉴定中的应用ITS序列由于其具有高变性和物种特异性的特点，在真菌物种鉴定中得到广泛应用。

通过与数据库中已知的ITS序列比对，可以准确地将不同的菌株归类到其相应的物种或属级分类。

基于ITS序列的物种鉴定方法，可以实现快速、准确和高通量的真菌鉴定。

ITS序列的分析方法收集菌株样本在进行ITS序列分析之前，首先需要收集菌株样本。

可以选择不同环境中的真菌，如土壤、水体、植物等，或者从已知物种中选取不同的菌株进行分析。

提取菌株DNA从收集的菌株中提取总DNA，可以利用商用的DNA提取试剂盒进行提取。

保证提取的DNA质量和浓度足够用于后续的PCR扩增反应。

PCR扩增ITS序列利用特异性引物对ITS序列进行PCR扩增。

常用的引物对包括ITS1和ITS4。

在扩增过程中，需要根据反应条件进行优化，如温度、循环数等。

扩增后的产物可以通过琼脂糖凝胶电泳进行检测。

分离和纯化PCR产物对PCR扩增得到的产物进行分离和纯化。

可以使用商用的PCR产物纯化试剂盒，或者通过凝胶切割和DNA回收的方法进行纯化。

测序和序列比对将纯化的PCR产物进行测序，可以选择传统的Sanger测序方法，也可以选择高通量测序技术。

得到测序结果后，进行序列比对，可以使用BLAST等序列比对软件进行比对和比对结果的分析。

物种鉴定和系统发育分析根据ITS序列比对结果，可以进行物种鉴定和系统发育分析。

rDNAITS序列分析在真菌鉴定中的应用一、本文概述随着分子生物学技术的飞速发展，真菌鉴定方法也在不断革新。

其中，rDNTS序列分析作为一种高效、准确的鉴定手段，已经在真菌分类和系统发育研究中发挥了重要作用。

本文旨在探讨rDNTS序列分析在真菌鉴定中的应用，以期为该领域的研究提供有益的参考。

本文将首先介绍rDNTS序列的基本概念和特点，阐述其在真菌鉴定中的优势。

随后，将综述rDNTS序列分析在真菌鉴定中的应用现状，包括其在不同真菌类群鉴定中的应用案例、鉴定流程的优化以及数据分析方法的发展。

本文还将讨论rDNTS序列分析在真菌鉴定中存在的挑战与前景，如序列多态性、种间界限模糊等问题，并展望其未来的发展方向。

通过本文的阐述，读者可以全面了解rDNTS序列分析在真菌鉴定中的应用价值，掌握其基本原理和方法，为该领域的研究提供有益的参考和指导。

二、rDNAITS序列的基本结构和特点rDNA ITS序列，即核糖体DNA内部转录间隔区序列，是真核生物核糖体DNA中的一个重要区域。

该区域位于18S、8S和28S rDNA之间，由ITS8S rDNA和ITS2三部分组成。

其中，ITS1和ITS2是非编码区，序列长度在不同物种间存在显著差异，具有较高的可变性和种属特异性。

8S rDNA则是一段保守性较高的编码区，常用于序列的比对和定位。

高度多态性：ITS序列在种间和种内均表现出高度的多态性，这使得其成为真菌鉴定中非常重要的分子标记。

易于扩增：由于ITS序列的长度适中，且存在多个适合PCR扩增的保守区域，因此可以方便地从真菌基因组中扩增得到。

种属特异性：ITS序列的种属特异性使其在真菌鉴定中具有很高的分辨率。

通过比较不同物种的ITS序列，可以有效地鉴定到种或亚种水平。

进化速率适中：ITS序列的进化速率适中，既不过快也不过慢，这使得其既可以用于近缘物种的鉴定，也可以用于较远缘物种间的系统发育分析。

因此，rDNA ITS序列分析在真菌鉴定中具有重要的应用价值。

rDNA-ITS序列鉴定深部真菌菌种的研究进展
仇萌;邹先彪
【期刊名称】《中国真菌学杂志》
【年(卷),期】2011(6)2
【摘要】目前深部真菌病的发生率呈逐渐上升趋势,有关深部真菌菌种的鉴定成为研究热点.由于传统的菌种鉴定方法存在费时及易受实验条件影响等不足,核糖体rDNA-ITS序列分析法已越来越广泛的应用于真菌属内不同种间的系统发育研究中.本文综述了核糖体rDNA-ITS鉴定深部真菌菌种的研究进展,展望了其应用前景.【总页数】4页(P122-125)
