烟草瞬时转化

烟草叶片瞬时转化实验试验方法一、实验材料及药品pCAMBIA 1381Z-Luc载体、Gv3101农杆菌菌株及其感受态、MES、MgCl2、乙酰丁香通、5-6周本氏烟草等二、载体构建及农杆菌转化烟草瞬时转化实验选用融合Luc信号的pCAMBIA 1381Z-Luc载体，载体构建过程是将拟南芥及菊花的FT启动子分别采用双切双连的常规载体构建方式将启动子构建到pCAMBIA 1381Z-Luc载体上，同时将目的基因构建到pMDC43或pMDC32或pORE载体上作为超表达载体进行后续的瞬时转化实验。

通过农杆菌转化的方式，将上述构建好的质粒转化到农杆菌菌株GV3101的感受态细胞中。

三、材料的准备1、烟草植株5-6周幼嫩未开花植株2、携带质粒的农杆菌（GV3101或An105均可）3、YEB培养液（一瓶+K+R、一瓶只+R——pCAMBIA 1381Z-Luc载体为卡纳氯霉素抗性、Gv3101只有r抗性）4、处理液：10mL配方如下母液配方（10ml配方）：0.5M MES 200ul 0.976g1M MgCl2100ul 2.03g100mM乙酰丁香酮10ul 0.196g（使用DMSO溶解）灭菌水加至10ml （若长时间保存，需避光！）四、操作步骤1、农杆菌转化2、转化正确的农杆菌进行过夜培养，同时培养P19菌株（最好先进行划线）3、确定不同农杆菌所加菌液的量：计算公式：V=n×Vfinal×0.5/OD600 VP19= n×Vfinal×0.3/OD600OD600最好在1以上n=注射叶片数Vfinal=悬浮后的终体积多为2ml或3ml 注：在进行转录激活或抑制实验时，一般加入四种农杆菌（包括P19）而对照组往往只加入两种或三种菌液，此时，应使用Gv3101对体系进行补充，计算方法为公式一，具体加入量视对照组缺失的量确定，分别加入一倍或两倍Gv3101进行补充。

烟草叶肉原生质体分离与转化植物原生质体的分离工作起始于上世纪60年代，英国植物病理学家Cooking首次用纤维素酶分离得到植物原生质体，在经过了前人的不断探索和技术创新之后，植物原生质体的分离,培养及转化技术已日渐成熟。

本实验以烟草为材料，进行原生质体分离转化方面的研究。

一、烟草叶肉原生质体的分离1、材料：温室中的烟草与进行无菌培养的烟草均可。

取材时需按以下标准进行：应取生长状态好的较大叶片，表现为颜色墨绿、充分伸展、叶片较为饱满。

若以无菌苗作为材料应注意去掉变黄及生长状态不好的叶片。

（因为无菌苗的叶片常常很小，需要数片叶片才能分离出足够量的原生质体）2、材料预处理。

（此步也可省略，但有关文献中指出预处理可使制得的原生质体活力增强，易于转化）一般将从温室中采来得叶片（通常较大叶片一片足够）在自来水中冲洗10min左右，（动作要轻微，防止弄伤叶片），然后用保鲜膜包好，置于4℃ 6-12小时。

（一般过夜）3、消毒。

将预处理过的叶片用剪刀小心剪成10mm2大小，置于盛有0.1%升汞的大培养皿中，浸泡8-10min。

再用无菌水冲洗4-5遍。

（放入叶片前，可在0.1%的升汞中加入几滴Tween20，用枪吹打混匀）4、酶解。

将消毒过的叶片用镊子夹取平放于灭菌的滤纸上，若使用无菌苗叶片，需用拇指与中指按住两端，右手拿单面保险刀片从叶片中间部位横切，将叶片切成0.5-1mm左右的细丝，然后立即用镊子将切好的叶片转入预先培好的酶液。

若使用温室苗的叶片，则需将消毒过的叶片平放于灭菌滤纸上，背面朝上，用左手固定住叶片，右手用尖头镊子小心撕去下表皮，后迅速转进酶液，背面朝下。

(注：切成细丝或撕去下表皮的叶片应马上转移入酶液)5、酶解处理。

不同搭配的酶液的最适温度与酶解时间各异。

实验发现烟草叶肉原生质体分离的最适酶液搭配为：cellulaseR-10. Macerozyme R-10.最适温度与酶解时间：26℃避光3-4h。

CoIP protocol From Guo Siyi烟草转化体系将含有正确构建质粒的阳性农杆菌克隆在YEB 液体培养基中培养过夜，到OD600 约 1.5 左右（大约20h），同时摇菌P19，它能有效抑制植物对外源导入载体表达的沉默效应，提高表达量。

