基于绿色荧光蛋白瞬时表达的植物亚细胞定位方法_于一帆

绿色荧光蛋白(GFP)标记亚细胞定位绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP)是一种自然存在于海洋水母Aequorea victoria中的荧光蛋白，其拥有强烈的绿色荧光。

由于其广泛应用于细胞生物学和生物化学领域，GFP已经成为研究生物过程和信号传递的强有力工具。

GFP的结构由238个氨基酸组成，具有一个单独的蛋白质区域，称为圆柱螺旋(Beta-can)。

GFP基因含有GFP编码序列，该序列通过表达可以产生GFP蛋白质。

GFP的荧光性质是由三个氨基酸残基组成的染色体枢纽部分决定的，即丝氨酸(Tyr66)、谷氨酸(Pro68)和脯氨酸(Ala80)。

在GFP的自然状态下，并不发出荧光。

但当该基因被转录和翻译成蛋白质之后，在有氧条件下，GFP的氨基酸序列会发生类似于玉米的光合作用过程，使得GFP的荧光激活。

在细胞生物学领域，GFP被广泛用作标记工具，以帮助研究人员观察细胞内部的某些组分或结构。

研究人员可以通过将GFP基因与目标蛋白的基因融合，使目标蛋白在表达时也表达GFP。

由于GFP的荧光性质，这样就可以通过荧光显微镜直接观察到目标蛋白的位置和分布。

通过GFP技术，科学家们得以研究细胞核或细胞器在发育过程中的变化，以及探索细胞活动的机制。

此外，通过将GFP基因与多个目标蛋白的基因融合，科学家们可以标记多种细胞结构，并观察它们在细胞活动过程中的相互关系和动态变化。

除了在细胞生物学领域的应用外，GFP还被广泛应用于分子生物学、生物化学、药物筛选和基因治疗等领域。

由于GFP的高度稳定性和荧光强度，它可以作为生物化学实验中定量和定位特定蛋白质的工具。

此外，GFP作为标记基因在基因治疗研究中也发挥着重要作用，用于追踪和监测基因表达和转导的进程。

尽管GFP已经成为生物科学研究中广泛应用的工具，但也存在一些局限性。

首先，GFP的结构和功能对温度和酸碱度非常敏感，因此在特殊环境中的应用可能受到限制。

植物蛋白质的亚细胞定位研究进展一、本文概述植物蛋白质在细胞中的亚细胞定位对于理解其生物功能及在植物生命活动中的作用至关重要。

近年来，随着生物技术的飞速发展，尤其是分子生物学、遗传学和蛋白质组学等领域的突破，植物蛋白质亚细胞定位的研究取得了显著进展。

本文旨在综述当前植物蛋白质亚细胞定位的研究现状，探讨其方法和技术，分析面临的挑战，并展望未来的发展趋势。

文章首先简要介绍了植物蛋白质亚细胞定位的基本概念和研究意义，随后综述了目前常用的定位方法和技术，包括生物信息学预测、荧光标记、免疫电镜等。

接着，文章重点分析了近年来在植物蛋白质亚细胞定位研究方面取得的重要成果，包括新发现的定位模式、定位机制以及定位与功能关系的研究等。

文章对当前研究中存在的问题和挑战进行了讨论，并提出了未来研究的方向和建议。

通过本文的综述，希望能够为植物蛋白质亚细胞定位领域的研究者提供有价值的参考和启示。

二、植物蛋白质亚细胞定位方法随着分子生物学和生物技术的快速发展，植物蛋白质的亚细胞定位研究取得了显著的进步。

亚细胞定位是理解蛋白质功能的关键环节，它有助于我们揭示蛋白质在细胞内的确切位置，从而推测其可能参与的生物过程。

目前，植物蛋白质亚细胞定位的方法主要包括生物信息学预测、荧光标记显微观察以及细胞分馏技术等。

生物信息学预测：这是一种基于计算机算法的方法，通过分析蛋白质的氨基酸序列，预测其可能的亚细胞定位。

这种方法具有快速、高效的特点，可以在蛋白质表达之前提供初步的定位信息。

目前，已有多个在线工具和数据库可供使用，如TargetP、WoLF PSORT等。

荧光标记显微观察：这种方法通过将荧光基团与特定的蛋白质标记结合，然后利用显微镜观察荧光信号在细胞内的分布，从而确定蛋白质的亚细胞位置。

常用的荧光标记技术包括绿色荧光蛋白（GFP）标记、免疫荧光标记等。

这种方法直观、准确，是目前研究蛋白质亚细胞定位的主要手段之一。

细胞分馏技术：这是一种基于生物化学原理的方法，通过利用不同细胞组分在物理和化学性质上的差异，将细胞内的各种组分进行分离和纯化，从而得到特定的亚细胞组分。

绿色荧光蛋白(GFP)标记亚细胞定位一、原理利用绿色荧光蛋白(GFP)来示踪胞内蛋白的技术。

利用GFP融合蛋白技术来进行活细胞定位研究是目前较为通行的一种方法，在光镜水平进行研究，不需要制样，没有非特异性标记的影响。

并且GFP的分子量为27kD，经激光扫描共聚集显微镜激光照射后，可产生一种绿色荧光，从而对蛋白质进行精确定位。

激光扫描共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope, LSCM, 以下简称共聚焦显微镜）因其独特的设计原理，有效地排除了非焦平面信息，提高了分辨率及对比度，使图像更为精确清晰，因此极其适于进行活细胞内蛋白质、核酸等定位及活体动态研究。

二、主要步骤1．真核表达载体的构建①引物设计利用引物设计软件，根据pEGFP-N1的酶切位点设计目的基因引物：②载体构建将PCR产物酶切后插入pEGFP-N1，得到表达目的基因与EGFP融合蛋白质的真核表达载体。