【作者】仇萌;邹先彪
【作者单位】解放军总医院第一附属医院皮肤科,北京,100048;解放军总医院第一附属医院皮肤科,北京,100048
【正文语种】中文
【中图分类】R446.53
【相关文献】
1.基于 rDNA-ITS 法鉴定的霉变烟叶真菌种类 [J], 吴阔;聂鑫;朱法亮;罗华元;林昆;李枝桦;朱海滨;饶智;董石飞;陈初;侯占高
2.rDNA-ITS序列分析法和传统分类法对真菌进行分类鉴定 [J], 苟凡铖;侯怡铃;宋波;黄曦文;宋志强;丁祥
3.rDNA-ITS序列分析法与传统分类法相结合在真菌鉴定中的应用 [J], 朱洪庆;王盼盼;张萌;陈嘉慧;丁祥
4.基于rDNA-ITS序列对黑枸杞内生真菌分类鉴定 [J], 杨小朵; 蓝秋菊; 韦冠宇; 郑敬晖; 刘俊林
5.基于rDNA-ITS序列对黑枸杞内生真菌分类鉴定 [J], 杨小朵; 蓝秋菊; 韦冠宇; 郑敬晖; 刘俊林
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内蒙古4种白粉菌的ITS序列分析作者：文静刘铁志赵冰来源：《江苏农业科学》2014年第12期摘要：采用chelex-00法提取内蒙古地区4种白粉菌的基因组DNA，扩增其rDNA内转录间隔区序列ITS，连接载体测序，并基于ITS序列进行亲缘关系分析。

结果表明，4种白粉菌形成3个进化距离较远的分支；寄生在豌豆和田旋花上的豌豆白粉菌和旋花白粉菌的ITS序列紧密聚在支，其亲缘关系较近，同属白粉菌属；寄生在紫花苜蓿上的托罗斯内丝白粉菌和寄生在山桃上的三指单囊白粉菌各自成支，与形态学分类结果相一致。

ITS序列可用于内蒙古地区白粉菌分类鉴定研究。

关键词：白粉菌；内转录间隔区；亲缘关系；内蒙古；序列分析中图分类号： S43244文献标志码： A文章编号：002-302（204）2-0050-03白粉菌（powdery mildews）是重要的植物病原菌，目前至少报道了25个属873种，其中，有性型6个属，无性型9个属，由白粉菌引起的植物病害统称为白粉病。

白粉病在世界各地均有发生，寄主植物至少有 67属9 838种被子植物[2]。

近年来，我国由于玻璃温室、塑料大棚和密植等栽培模式和耕作制度的改变，为作物白粉病的发生创造了良好的环境，常常造成瓜果、蔬菜和花卉等白粉病的大流行，白粉病发生相当普遍和严重，给农业生产带来重大的经济损失。

在许多地区，如芍药、醉蝶花、荷兰菊等观赏花卉白粉病的发病率几乎达到00%，林木和牧草白粉病更是随处可见。

内蒙古自治区是典型的的中温带季风气候地区，植物种类复杂多样，为专性寄生的白粉菌提供了优越的生长发育条件，通过经典分类方法已鉴定出白粉菌0属23个种和变种，寄主植物多达58科2属400多种和变种[3]。

农业是内蒙古的主要产业之一，为避免白粉菌对农业造成的经济损失，对内蒙古自治区农作物白粉菌进行系统分类研究很有必要。

近几年，随着分子生物学的发展，对白粉菌系统分类研究已由传统的经典分类向分子生物方法分类过渡。

文章编号：1001－4829（2012）04－1414－03收稿日期：2012－02－20基金项目：科技部国际合作资助项目（2010DFA32080）；四川省科技厅国合项目（2011HH0025）；国家食用菌产业技术体系栽培与设施研究室岗位（毛木耳和药用菌栽培）；国家食用菌产业技术体系成都综合试验站；四川食用菌产业技术体系创新团队；四川省财政基因工程资助项目作者简介：贾定洪（1977－），男，助理研究员，主要从事食用菌分子生物学和遗传育种研究，*为通讯作者。

4个野生灵芝菌株的ITS 序列分析贾定洪，王波，彭卫红，黄忠乾，谭伟，甘炳成，郑林用*（四川省农业科学院土壤肥料研究所，四川成都610066）摘要：以4个野生灵芝菌株为研究材料，以6个外源菌株为参考菌株，采用MEGA4软件对ITS 序列进行NJ 法聚类分析，构建系统发育树。