然后收集菌体，5000 rpm 5min 常温离心，将菌体用侵染缓冲液（10 mM MES，100 μM AS-乙酰丁香酮，50 mM MgCl2）重悬，用紫外分光光度仪测定OD600 值；根据实验要求将含有不同载体组合的菌液混合，同时在每一个组合中也加入P19，最终使得每种菌液成分的OD600 在0.8 左右；然后将混合的菌液在28 ℃下以200 rpm 的转速再培养至少3 h，然后注射合适大小的烟草叶片。

尽可能多的注射烟草叶片，并标记下注射的叶片及对应区域；之后用保鲜膜封闭，在暗中培养2 d，然后再转入光下培养2-3 d，并取材在荧光显微镜下观察GFP 的荧光已确定烟草叶片中外源载体的表达情况，视情况取材做后续的实验。

免疫共沉淀（CoIP）将VER2，TaGRP2 与不同的标签蛋白融合如FLAG-VER2，TaGRP2-GFP，将该载体转化农杆菌获得阳性克隆，然后共同用农杆菌侵染的方法转化烟草。

至少设定两组样品：即FLAG-VER2/TaGRP2-GFP 以及FLAG-VER2/GFP。

检测目的蛋白是否表达：用Bradford 法测定提取蛋白的浓度，然后用SDS-PAGE 分离蛋白（15-30 μg protein/lane）做Western Blot 用（WB）标签抗体FLAG，GFP 检测融合蛋白是否在烟草中表达。

并根据WB 的结果估算实验组（FLAG-VER2/TaGRP2-GFP）与对照组（FLAG-VER2/GFP）的蛋白相对表达量。

Pre-clear：（所有步骤尽量在冰上进行）取两份30 μL protein A/G beads 到EP 管中放于冰上，用600 μL 的蛋白提取buffer 重悬beads，4 ℃离心1000 g 1 min。

农杆菌瞬时转化法:一、本氏烟草的种植⑴配制基质中各成分比例如下,花卉营养土:蛭石:沙土=2:1:1，22℃16h/8h （光/暗）70%湿度（扣透明白盒2周保湿）⑵将基质浇透水后,烟草种子采用移液器点播在基质中,每盆播1，2粒种子,2-3天浇一次水。

二、农杆菌注射烟草叶片1、3周烟草(4 leaves stage)，选取生长状态良好，健壮的烟草叶片植株（年轻的、完全展开的4周大小）进行农杆菌侵染。

转化前将浇透水，转化后要控制浇水2、农杆菌准备:预培养：接种克隆至5ml LB+Antibiotics培养：用1mL预培养液接种至50ml LB+abtibiotics +Acetosyringon(final 20 µM)含Rif (100 mg/mL)、Str (100 mg/mL)和Kan (50mg/mL)三种抗生素的YEB液体培养基活化农杆菌（(GV3130)）。

检测菌液生长到指数后期 OD600=0.6，4000rpm，室温离心10min收获菌液3、配悬浊液:混匀后于4°C保存;4、重悬液（经常15ml）（10 mM MES-KOH，pH 5.6, 10 mM MgCl2, 100 μM acetosyringone乙酰丁香酮）重悬至OD600=1，（可以洗涤2次）5、同时也将同样培养的含有P19的农杆菌同样悬浮并调整悬浮液的浓度为OD600=16、根据实验设计,将以上三类农杆菌0.7:0.7:1.0体积混合,室温下静置3-4h，7、注射前烟草放在白色日光灯下1h，让气孔充分张开8、Agroinfiltration 注射：重悬菌体，用1 mL注射器（去针头）吸取菌液；避开叶脉，用注射器针在叶片上开小孔后，左手抵住叶片正面，右手轻轻将注射管口垂直压在叶片反面，右手拇指缓慢均匀用力推压，观察菌液在叶片表皮下缓慢移动，直至侵染整个叶片。