2．转染真核细胞当细胞生长到对数生长期时，接种到共聚焦显微镜专用的玻璃底培养皿（35mm petri dish，10 mm Microwell）中，培养过夜。

当细胞贴壁率达到30%~50%时，将表达载体质粒2ug和脂质体(Lipofectamine2000) 2ml分别溶于100 ml无抗生素、无血清的DMEM培养基中，充分混匀后，室温放置15 min，再将两种溶液充分混匀，室温放置30 min。

同时用无血清、无抗生素的DMEM洗涤待转染的培养细胞2~3次，向DNA-脂质体混合物中加入800 ml无抗生素、无血清的DMEM培养基，混合后加入到培养细胞中。

培养皿放入37℃孵箱孵育6~8 hr后吸去双无培养液，加入2~3 ml含抗生素和10% FCS的DMEM完全培养基，继续培养24~72 hr。

4．激光扫描共聚焦显微镜观察将上述细胞分别在24、、36、48、72小时用共焦显微镜观察，采用激光扫描共聚焦显微镜，激发波长为488nm，采取图像。

绿色荧光蛋白瞬时表达的融合蛋白构建方法作者：王颜来源：《科学与财富》2019年第03期摘要：叶绿体是植物细胞的重要细胞器，是植物光合作用的场所。

每个叶绿体蛋白质按照其功能分布在叶绿体的不同区域。

根据结构组成和生化特性将叶绿体分成3个部分，叶绿体被膜、叶绿体基质和类囊体。

植物蛋白的亚细胞定位是功能基因组学的重要内容。

近几年来，常用的叶绿体蛋白质亚细胞定位方法是以GFP及其突变体为报告基因的融合报告基因定位法。

综述了基于绿色荧光蛋白瞬时表达的融合蛋白构建方法以及植物材料选择，同时进行比较和分析，并改进不足之处。

关键词：叶绿体蛋白质；融合蛋白构建叶绿体是植物所特有细胞器，是光合作用的重要场所。

据估计在高等植物中大约有21000-25000个蛋白，叶绿体蛋白占蛋白总数的10%-25%[1]，充分说明了叶绿体对植物的重要性。

由于叶绿体是半自主性细胞器，其叶绿体蛋白大部分都是由核基因编码，小部分由叶绿体基因编码[2-3]。

叶绿体蛋白主要分为以下几种，叶绿体膜蛋白、叶绿体基质蛋白、类囊体膜蛋白和类囊体腔蛋白。

根据生化特性以及结构组成将叶绿体分为以下3个部分：由内被膜和外被膜构成的叶绿体被膜、叶绿体基质、类囊体膜和类囊体腔组成的类囊体[4]。

本研究对近几年常用的叶绿体蛋白质亚细胞定位融合蛋白构建方法以及植物宿主载体选择归纳总结、提出优缺点并对不足之处进行改进，为得到更高效的叶绿体蛋白质亚细胞定位方法提供信息。

1.融合蛋白构建方法1.1农杆菌转化法农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。

其转化原理是将携带外源基因的DNA插入到Ti 质粒的T-DNA区，借助农杆菌感染组织细胞，使外源基因整合到植物的基因组中，再利用细胞和组织培养技术得到转基因植株[5]。

从当前国内外研究现状来看，叶绿体蛋白质定位的植物瞬时表达系统中，农杆菌转化技术的浸花法和叶片注射法应用较为广泛。

1.1.1浸花法浸花法是近几年发展起来的一种快速、高效、稳定的非组织培养转基因方法，是由Clough和Bent在真空渗透法的基础之上演变而来[6]。

植物亚细胞定位（范文2篇）以下是网友分享的关于植物亚细胞定位的资料2篇，希望对您有所帮助，就爱阅读感谢您的支持。

植物亚细胞定位（1）第42卷第4期东北农业大学学报42(4):83~87植物亚细胞定位载体卡盒pCEG的构建及验证朱丹，王希，朱延明*，陈超，李勇，柏锡，才华，纪（东北农业大学生命科学学院，哈尔滨150030）巍摘要：GFP基因被广泛地应用于植物转基因以及基因功能验证研究，然而构建与GFP融合的植物表达载体，常会因酶切位点难以选择，而使得载体构建过程复杂，周期长。

以含GFP的质粒pCAMBIA-1302为基础，消除此质粒本身的多克隆位点（MCS），并在此质粒GFP基因序列前插入原核表达载体pET-32b的多克隆位点，构建了植物GFP亚细胞定位载体卡盒pCEG；采用农杆菌介导的转化方法，将此载体卡盒pCEG导入模式植物烟草叶片中进行瞬时表达，用激光共聚焦显微镜观察GFP蛋白的亚细胞定位情况，发现GFP蛋白均匀的在细胞质和细胞核中表达，证明此载体卡盒可用于植物基因的亚细胞定位分析，并为构建目的基因与GFP融合的植物表达载体提供了很多可用的酶切位点，对植物基因功能验证提供了分子操作简便的植物表达载体卡盒，具有重要的利用价值。