结果显示4个灵芝菌株ITS 序列与另外6个参考菌株对齐序列长度在357 369bp 之间，G /C 含量变化为43．4% 57．7%；德昌灵芝1#、德昌灵芝4#和通江灵芝亲缘关系最近，遗传距离为0，德昌灵芝3#与它们的遗传距离为0．0029；与4个野生灵芝菌株亲缘关系由近到远分别是韩芝、红芝、灵芝（中国科学院微生物研究所）、黑灵芝、血芝、云芝；结合4个野生菌株的ITS 序列分析结果和形态特征，4个菌株被鉴定为灵芝（Ganoderma lucidum ）种类的不同株系。

关键词：灵芝；ITS ；系统发育中图分类号：S567．4+1文献标识码：AAnalysis of ITS Sequences in 4Wild Ganoderma lucidum StrainsJIA Ding-hong ，WANG Bo ，PENG Wei-hong ，HUANG Zhong-qian ，TAN Wei ，GAN Bing-cheng ，ZHENG Lin-yong *（Soil and Fertilizer Institute ，Sichuan Academy of Agricultural Sciences ，Sichuan Chengdu 610066，China ）Abstract ：With the bio-software of MEGA4，the ITS sequences of 4wild Ganoderma lucidum strains and their 6reference strains were stud-ied by using NJ method to construct the phylogenetic tree．The results showed that the ITS lengths of their strains ranged from 357to 369bp ，and G /C contents from 43．4%to 57．7%．There were the closest relationships among Dechang lingzhi1#，Dechang lingzhi4#and Tongjiang lingzhi ，and their strains ’genetic distance was merely 0，while there was a genetic distance of 0．0029between Dechang lingzhi3#and them．Strains ，from the close genetic relationships to the farther relationships with the 4wild Ganoderma lucidum strains ，were in order of Hanzhi ，Hongzhi ，Lingzhi （The Institute of Microbiology ，Chinese Academy of Sciences ），Heilingzhi ，Xiezhi ，Yunzhi ，respectively．Comparative study of ITS sequences and morphic characteristics indicated that 4wild strains were subject to different strains of Ganoderma lu-cidum ．Key words ：Ganoderma lucidum ；ITS ；Phylogeny灵芝为多孔菌科真菌赤芝（Ganoderma lucidum ）或紫芝（Ganoderma sinense ）的干燥子实体。

核糖体rDNA ITS序列分析近年来，利用真核生物在rDNA的ITS区段既具保守性又在科、属、种水平上均有特异性序列的特性，对ITS区进行PCR扩增、测序及序列分析后再设计特异性引物来检测真核生物的方法已越来越被广泛应用。

rDNA内转录间隔区（ITS）作为一种遗传标记（遗传标记是指可追踪染色体、染色体某一节段或某个基因座在家系中传递的任何一种遗传特性，具有可遗传性和可识别性。

生物中任何有差异表型的基因突变型均可作为遗传标记），已经被广泛应用于微生物菌种分类与鉴定、中药材鉴定和品质评价、植物种质资源鉴定、动物种系发生、遗传多样性与亲缘关系、病原诊断、系统发育研究等不同方面的研究。

菌物是真核生物的重要类别，传统的菌物分类以子实体形态特征和生理生化指标为分类基础，由于部分菌物的子实体不易获得，形态特征不易掌握，少数形态特征和生理生化指标随着环境的变化而不稳定，使传统的菌物鉴定工作困难或分类系统意见分歧。

随着核糖体rDNA ITS序列分析技术在菌物研究中得到应用，一些分类地位不明确、亲缘关系不清楚的物种通过该技术得到了解决，一些重要的菌物遗传信息得到阐明。

核糖体rDNA的结构及其特点核糖体是一个致密的核糖核蛋白颗粒，执行着蛋白质合成的功能，它由几十种蛋白质和rRNA组成。

编码rRNA的rDNA是基因组DNA 中的中等重复、并有转录活性的基因家族 (genefamily)。

rDNA一般由转录区和非转录区(Non Transcribed Sequence，NTS)构成。

转录区包括5S、5.8S、18S和28SrDNA，其中18S、5.8S和28S rDNA基因组成一个转录单元，产生一个前体RNA。

内转录间隔区ITS(internal transcribed space)，位于18S和5.8S rDNA(ITS1)之间以及5．8S和28SrDNA之间(ITS2)，ITS1和ITS2常被合称为ITS,并且5.8 SRNA基因也被包括在ITS之内。