（一个植株可以注射2个叶片，不要用子叶）塑料薄膜覆盖，22℃、3天后撕取叶片下表皮于激光共聚焦显微镜下观察。

烟草原生质体的分离纯化烟草原生质体（Nicotine Protoplast）是指烟草（Nicotiana tabacum L.）细胞中存储和合成尼古丁的部位。

作为一种重要的生物资源，烟草原生质体在药物开发、化妆品生产、食品添加剂等领域具有广泛的应用前景。

为了更好地利用烟草原生质体，需要对其进行了分离纯化。

本文将详细介绍烟草原生质体的分离纯化方法及其应用前景。

材料和方法实验材料：烟草植株：Nicotiana tabacum L.实验设备：高速离心机恒温摇床无菌操作台旋转蒸发器微量进样器实验试剂：缓冲液（pH 4）葡萄糖聚乙二醇（PEG）十二烷基硫酸钠（SDS）乙酸乙酯氯仿酚红指示剂尼古丁标准品实验步骤：萃取：将烟草植株剪成碎片，加入缓冲液，用高速粉碎机粉碎。

然后，用缓冲液冲洗粉碎后的材料，收集冲洗液。

分级沉淀：将冲洗液加入无菌操作台中，加入甘露醇和葡萄糖，用高速离心机进行分级沉淀，收集沉淀物。

透析：将沉淀物移入透析袋中，用缓冲液进行透析，去除小分子杂质。

超速离心：将透析液加入高速离心机中，用氯仿和甲醇进行超速离心，收集有机相。

萃取：将有机相加入无菌操作台中，加入缓冲液和尼古丁标准品，用高速震荡器震荡，收集震荡液。

透析：将震荡液移入透析袋中，用缓冲液进行透析，去除小分子杂质。

冻干：将透析液进行冻干处理，得到烟草原生质体粉末。

结果与数据分析通过对比不同实验步骤的实验数据，我们可以得出以下萃取和分级沉淀可以有效去除杂质，提高烟草原生质体的纯度；透析可以进一步去除小分子杂质，提高烟草原生质体的纯度；超速离心可以有效地将有机相和无机相分开，收集到有机相中的尼古丁；萃取和透析可以进一步去除杂质，得到高纯度的烟草原生质体粉末。

应用前景作为一种重要的生物资源，烟草原生质体在未来的应用前景广阔。

烟草原生质体可以作为药物开发的重要原料，用于制备尼古丁药物。

烟草原生质体中的尼古丁是一种天然的杀虫剂，可以用于生产绿色、无残留的化妆品和食品添加剂。

本氏烟草(N。

benthamian）瞬时表达及相关实验方法:一、农杆菌介导的烟草瞬时转化：A、实验步骤：1、根据实验需要，将所要表达的基因克隆到含有不同标签的双元载体中，并转化农杆菌。

2、将新活化的农杆菌单克隆接种到含有相应抗生素的YEP中，28℃,200rpm过夜.*估算时间，防止农杆菌液浓度超过1OD,否则会影响转化效率。

3、当菌液OD值介于0.6~1.0之间时,1000g，5min离心收集农杆菌。

4、用2ml Induction medium（without AS)轻柔重悬农杆菌，然后再次离心收集菌液。

5、重复步骤4。

6、所得沉淀用1ml Induction medium 重悬。

7、室温放置1～4小时8、测OD值，根据实验需要，配置侵染液(组合详见下文）。

9、用不加针头的注射器将侵染液注射进6～8周大的本氏烟草叶片中。

＊使用注射器时注意安全,防止针头扎到手，使用完的注射器要把针头套套上再扔，或者将针头放到注射器里面，避免伤害他人；注射时应戴乳胶手套并在每次注射完成后清洗手套，防止交叉污染。