关键词：载体卡盒构建；亚细胞定位；GFP；烟草中图分类号：Q782文献标志码：A文章编号：1005-9369（2011）04-0083-05 Constructionandapplicationofaplantsubcellularlocalization vectorboxofpCEG/ZHUDan,WANGXi,ZHUYanming,CHEN Chao,LIYong,BAIXi,CAIHua,JIWei(CollegeofLifeSciences,NortheastAgriculturalUniversit y,Harbin150030,China)Abstract:GFPgenewaswidelyappliedinthetransgenicplants andgenesfunction’sprovingstudy.However,theconstructionofGFPfusedplantexpressionvector swasalwayscomplicatedandtimeconsumingduetothehardchoo eplasmidpCAMBIA-130 2whichincludedGFPgeneasaoriginalvector,andeliminateditso wnmultipleclonesite(MCS),andtheninsertedpET-32b’smultip leclonesiteinfrontofGFPgenesequences,namedtheeventualpla ntGFPsubcellularlocalizationvectorboxpCEG.ByAgrobacteri um-mediatedtransformationmethod,pCEGinstantaneousexp ressedintobaccoleaves,andGFPproteinsubcellularlocalization wasobservedbylaserconfocalmicroscope.Theresultdisplayedt hattheGFPproteinsexpressedinbothcytoplasmandnucleus,thi smeansthepCEGboxcanbeusedconvenientlyforplantgenessub cellularlocalizationanalysisandprovidealotofusablerestrictio nenzymecuttingsiteforplantgenesfusionedwithGFP,andthepC EGboxisconvenientforplantgenesfunctionanalysisandhasgre atusevalue.Keywords:constructionofvectorbox;subcellularlocalization ;GFP;tobacco在基因的功能研究过程中，外源重组基因表达产物的功能与其在宿主细胞中的定位有重要的关系，特别是对于真核细胞，蛋白质位于不同的细胞部位所行使的功能也不同，所以研究其在宿主细胞收稿日期：2011-01-12基金项目：国家高科技发展计划（863计划）（2008AA10Z153）；国家自然科学基金资助项目（30570990）；黑龙江省科技厅重大攻关项目（GA06B10）；黑龙江省教育厅科技项目（11521024）；黑龙江省教育厅科技项目（11521021）作者简介：朱丹（1986-），女，硕士研究生，研究方向为植物基因工程与分子生物学。

ｘＡ２ｌ蛋白质的亚细胞定位及其定位决定结构域的鉴定１．４试验目的图１．ｐＧＦＰ舯５７的物理图谱Ｆ逗．２ｐ时ｓＥａＩｒｎａｐｏｆｐＧＦＰｓ６”本试验是利用融合绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）报告基因定位技术，预实现的目标如下：（１）克隆全长ｘａ２１ｃＤＮＡ｝，称之为勘２』儿，构建溉ｚ２』凡．曲融合基因的表达载体后转化洋葱表皮细胞表达，在激光共聚焦显微镜下，通过检测融合蛋白绿色荧光在细胞中的分布来进行ｘＡ２１激酶蛋白的亚细胞定位；（２）根据ｘＡ２ｌ蛋白质结构分区的特点和参考其它蛋白质定位的研究结果，分析推断某些被认为重要的结构域：丝氨酸，苏氨酸激酶区、跨膜区、富亮氨酸重复区和Ｎ＿端信号肽可能对亚细胞定位产生关键作用，尤其是跨膜区可能是定位的决定结构域。

基于这些分析，试验另外克隆４个非全长的渤２』目的片段，它们是以ｘａ２ｌｃＤＮＡ＋序列为蓝本，５’端序列完全一致、３ｉ端逐次缺失被认为是重要的结构域编码序列。

同样方法获得激光共聚焦定位结果，通过与（１）的定位结果差异比较分析，来找出ｘＡ２１的定位决定结构域。

依据这些研究结果，分析总结ｘＡ２ｌ蛋白质亚细胞定位相关的问题。

１．５研究展望本试验采用绿色荧光蛋白标记技术转基因于洋葱表皮细胞中进行体外定位，这样的方法目前已发展成熟并且应用广泛，在定位方法中具有～定的代表性。

关于蛋白质亚细胞定位已经建立了多种技术方法，如：免疫组织化学定位法、蛋白质组学定位技术以及共分离标记酶辅助定位法，还有可以结合生物信息学预测蛋白亚细胞定位。

这些方法有些比较容易进行体内定位，有些只能依赖于体外定位的方法。

体内定位最接近于真实的蛋白质动态特征和功能本质。

参考１．２中的分析，如果能够采用免疫组织化学定位法将在水稻本体内表达的ｘＡ２１蛋白质（含ｃ．Ｍｙｃ抗原决定簇，见７ｘＡ２ｌ蛋白质的亚细胞定位及其定位决定结构域的鉴定２．３制各ｘ以Ｊ的五个目的片段２．３．１ｘＡ２１蛋白质的结构域分析和目的片段克隆策略ＸＡ２１（不含ｃ．Ｍｙｃ抗原决定簇）是一个由１０２５个氨基酸构成的类受体蛋白激酶，为了研究的需要，研究者们在妇２Ｊ的开放式阅读框中用ＤｒａⅢ插入了４８ｂｐ的ｃ—Ｍｙｃ抗原决定簇标签编码序列及衔接头序列”。

植物原生质体在分子细胞生物学研究中的应用作者：肖政徐艳琴罗念周银来源：《广西植物》2020年第04期摘要：植物原生质体是去除了细胞壁的裸露细胞，其具有细胞全能性，现广泛应用于植物分子细胞生物学的研究中，可以大大缩减实验周期，并有助于得到体内实验的實时检测数据。