B、试剂：Induction medium：MES—KOH PH 5。

7 10nMMgCl210mMAS 200uM推荐提前配制母液1M MES-KOH PH5.7 过滤灭菌，4℃保存，用时稀释100倍。

1M MgCl2 过滤灭菌，4℃保存，用时稀释100倍.0.2M AS 溶于DMSO 有机溶剂专用滤膜过滤灭菌，分装（避免反复冻融），—20℃。

用高压灭菌的超纯水稀释。

C、关于表达时间：烟草瞬时表达系统中蛋白的表达可以维持比较长的时间，一般注射24小时之后到一周之内都会有表达。

严格来讲需要摸索每个蛋白的最佳表达时段，但一般注射后48小时至72小时不同蛋白表达量都比较可观，不要错过。

D、关于侵染液浓度：推荐每个菌株的浓度在0.1~0.2之间.过高的农杆菌浓度会引起叶片萎蔫甚至枯萎。

利用农杆菌侵染烟草进行体内瞬时表达的方法[精华提要]通常，我们可以利用烟草的瞬时表达系统来观察感兴趣蛋白的亚细胞定位（通过与绿色荧光蛋白构成融合蛋白）。

同时，还可以检测蛋白的表达量。

这一个过程是通过农杆菌作为一个工具将目的基因整合到到烟草的细胞内的。

材料与试剂1. 携带表达载体的农杆菌菌株（通常表达载体由35S启动子驱动）2. 2-4周的烟草植株3. LB培养基4. 乙酰丁香酮5. 2-(N-吗啉代) 乙磺酸6. 抗生素7. 注射器工具1. 50ml离心管2. 光谱仪3. 紫外灯4. 荧光显微镜步骤：1. 挑取单克隆于5mlLB液体培养中，28-30°C震荡培养。

通常，LB中加入100ug/ml 庆大霉素（农杆菌株GV3101携带抗性），50ug/ml大观霉素（载体携带）。

2. 将1ml过夜培养的农杆菌转接到25mlLB液体培养基中（加有与1相同的抗生素，另外加入高压灭菌的乙酰丁香酮）。

3. 检测过夜培养的菌液OD600的值。

4. 5000g，15分钟集菌，用重悬液重悬菌体，最终OD600为0.4。

5. 室温放置2-3h后注射烟草。

6. 将侵染液装入5ml注射器内，用拇指按压注射器反板将液体从叶片下表皮注射到烟草叶片内（勿使用子叶）。

注射后，烟草叶片会出现湿润的现象。

7. 注射后2-5天，在便携式长波长紫外灯下检测GFP荧光信号（只适用于荧光很强的叶片）。

8. 通过荧光显微镜或者激光共聚交荧光显微镜检测GFP信号。

同时，可以提取蛋白，检测蛋白的含量。

配方1. 加有相应抗生素的LB液体培养基（一种抗生素是菌株携带，一种为载体携带）。

2. 乙酰丁香酮（100mM 溶于乙醇，-20°C储存）。

3. 1M MgCl24. 重悬液(10mM MgCl2,10mM 2-(N-吗啉代) 乙磺酸(pH5.6)高温高压灭菌15分钟，100uM 乙酰丁香酮，高温高压灭菌)。

5. 乙酰丁香酮（来自Aldrich）：又名3’,5’-二甲基-4’-羟基苯乙酮，或4’-羟基-3’,5’-二甲基苯乙酮。

烟草瞬时表达实验原理利用农杆菌将外源基因导入到烟草叶片中进行表达，可以借此进行蛋白的亚细胞定位、蛋白互作（BiFC）和蛋白的纯化等实验操作。

在荧光蛋白(YFP、GFP、Luciferase 等)的两个β 片层之间的环结构上有许多特异性位点可以插入外源蛋白而不影响荧光蛋白的荧光活性。

BiFC 技术正是利用荧光蛋白家族的这一特性，将荧光蛋白分割成两个不具有荧光活性的分子片段，再分别与目标蛋白融合表达。

如果两个目标蛋白因物理相互作用而靠近，就使得荧光蛋白的两个分子片段在空间上相互靠近，重新形成有活性的荧光基团而发出荧光。

试剂：500 mM MES (pH5.6)、100 mM MgCl2、100 mM 乙酰丁香酮(acetosyringone, AS)、LB 培养基、50 mg/mL Kana (母液)、25 mg/mL Rif (母液)、100 mg/mL Amp (母液)。

仪器：一次性注射器、恒温摇床、分光光度计、普通离心机、激光共聚焦显微镜。

配方：500 mM MES (pH 5.6)：称取9.75 g无水MES，用去离子水溶解，经NaOH调pH至5.6，定容至100 mL，0.22 μm过滤器过滤除菌后，于4 °C保存。

100 mM 乙酰丁香酮：称取0.196 g乙酰丁香酮，用5 mL DMSO (二甲基亚砜) 溶解，再用去离子水定容至 10 mL，0.22 μm过滤器过滤除菌后，分装1 mL至1.5 mL的EP管中，于-20 °C 保存。

50 mg/mL Kana (母液)：称取1 g的Kana粉末，用去离子水溶解并定容至20 mL，0.22 μm过滤器过滤除菌后，分装1 mL至1.5 mL的EP管中，于-20 °C 保存。

100 mg/mL Amp (母液)：称取2 g的Amp粉末，用去离子水溶解并定容至20 mL，0.22 μm过滤器过滤除菌后，分装1 mL至1.5 mL的EP管中，于-20 °C 保存。

Botanical Research 植物学研究, 2015, 4, 25-31Published Online March 2015 in Hans. /journal/br/10.12677/br.2015.42004Establishment and Optimization ofAgrobacterium-Mediated TransientGene Expression System in TabaccoLiwei Wen, Hongliang Zhu*Department of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, BeijingEmail: 210824@, *hlzhu@Received: Apr. 15th, 2015; accepted: May 1st, 2015; published: May 6th, 2015Copyright © 2015 by authors and Hans Publishers Inc.This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY)./licenses/by/4.0/AbstractTo establish and optimize a transient expression system in Nicotiana benthamiana, the method was developed with the β-glucuronidase (GUS) and Ripening Inhibitor (RIN) as marker genes. Us-ing the agrobacterium-mediated transformation method, GV3101 was used for the effects of dif-ferent bacteria concentration on the efficiency of protein transient expression in Nicotiana ben-thamiana. Observed by the results, a higher transient expression level of GUS & RIN gene could be obtained as OD600 value of A. tumefaciens for intiltration 1.0. The entire process only took 25 days from sowing seed to protein analysis. Therefore, this method is simple and rapid. It has a potential application in dissecting gene expression and function in Brassica napus.KeywordsTobacco, Leaf, Transient Expression System烟草基因瞬时表达体系的建立与优化研究文莉薇，朱鸿亮*中国农业大学，食品科学与营养工程系，北京Email: 210824@, *hlzhu@*通讯作者。

烟草瞬时表达
（1）挑起单个农杆菌菌落，接种到3ml LB液体培养基（含抗生素）在200r/min，28℃摇床培养过夜。

（2）将上述过夜培养菌液在常温，4000r下离心2min，收集菌体。

（3）用渗透培养液( 10 mmol MgCl2 )重新悬浮沉淀的农杆菌细胞（一般需要1~1.5mL渗透培养液）。

调节浓度OD600至0.5~1.0 (可大概估计)。

（4）烟草植株无一定大小要求，一般4~5叶期，已经生长一个月左右的本氏烟比较合适，注射前要充分吸水30min使其气孔张开，然后用1mL的无针头的注射器吸取悬浮有农杆菌的渗透培养液从烟叶背面注入叶片内。

（5）将处理过的烟草放回培养室，照常管理。

（6）制片，观察叶背面荧光表达情况。

农杆菌介导的烟草瞬时表达影响因素研究孙蔓莉;孟玉玲;张强;黄桂艳;单卫星【摘要】通过探究根癌农杆菌(Agrobacterium tume aciens)介导的烟草瞬时表达体系的影响因素,确定烟草瞬时表达的最佳条件,为目的基因的功能研究提供技术支持.利用马铃薯晚疫病抗性基因RB和致病疫霉菌效应基因Avrblb1作为报告基因,采用农杆菌介导的注射渗透法,摸索农杆菌菌悬液OD600值和菌系(遗传背景)、烟草品种及其生长时期等因素,确定烟草高效的基因瞬时表达条件.研究结果表明:介导烟草基因瞬时表达的根癌农杆菌菌悬液适宜OD600值为0.3～0.8;在菌悬液OD600值为0.1及以上时,AGL1、GV3101和C58C1介导的报告基因瞬时表达效率相似,均引发较强的叶片坏死反应;在农杆菌菌悬液0D600值小于0.1时,AGL1介导的瞬时表达效率最高.测试的烟草品种都具备较高的瞬时表达效率,苗龄6～8周的烟草适合分析.通过测试农杆菌菌悬液OD600值和菌系(遗传背景)、烟草品种及其生长时期等因素,确定本氏烟和普通烟均可实现基因高效瞬时表达的条件.【期刊名称】《西北农业学报》【年(卷),期】2015(024)001【总页数】5页(P161-165)【关键词】烟草;基因瞬时表达;注射渗透法【作者】孙蔓莉;孟玉玲;张强;黄桂艳;单卫星【作者单位】西北农林科技大学植物保护学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学植物保护学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学植物保护学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学生命科学学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学植物保护学院,陕西杨凌712100;旱区作物逆境生物学国家重点实验室,陕西杨凌712100【正文语种】中文【中图分类】S432.2在植物组织中可通过2种方法表达异源基因：稳定表达和瞬时表达[1]。