该文除了介绍植物原生质体的提取和纯化方法外，还对国内外利用各种植物的原生质体进行细胞瞬时转化、亚细胞定位、细胞融合和大分子复合物相互作用等试验进行了总结和讨论。

植物原生质体还可用于基因表达模式的实时检测，并作为生物反应器的受体细胞进行代谢物的体外生产。

此外，还对当前该技术所面临的瓶颈进行了分析，为植物原生质体在分子细胞生物学领域的应用提供帮助，为技术的优化和推广提供参考。

关键词：植物原生质体，瞬时转化，亚细胞定位，细胞融合，实时检测中图分类号： Q942 文献标识码： A文章编号： 1000-3142（2020）04-0576-07Abstract： Plant protoplasts are naked cells without cell walls. They have been extensively applied in the researches of plant molecular and cell biology for their totipotency， which could greatly shorten the experimental periods and help to get massive effective and real-time experimental detection data in vivo. In this article， in addition to introduce the purification of plant protoplasts，we mainly summarized the application of plant protoplasts in the respects of transient transformation， subcellular localization， cell fusion and macromolecular complex interaction. Plant protoplasts could also be used to survey the expression pattern of gene in real-time detection， as well as the target cells for the production of metabolites in bioreactors. Furthermore， we have compared the advantages and disadvantages of plant protoplasts in the current research， which provides new insights into the researches on plant molecular and cell biology. We have also analyzed the difficulties in the application of plant protoplasts， which provides the reference for the optimization and promotion of this technology.Key words： plant protoplasts， transient transformation， subcellular localization， cell fusion， real-time detection植物原生质体是指通过酶解或者机械的方式去除植物细胞壁所获得的细胞。

拟南芥E3泛素连接酶AtARRE与ABI5相互作用分析李褚喆;王博雅;李颖;李旭锋;刘志斌【摘要】为了阐述AtARRE与ABA信号通路关键转录因子ABI5的作用,本研究采用原生质体瞬间表达系统探究了AtARRE蛋白的亚细胞定位,证明AtARRE蛋白定位于细胞核.随后,采用酵母双杂交和GST-Pull down技术分析了AtARRE与ABI5在体外的相互作用,证明AtARRE与ABI5在体外存在相互作用.最后,本研究采用双分子荧光互补实验进一步分析AtARRE与ABI5在体内的相互作用,结果表明共表达AtARRE与ABI5在植物体内存在相互作用.这些结果共同表明AtARRE可能参与了ABI5介导的植物对逆境的响应.【期刊名称】《四川大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2019(056)002【总页数】6页(P363-368)【关键词】拟南芥;E3连接酶;脱落酸;AtARRE;脱落酸不敏感蛋白5【作者】李褚喆;王博雅;李颖;李旭锋;刘志斌【作者单位】四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室 ,成都610065;四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室 ,成都610065;四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室 ,成都610065;四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室 ,成都610065;四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室 ,成都610065【正文语种】中文【中图分类】Q781 引言每年由于非生物胁迫的影响导致农作物降低50%以上的产量,这是世界范围内的作物损失的主要原因之一[1, 2].为了应对非生物胁迫,植物进化出了响应非生物胁迫的调控机制,而转录后调控机制是其中重要的部分[3].泛素化-蛋白酶途径通过转录后水平的调控作用广泛地参与到了植物细胞周期、凋亡等生命活动过程[4].泛素小分子依赖于泛素激活酶E1,泛素结合酶E2和泛素连接酶E3结合到靶蛋白上形成多聚泛素链,被26s蛋白酶识别并降解被泛素化修饰的蛋白.当植物受到逆境胁迫的时候,应对胁迫的蛋白质水平迅速增加,但是蛋白浓度累积到一定程度就会对植物的代谢产生毒害作用.因此,当胁迫消失时,累积的蛋白质需被降解处理,以保持植物体内蛋白的内稳态平衡.RING结构E3连接酶作为泛素化-蛋白酶途在响应非生物胁迫具有重要调节作用,如干旱或盐胁迫[5-9].ABA是中央调控因子在许多植物对环境胁迫的响应过程,例如,ABA起到了极其重要的作用在渗透胁迫[10,11].ABA已被证明调节和参与植物发育(如蛋白质和脂类合成)、许多农艺性状(如种子脱水、休眠、发芽)、生殖生长[12-14].此外,ABA介导植物响应非生物胁迫如干旱胁迫、盐胁迫、冷胁迫、病原生物胁迫[12-15].ABA 信号通路中的正调控因子能够被E3连接酶泛素化,从而通过26s蛋白酶途径降解.ABI5是ABA信号通路中一个的转录因子,其对多种胁迫响应的正调控作用主要通过编码 bZIP 家族蛋白来达成[16].此外,多项研究已经证明ABI5参与了依赖于ABA 的胁迫响应途径,是 ABA 信号通路中极其重要的转录因子[17,18].本实验室前期通过酵母双杂交实验筛选出了和拟南芥ABA信号途径中转录因子ABI5相互作用的蛋白AtARRE,进一步实验表明,与野生型拟兰芥相比,AtARRE的T-DNA插入拟南芥突变体在根长和萌发等表型实验上表现出对外源 ABA 的敏感性,并且突变体中响应 ABA 信号通路下游的标志基因较野生型高.因此,前期的研究结果显示AtARRE参与了ABA信号途径,即负调控ABA介导的逆境响应.本文利用酵母双杂交技术、基于绿色荧光蛋白瞬时表达的植物亚细胞定位方法、GST-Pull down实验和双分子荧光互补法(BiFC)对AtARRE与ABI5的相互作用展开了研究.证实AtARRE与ABI5在体外和植物体内均存在相互作用.2 材料与方法2.1 材料哥伦比亚野生型拟南芥 (Col-0)、本氏烟草(Nicotiana benthamiana),pBI121、pGADT7、pGBKT7-Rec、pGEX-6P-1、pET28a、pSPYNE、pSPYCE载体,农杆菌GV3101、大肠杆菌(E. coli)DH5α菌株、酵母菌AH109菌株、Rosetta菌株,均为实验室保存.GST Resin购于Trans gene,His Resin购于Thermo Fisher.引物合成和测序由擎科生物和华大基因完成.2.2 实验方法2.2.1 目的基因的分离和载体的构建以实验室保存的cDNA为模板,加入Primerstar Max DNA 聚合酶和相应的引物,PCR扩增得到目的基因片段:全长ABI5、AtARRE和截短的ABI5.随后,构建载体:pBI121-AtARRE-GFP、pGADT7-ABI5、pGADT7-ABI5ΔN、pGADT7-ABI5ΔC、pGBKT7-AtARRE、pET28a-AtARRE和pGEX-6P-1-ABI5、pSPYNE-AtARRE、pSPYCE-ABI5、pSPYCE-ABI5ΔC、pSPYCE-ABI5ΔN.2.2.2 原生质体转化取拟南芥叶片切成细丝,放入原生质体酶解液,22 ℃ 黑暗酶解约3 h后加入4 mL 预冷的W5,并用4层纱布过滤.离心去上清,并用4 mL 预冷的W5洗涤两次.弃上清,加入1 mL W5,冰上放置30 min.弃上清,加入1 mL MMg.取10～20 μL pBI121-AtARRE-GFP质粒、100 μL原生质体和110 μL 40%PEG4000,混匀放置20 min.加入440 μL W5终止反应,然后用1 mL W5洗涤原生质体三次,于22 ℃黑暗培养16 h,用荧光倒置显微镜观察.2.2.3 酵母双杂交及X-Gal染色分别共转化载体pGADT7-ABI5、pGADT7-ABI5ΔN、pGADT7-ABI5ΔC和pGBKT7-AtARRE至AH109酵母感受态,将酵母细胞涂布于SD/Leu-Trp-平板上,30 ℃培养3～4 d.取阳性菌落接入液体培养基SD/Leu-Trp-, 30 ℃培养2 d,用0.9%NaCl将样品调至OD600=0.5.将样品稀释10、100、1000倍,分别取5 μL滴定在SD/Leu-Trp-、SD/ His-Trp-Leu-平板上,30 ℃培养3～4 d,观察菌落生长情况.用滤纸覆盖酵母平板并使滤纸与菌落充分接触,用液氮冷冻滤纸.将滤纸和6 mL反应液放入平板,30 ℃放置8～12 h.2.2.4 蛋白质纯化及GST-Pull down 将pET28a-AtARRE和pGEX-6P-1-ABI5转入Rosetta菌株,按照蛋白纯化的步骤诱导并纯化出AtARRE、ABI5、GST蛋白.向EP管加入40 μL GST Resin,再加入ABI5及AtARRE蛋白各5 μg,最后加入Incubation buffer至体系总体积为500 μL,将样品置于4 ℃ 下360°旋转的摇床上旋转2 h.用1mL Washing buffer清洗4～5次,再进行Western Blot检测. 2.2.5 双分子荧光互补将pSPYNE-AtARRE、pSPYCE-ABI5、pSPYCE-ABI5ΔC、pSPYCE-ABI5ΔN载体转入农杆菌,28 ℃培养过夜.离心10 min收集菌体,弃上清,用等量侵染液清洗3次,再用侵染液重悬使OD600=1.0～1.2.静置1 h,取等量上层液体混合,用1 mL注射器以压力注射法共同瞬时转化烟草叶片2 d, 用激光共聚焦显微镜观察.3 结果与分析3.1 AtARRE的亚细胞定位为了确定AtARRE的亚细胞定位,我们克隆了AtARRE基因的cDNA序列,并利用pBI121载体构建了AtARRE与绿色荧光蛋白(GFP)的重组载体pBI121-AtARRE-GFP.运用原生质体转化法将重组载体pBI121-AtARRE-GFP和pBI121-GFP空载体导入拟南芥原生质体,使之瞬时表达并在荧光倒置显微镜下观察在拟南芥原生质体中的荧光信号,以确定AtARRE蛋白的亚细胞定位.如图1所示,瞬时表达结果显示有明显的绿色荧光出现在拟南芥原生质体中,说明pBI121-AtARRE-GFP 融合蛋白载体和空载体均成功转入了拟南芥原生质体并成功表达,并且AtARRE-GFP 融合蛋白的绿色荧光信号存在于拟南芥原生质体的细胞核,而对照GFP则表达在整个原生质体中.该实验结果证明AtARRE蛋白定位于拟南芥细胞核,即AtARRE的表达位置在细胞核中.图1 AtARRE的亚细胞定位Fig.1 Subcellular location of AtARRE3.2 酵母双杂交验证AtARRE与ABI5体外的相互作用为了确定ABI5和AtARRE的相互作用,我们克隆了AtARRE和ABI5基因的全长cDNA序列,并利用pGADT7和pGBKT7-Rec载体构建了重组载体pGBKT7-AtARRE和pGADT7-ABI5.运用酵母双杂交技术共转化重组载体pGBKT7-AtARRE和pGADT7-ABI5,并在SD/Trp-Leu-与SD/ Trp-Leu-His-平板上培养该酵母细胞,观察菌落在SD/Trp-Leu-与SD/ Trp-Leu-His-平板上的生长情况.如图2所示,pGADT7-ABI5+pGBKT7-AtARRE转入酵母后,在SD/Trp-Leu-和SD/ Trp-Leu-His-平板上长出白色、光滑、丘状的菌落,说明酵母转化成功,且ABI5和AtARRE能够在酵母系统中发生相互作用.为了进一步确认ABI5和AtARRE相互作用的位置,我们从ABI5 氨基酸序列的第 271 位将 ABI5 蛋白截短为N端和C端两部分,并构建了重组载体pGADT7-ABI5ΔN和pGADT7-ABI5ΔC.将pGADT7-ABI5ΔN+pGBKT7-AtARRE和pGADT7-ABI5ΔC+pGBKT7-AtARRE转入酵母后,观察菌落在SD/Trp-Leu-与SD/ Trp-Leu-His-平板上的生长情况.如图2所示,pGADT7-ABI5ΔN+pGBKT7-AtARRE和pGADT7-ABI5ΔC+pGBKT7-AtARRE转入酵母后,在SD/Trp-Leu-平板上长出白色、光滑、丘状的菌落,说明酵母转化成功.然而,只有pGADT7-ABI5ΔN+pGBKT7-AtARRE能够在SD/ Trp-Leu-His-平板上长出菌落,而pGADT7-ABI5ΔC+pGBKT7-AtARRE则不能,即ABI5ΔN和AtARRE能够在酵母系统中发生相互作用.综上所述,酵母双杂交初步表明ABI5和AtARRE可以在酵母系统中发生相互作用,且作用的位置在ABI5的C端. 图2 酵母双杂交检测AtARRE与ABI5体外的相互作用Fig.2 Detection of interaction between AtARRE and ABI5 by yeast two hyb rid system in vitro 3.3 GST-Pull-Down验证AtARRE与ABI5体外的相互作用为了确定AtARRE与ABI5体外的相互作用,我们利用载体pGEX-6P-1、pET28a构建了ABI5、AtARRE的重组载体pET28a-AtARRE和pGEX-6P-1-ABI5,并利用原核表达和亲和纯化得到纯度较高的His-AtARRE、GST-ABI5、GST蛋白,然后采用体外GST-Pull Down验证AtARRE与ABI5在体外的相互作用.实验以10% His-AtARRE +GST-ABI5作为实验组,10% His-AtARRE +GST作为负对照,5% Input作为阳性对照.如图3所示,His-AtARRE+GST-ABI5和Input均可见一条单一的目的条带,而对照组His-AtARRE+GST则不能,说明以GST树脂作为亲和材料,GST-ABI5作为诱饵蛋白,能够吸附His-AtARRE蛋白.实验结果证明His-AtARRE和GST-ABI在体外存在相互作用.图3 GST-Pull Down检测AtARRE与ABI5体外的相互作用Fig.3 Detection of interaction between AtARRE and ABI5 by Pull-Down in vitro图4 BiFC检测AtARRE与ABI5体内的相互作用Fig.4 Detection of interaction between AtARRE and ABI5 by BiFC in vivo3.4 BiFC验证AtARRE与ABI5体内的相互作用为了验证AtARRE与ABI5在植物体内的相互作用,我们利用双分子表达载体pSPYNE和pSPYCE构建了ABI5、AtARRE的重组表达载体pSPYNE-AtARRE和pSPYCE-ABI5.