瞬时表达较前者具有简单、快速、周期短、准确等优点，表达效率稳定，转化率高，并且不产生可遗传的子代，生物安全性高[2]。

利用烟草花叶病毒瞬时表达目的基因一、实验目的蛋白瞬时表达方法已被用于烟草当中，例如来定位绿色荧光蛋白等标记物标记的目的蛋白的亚细胞位置，或者在不利用转基因植物的条件下生产和诱导大量蛋白。

可利用基因工程改造后的根癌农杆菌来引导目的基因进入烟草叶中进行表达。

二、实验原理烟草花叶病毒(TMV)表达载体30B是一个目前广泛应用的植物病毒表达载体，但用其生产外源蛋白时，必须先将它体外转录成RNA，才能被用来接种宿主植物。

但RNA体外转录费用昂贵、操作复杂。

用农杆菌接种法(a-groinnoculation)接种该病毒载体，即将30B cDNA 置于花椰菜花叶病毒(CaMV)的35启动子和终止子之间，再将整个表达框架插人到农杆菌T-DNA的左边界和右边界之内，构建成质粒p35S-30B，将转人该质粒的农杆菌注射到植物的叶片中，30B cDNA随T-DNA进人植物细胞后，被转录成可自我复制的RNA形式，进而发生系统侵染。

为了检测此接种方式的可行性，绿色荧光蛋白(GFP)报告基因被克隆到p35S-30B中，构建成p35S-30B:GFP，用含有该质粒的农杆菌进行注射操作。

三、实验试剂和仪器1. 带有病毒表达载体的农杆菌菌株(通常由花椰菜花叶病毒35S启动子驱动)2. 健康的烟草(Nicotiana benthamiana)植物(3-4周龄)3. MES / KOH(pH=5.6)4. 氯化镁5. 乙酰丁香酮6. 相应抗性的LB培养基四、实验步骤1、准备激活缓冲液配制母液MgCl2 1 M; MES (pH 5.6) 100 mM; 乙酰丁香酮(Ace)100 mM。

使用时，每1 ml 溶液中加入888 μl无菌水，10 μl MgCl2 1 M，100 μl MES (pH 5.6) 100 mM，2 μl乙酰丁香酮(Ace) 100 mM。

2、挑克隆挑取重组农杆菌单斑接种于含有Kan (50 mg/l) 和Rif (50 mg/l) 抗性的LB 培养基中28℃过夜振荡培养；然后1:100转接到相同抗性的LB培养基中，生长至对数生长期(OD600值约为0.6-0.8)，经6000 rpm离心5 min收集菌体3、制备菌液用含终浓度为10 mM MgCl2，10 mM MES (pH=5.6)，200 μM乙酰丁香酮(Ace)的无菌水重悬浮，调整菌液浓度至OD600=0.5或者根据需要调整；在室温下放置3 h以上。