利用烟草侵染法将构建好的重组载体pSPYNE-AtARRE和pSPYCE-ABI5共转化至烟草叶片中,培养2 d后用激光共聚焦显微镜观察荧光信号的表达情况.双分子荧光互补实验(BiFC)结果显示共转化pSPYNE-AtARRE+pSPYCE-ABI5能够在烟草叶片细胞中观察到荧光信号,说明AtARRE与ABI5在体内存在相互作用.为了进一步验证AtARRE与ABI5在体内的相互作用的位点,我们构建了重组载体pSPYCE-ABI5ΔC(缺失C端)和pSPYCE-ABI5ΔN(缺失N端)并将之分别和pSPYNE-AtARRE共转化至烟草细胞.BiFC结果显示pSPYNE-AtARRE+pSPYCE-ABI5ΔN能够观察到荧光,而pSPYNE-AtARRE+pSPYCE-AB I5ΔC则无法观察到荧光,说明AtARRE与ABI5在体内存在相互作用的位置在ABI5的C端.值得注意的是,AtARRE+pSPYCE-ABI5ΔN荧光的强度明显比pSPYNE-AtARRE+pSPYCE-ABI5弱,说明ABI5和AtARRE发生相互作用的位置在ABI5的C端,但是ABI5的N端也起到了辅佐作用,这与酵母双杂交的结果是一致的.4 讨论植物对非生物胁迫的响应涉及许多分子途径的相互作用[19].在胁迫条件下,许多基因发生上调使植物能够承受胁迫,因此形成植物的适应[20].在非生物胁迫的响应中担任信号的是各种化学物质,如钙(Ca2+)、糖、生长素(IAA)、脱落酸(ABA)等,不同的信号通路既相互独立也相互影响[21].植物激素参与植物对非生物胁迫的耐受性和适应作用,最重要的两种激素是脱落酸(ABA)和乙烯[22].作为重要的植物激素,ABA在植物耐受性的形成中起到了重要的调节作用,信号通路通过ABA诱导生产和积累在ABA信号转导中起重要作用的第二信使,如Ca2+、磷脂酸(PA)和活性氧(ROS)等[23].因此,ABA信号通路和其涉及的各种蛋白是研究植物抗逆的重要课题.拟南芥有超过1400种E3连接酶,这表明E3连接酶是底物特异性的主要决定因素,因此,作为泛素化-蛋白酶途径的重要组成部分的E3连接酶也是目前研究植物抗逆机制的重点.作为植物抗逆的一个重要的途径,ABA信号途径中有多个转录因子参与植物与ABA相关胁迫的应答过程.这些转录因子可能被泛素化途径识别靶定,并通过26s蛋白酶体途径降解来调控植物的应答反应.泛素化系统中E3连接酶起着识别与靶定底物的作用,因而研究E3连接酶与底物蛋白的作用对于研究植物的胁迫响应有着重要意义.经过本实验室前期研究发现AtARRE负调控ABA信号途径并鉴定了AtARRE的E3连接酶活性.基于以上研究成果,本研究利用酵母双杂交技术、基于绿色荧光蛋白瞬时表达的植物亚细胞定位方法、GST-Pull down实验和双分子荧光互补法(BiFC)对AtARRE与ABI5的相互作用展开了研究.结果显示,AtARRE与ABA信号途径中的转录因子ABI5存在相互作用,且AtARRE主要与ABI5的C端存在相互作用.因此,我们的研究结果预示了AtARRE可能通过泛素化修饰ABI5来负调控ABA信号途径,进而调节拟南芥响应非生物胁迫.为了进一步揭示AtARRE与ABI5之间的关系,清楚AtARRE在ABA信号途径中的调控作用,最终达到了解植物抗逆分子机制的目的,后期的研究需要利用体外泛素化和Co-IP等研究手段,从体外和体内两个角度研究AtARRE是否能够泛素化修饰ABI5,从而探究AtARRE在ABA信号途径中的功能.参考文献:【相关文献】[1] Bray E A, Bailey-Serres J, Weretilnyk E. Responses to abiotic stresses [C]// Buchanan B B, Gruissem W, Jones R L. Biochemistry and molecular biology of plants. Rockville: American Society of Plant Physiologists, 2000.[2] Wang W, Vinocur B, Altman A. Plant responses to drought, salinity and extreme temperatures: Towards genetic engineering for stress tolerance [J]. Planta, 2003, 218: 1.[3] Reece J, Taylor M R, Simon E J, et al. Campbell biology [M]. Amsterdam: Addison-Wesley Longman, 2011.[4] Deshaies R J, Joazeiro C A P. RING Domain E3 Ubiquitin Ligases [J]. Annu Rev Biochem, 2009, 78: 399.[5] Zhang X, Garreton V, Chua N H. The AIP2 E3 ligase acts as a novel negative regulator of ABA signaling by promoting ABI3 degradation [J]. Gene Dev, 2005, 19: 1532.[6] Stone S L, Williams L A, Farmer L M, et al. KEEP ON GOING, a RING E3 ligase essential for Arabidopsis growth and development, is involved in abscisic acid signaling [J]. Plant Cell, 2006, 18: 3415.[7] Bu Q, Li H, Zhao Q, et al. The Arabidopsis RING finger E3 ligase RHA2a is a novel positive regulator of abscisic acid signaling during seed germination and early seedling development [J]. Plant Physiol, 2009, 150: 463.[8] Liu H, Stone S L. Abscisic acid increases Arabidopsis ABI5 transcription factor levels by promoting KEG E3 ligase self-ubiquitination and proteasomal degradation [J]. Plant Cell, 2010, 22: 2630.[9] Li H, Jiang H, Bu Q, et al. The Arabidopsis RING finger E3 ligase RHA2b acts additively with RHA2a in regulating abscisic acid signaling and drought Response [J]. Plant Physiol, 2011, 156: 550.[10] Takahashi S, Seki M, Ishida J, et al. Monitoring the expression profiles of genes induced by hyperosmotic, high salinity, and oxidative stress and abscisic acid treatment in Arabidopsis cell culture using a full-length cDNA microarray [J]. Plant Mol Biol, 2004, 56: 29.[11] Tuteja N. Cold, salinity, and drought stress [C]// Plant stress biology: from genomics to systems biology. Weinheim: WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, 2009.[12] Kaur N, Gupta A K. Signal transduction pathways under abiotic stresses in plants [J]. Curr Sci, 2005, 88: 1771.[13] Goda H, Sasaki E, Akiyama K, et al. The AtGenExpress hormone and chemical treatment data set: experimental design, data evaluation, model data analysis and data access [J]. Plant J, 2008, 55: 526.[14] Bansal K C, Lenka S K, Tuteja N. Abscisic acid in abiotic stress tolerance: an 'omics' approach [M]. Omics and plant abiotic stress tolerance. Sharjah: Bentham Science, 2011.[15] Hubbard K E, Nishimura N, Hitomi K, et al. Early abscisic acid signal transduction mechanisms: newly discovered components and newly emerging questions [J]. Gene Dev, 2010, 24: 1695.[16] Finkelstein R R, Lynch T J. The Arabidopsis abscisic acid response gene ABI5 encodesa basic leucine zipper transcription factor [J]. Plant Cell, 2000, 12: 599.[17] Vidyasagar A, Lutkenhaus J. Sumoylation of ABI5 by the Arabidopsis SUMO E3 ligaseSIZ1 negatively regulates abscisic acid signaling [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2009, 106: 5418.[18] Seiler C, Harshavardhan V T, Rajesh K, et al. ABA biosynthesis and degradation contributing to ABA homeostasis during barley seed development under control and terminal drought-stress conditions [J]. J Exp Biol, 2011, 62: 2615.[19] Viswanathan, Chinnusamy, Zhizhong, et al. Abscisic acid-mediated epigenetic processes in plant development and stress responses [J]. J Integr Plant Biol, 2008, 50: 1187.[20] Leung J, Giraudat J. Abscisic acid signal transduction [J]. Annu Rev Plant Phys, 1998, 49: 199.[21] Rock C D. Pathways to abscisic acid-regulated gene expression [J]. New Phytol, 2000, 148: 357.[22] Rohde A, Kurup S, Holdswoth M. ABI3 emerges from the seed [J]. Trends Plant Sci, 2000, 5: 418.[23] Shinozaki K, Yamaguchishinozaki K. Molecular responses to dehydration and low temperature: differences and cross-talk between two stress signaling pathways [J]. Curr Opin Plant Biol, 2000, 3: 217.。

Botanical Research 植物学研究, 2020, 9(3), 268-273Published Online May 2020 in Hans. /journal/brhttps:///10.12677/br.2020.93032Progress on Methods of SubcellularLocalization of Chloroplast Protein inPlant CellsYan Wang, Jie Na*School of Life Sciences, Liaoning Normal University, Dalian LiaoningReceived: Apr. 20th, 2020; accepted: May 19th, 2020; published: May 26th, 2020AbstractChloroplast plays an important role in photosynthesis. Chloroplast proteins distribute in different structures in chloroplast according to their various functions. Proteins could be effective and take part in cell activities only after they are transported to special loci. Therefore, it is necessary to know the subcellular localization of chloroplast protein to understand the relationship between chlorop-last structure and function. Recently, in the research of plant protein localization, some experimen-tal methods assisted by bioinformatic prediction were used to increase the accuracy of protein loca-lization analysis. Basic theory and main steps of these two methods were summarized in this paper in order to provide an effective method for chloroplast protein subcellular localization research.KeywordsChloroplast Protein, Subcellular Localization Methods植物细胞中叶绿体蛋白质的亚细胞定位方法王颜，那杰*辽宁师范大学生命科学学院，辽宁大连收稿日期：2020年4月20日；录用日期：2020年5月19日；发布日期：2020年5月26日摘要叶绿体是植物光合作用的重要场所。