亚细胞定位之烟草转化方法烟草是常见的植物模型，被广泛应用于植物生物学研究中。

研究人员通常通过烟草转化方法，将外源基因导入烟草中，实现对基因的功能研究或产生转基因烟草植株。

烟草转化方法通常包括两个步骤：外源基因构建和烟草转化。

首先，需要构建一个携带外源基因的转化载体。

这个载体通常包含一个启动子、外源基因和终止子。

启动子可以驱动外源基因的转录，终止子可使转录终止。

外源基因可以是一个编码蛋白质的序列，也可以是一个编码RNA或其他功能分子的序列。

构建好转化载体后，接下来可以通过烟草转化方法将其导入烟草中。

烟草转化方法有多种，包括农杆菌介导转化、基因枪法等。

其中，农杆菌介导转化是最常用的方法之一、农杆菌介导转化是利用农杆菌的特性，将外源基因导入烟草细胞中。

首先，需要将转化载体与农杆菌进行共转化，形成转化菌。

接着，将转化菌与烟草叶片进行共同培养，利用农杆菌T-DNA的转移机制，将外源基因导入烟草细胞中。

经过一段时间的培养，将转化的烟草细胞分离培养，最终获得转基因烟草植株。

利用亚细胞定位技术，可以进一步研究转基因烟草植株中外源基因的定位。

常用的方法包括荧光蛋白标记技术和抗体标记技术。

荧光蛋白标记技术可以通过将外源基因与荧光蛋白基因进行融合，使转基因植株产生荧光蛋白标记，从而观察外源基因在细胞内的定位。

抗体标记技术则是将外源基因编码的蛋白质与特异性抗体结合，通过免疫荧光染色等方法观察外源基因的定位。

通过亚细胞定位技术，可以了解转基因烟草植株中外源基因在不同亚细胞位置的分布。

这对于研究外源基因的功能以及其与其他生物分子的相互作用方式非常重要。

此外，亚细胞定位研究也可以为转基因烟草的功能性研究提供重要线索。

总结起来，烟草转化方法是利用烟草作为植物模型，将外源基因导入烟草中的方法。

通过亚细胞定位技术，可以了解外源基因在转基因烟草植株中的定位，进一步研究外源基因的功能和相互作用方式。

烟草转化方法为研究转基因植物提供了重要的工具和方法。

2.11.1 播种烟草种子用70% 乙醇灭菌30 s，去掉乙醇，无菌水清洗一遍，再用2.5% 次氯酸钠表面消毒7 min，无菌水清洗3-4遍，然后播种于MS基本培养基中。

16 h 光( 50 μmol m-2 s-1)/8 h暗环境下25ºC生长，取4-5叶期左右大小的无菌苗叶片转化。

2.11.2农杆菌的活化和制备（1）用接种环蘸取-80ºC冰箱内保存的含有精氨酸脱羧酶基因的农杆菌涂抹在含50mg/ml Km 的LB平板上划线，放到28ºC的光照生化培养箱中暗培养1-2d；（2）当长出菌落后，用接种环挑取单菌落在含有相同浓度抗生素浓度的LB培养基上划线，放入生化培养箱中28ºC暗培养；（3）2-3d后，将培养基中长出的菌落用镊子刮入不含抗生素的液体MS培养基中，28ºC 200r/min 振荡培养1-2 h；（4）用分光光度计测定菌液的OD600值，并用液体MS稀释，直到OD600=0.4~0.6之间进行侵染。

2.11.3 烟草共培养取苗龄为60d左右烟草的无菌、健壮的、去主脉并用镊子切成5×5cm的叶盘，将其浸入到已经培养好的农杆菌菌液中进行侵染9-12min左右。

然后倒掉菌液，将叶片放到灭菌过的滤纸上吸干菌液，将吸干的叶盘背面朝下，放在放有滤纸的共培养基中进行暗培养3d。

2.11.4选择筛选培养共培养结束后，先用含有400mg/ml头孢霉素的灭菌水清洗叶盘2-3次，用灭菌的滤纸吸干叶盘表面的水分，将叶盘放在筛选培养基中进行筛选培养，一般每周继代一次。

2.11.5生根培养在筛选培养基中筛选2-3周以后，叶盘的周围会分化出抗性芽，当抗性芽长到2-3cm大时，用镊子切下放在生根培养基中进行生根培养。

表15 烟草转化培养基配方Table 15 Culture media used in transgenic tabacco培养基名称组分及含量Km（100mg/ml）将km粉末用水溶解，过滤灭菌，-20℃保存Cef (400mg/ml) 将Cef粉末用水溶解，过滤灭菌，-20℃保存MS基本培养基大量100ml/L，微量10ml/L，甘氨酸10ml/L，肌醇10ml/L，铁盐10m/L，VB 10ml/L，蔗糖35g/L，定容至1L，调PH值5.8共培养培养基MS基本培养基+ 6-BA （2.25mg/L）+ NAA (0.3mg/L)筛选培养基MS基本培养基+ 6-BA (2.25mg/L) + NAA(0.3mg/L) + Km(100mg/L)+ Cef(400mg/L)生根培养基MS基本培养基+ NAA(0.3mg/L) + Km(100mg/L)+ Cef(400mg/L)。

烟草瞬时表达原理烟草瞬时表达原理是指烟草植株在生长发育过程中，通过信号传导途径，调控基因表达和代谢途径，从而快速响应外界环境变化，实现瞬时适应和生存优势的一种生理机制。

烟草植株在面对环境胁迫、病虫害和营养物质供应等外界压力时，能够快速调整生长发育和代谢途径，以适应环境变化，保证植株的生存和繁衍。

烟草瞬时表达原理的核心是信号传导途径。

烟草植株通过感知外界环境信号，如光照、温度、湿度、营养物质浓度等，启动内部信号传导途径，进而调控基因表达和代谢途径。

这一过程涉及多种信号分子和信号通路的参与，包括激素信号、离子信号、氧化还原信号等。

这些信号分子在植物体内形成复杂的信号网络，通过相互作用和调控，最终影响基因表达和代谢途径的调控。

烟草瞬时表达原理的实现依赖于基因表达和代谢途径的调控。

烟草植株在面对外界环境变化时，会启动特定的基因表达途径，调控相关基因的表达水平，以实现对环境的快速适应。

同时，烟草植株还会调整代谢途径，重新分配营养物质和能量，以满足生长发育和抵御外界压力的需要。

这些调控过程涉及到多种基因和代谢产物的参与，形成复杂的调控网络。

烟草瞬时表达原理的研究对于揭示植物生理机制、改良烟草品种、提高烟草产量和质量具有重要意义。

通过深入研究烟草瞬时表达原理，可以发掘植物在面对环境胁迫时的生理适应机制，为培育抗逆烟草品种提供理论依据和实践指导。

同时，还可以通过调控烟草瞬时表达原理，提高烟草产量和品质，促进烟草产业的可持续发展。

总之，烟草瞬时表达原理是烟草植株在面对外界环境变化时的一种生理适应机制，涉及信号传导途径、基因表达和代谢途径的调控。

通过深入研究和理解烟草瞬时表达原理，可以为烟草品种改良和产业发展提供重要的理论和实践支持。

瞬时表达本实验室一般采用瞬时表达的方法研究两个基因是否有相互作用（如转录因子是否能够诱导相应基因的表达）。

1.培养室中种植小叶烟草（Nicotiana Ben？，俗称本氏烟草？），一般约一周后萌发，约一个半月后可以用于瞬时表达实验。

注意：小叶烟草的生长状态非常重要，直接决定了烟草瞬时表达实验的效果。

需要选取浓绿、厚实的叶片进行实验。

2.将需要检测的质粒分别转化农杆菌GV3101（庆大霉素抗性，50ug/ml；菌株不同，所对应的抗性也不同），在双抗板上生长两天后可以看到农杆菌菌落。

挑选单克隆，转接至0.5-2ml加有合适浓度双抗的LB液体培养基（离心管或者试管），28℃培养过夜，菌液PCR鉴定；转接生长良好的菌液至新的双抗LB液体培养基（试管或者锥形瓶），培养至OD600约0.6-0.8左右。

3.配制烟草瞬时表达的注射缓冲液，配方如下：0.5M MES 1ml20mM Na3PO4 1mlD-葡萄糖50mg1M 乙酰丁香酮1ul水（一般情况下最先加入）补齐至10ml注意：MES与Na3PO4溶液容易染菌，染菌后需要重新配制母液。

乙酰丁香酮需要用N-N-二甲基甲酰胺溶解后分装，尽可能避免反复冻融。

注射缓冲液需要现配现用。

4.将农杆菌菌液用EP管分装后3000rpm离心10分钟（4℃或者室温均可），去上清（尽可能清除干净）；利用注射缓冲液重悬后3000rpm离心10分钟，去上清，重复共两次。

注射缓冲液重悬。

5.利用步骤4中的农杆菌重悬液，配制不同的农杆菌组合，使农杆菌菌液的最终浓度达到OD600 0.1-0.5之间。

利用一次性注射器，将农杆菌菌液注射至小叶烟草叶肉，吸水纸吸去叶片表面多余的菌液，做好标记。

注意：（1）若需要观测蛋白的亚细胞定位，农杆菌菌液的浓度OD600在0.1左右会更好，浓度过高会导致背景信号强或者假象；检测样本与对照间的浓度要保持统一，比如35S::TF-A+ProB::GUS组合与ProB::GUS进行比较，两种注射液中ProB::GUS的浓度要相同；农杆菌OD600过高会导致叶片萎蔫死亡；（2）由于农杆菌菌液对叶片造成伤害，所以注射后一天内，叶片会较为萎蔫，再经过一段时间后会逐渐恢复正常。