植物亚细胞定位介绍植物亚细胞定位是指确定植物细胞中特定蛋白质或物质的位置。

通过了解植物细胞中物质的分布情况，可以揭示细胞功能和结构的一些重要信息。

对于了解植物生物学的基本原理和植物的生长发育过程具有重要意义。

本文将介绍植物亚细胞定位的重要性以及常用的研究方法。

重要性植物亚细胞定位能够帮助我们了解植物细胞中不同蛋白质和物质的位置和分布情况。

这对于研究细胞功能、结构和生理过程非常重要。

通过确定蛋白质或物质在细胞的具体位置，可以揭示它们在细胞中的功能以及它们在细胞内的相互作用。

此外，植物细胞内一些亚细胞结构的定位也可以为研究植物的生长发育过程提供重要的线索。

常用的研究方法荧光蛋白标记技术荧光蛋白标记技术是一种常用的植物亚细胞定位研究方法。

该方法利用荧光蛋白（如绿色荧光蛋白，GFP）作为标记，在转基因植物中表达标记蛋白质。

通过显微镜观察，可以直接看到标记蛋白质在细胞中的位置和分布情况。

通过改变标记蛋白质的亚细胞定位序列，可以进一步研究蛋白质定位的机制。

免疫荧光染色免疫荧光染色是一种利用抗体与目标蛋白质的结合来实现蛋白质亚细胞定位研究的方法。

该方法通过染色体技术，将与目标蛋白质结合的一抗或二抗标记成荧光物质进行染色。

通过显微镜观察，可以直接观察到目标蛋白质在细胞内的位置和分布情况。

电子显微镜观察电子显微镜观察是一种高分辨率的植物细胞亚细胞定位研究方法。

该方法通过将植物细胞透明化处理，并利用电子显微镜观察细胞内亚细胞结构的形态和分布情况。

通过此方法，可以观察到细胞膜、内质网、高尔基体、线粒体、叶绿体等亚细胞结构的分布情况，了解植物细胞的结构组成和功能。

结论植物亚细胞定位是研究植物细胞功能和结构的重要方法之一。

通过荧光蛋白标记技术、免疫荧光染色和电子显微镜观察等方法，可以揭示植物细胞内不同蛋白质和物质的位置和分布情况。

这对于深入了解植物生物学的基本原理、揭示植物的生长发育过程具有重要意义。

在未来的研究中，应该进一步发展和完善亚细胞定位技术，以推动植物细胞研究的进步。

绿色荧光蛋白研究进展
王晓丽;邵卫星;单虎
【期刊名称】《动物医学进展》
【年(卷),期】2008(29)1
【摘要】来源于海洋多管水母属的绿色荧光蛋白(GFP)基因是目前惟一在细胞内稳定表达,在蓝光或长紫外光的激发下,不需要任何反应底物及其他辅助因子就能发出绿色荧光的新型报告基因,无种属、组织和位置特异性,且能监测基因表达、信号转导、共转染、蛋白运输与定位,以及细胞系谱分类等.GFP对细胞无毒性,且检测方法简单,结果真实可靠,目前在多种原核和真核生物研究中得到广泛的应用.文章就GFP 的生化特性、GFP的改进及其在分子生物学研究中的应用潜力进行简要阐述.【总页数】4页(P56-59)
【作者】王晓丽;邵卫星;单虎
【作者单位】青岛农业大学动物科技学院,山东青岛,266109;中国动物卫生与流行病学中心,山东青岛,266071;青岛农业大学动物科技学院,山东青岛,266109
【正文语种】中文
【中图分类】Q516
【相关文献】
1.绿色荧光蛋白在微生物与植物互作研究中的应用研究进展 [J], 潘虹;雷珍珍;许可静;叶晶龙;廖甜甜;乐超银
2.绿色荧光蛋白GFP的研究进展及应用 [J], 吴沛桥;巴晓革;胡海;赵静
3.Ad5-增强型绿色荧光蛋白和rAAV2-增强型绿色荧光蛋白转染脂肪间充质干细胞的对比 [J], 袁小洪;安荣泽;王兆杰;贾婀娜;齐新文;陈金平;杨晋;刘凡凡
4.绿色荧光蛋白的研究进展 [J], 杨慧敏;李文刚;吴高锋;魏娟;王鑫
5.绿色荧光蛋白细胞毒性研究进展 [J], 李颖; 纪木火; 杨建军
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