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原花青素的提取、分离及抗氧化性、稳定性的研究本文以葡萄籽、葡萄叶子为原料，对其原花青素的提取工艺进行了研究。
在提取葡萄籽中的原花青素时采用50％乙醇，料液比1／40，于60℃下热回流浸提2个小时，提取2～3次最优提取工艺，此工艺提取得到的原花青素提取物得率为22.01％，产品纯度为51.17％；提取葡萄叶子时采用70％乙醇，料液比1／50，于80℃下热回流浸提3个小时，提取1～2次的最优提取工艺，此工艺得到的原花青素得率为34.14％，纯度为13.66％。
对上述提取物进一步纯化，葡萄籽提取物选用AB-8大孔吸附树脂，50％乙醇为洗脱剂，流速控制在4mL／min左右，葡萄籽原花青素总的提取得率为9.09％，产品纯度能达到94～95％；葡萄叶子提取物选用D-101大孔吸附树脂，70％乙醇为洗脱剂，流速控制在4mL／min左右，其原花青素提取得率为18.21％，纯度为25.63％。
采用超滤法对大孔吸附后的葡萄籽精提物进行低聚体的提纯，其过膜后的单体儿茶素含量有明显增加，P5000约为过膜前的6.6倍，P1000为过膜前的7.7倍。
其中压力对超滤通量的影响较大，而温度影响较小，一般选择20～30psig，室温下操作即可，避免在操作过程中长时间将过滤液暴露于强光及空气中。
利用Sephadex LH20将P5000样继续分离，使含量较高的一种二聚体得到了富集。
原花青素的抗氧化(FRAP)、清除DPPH自由基实验表明，葡萄叶子原花青素抗氧化、清除自由基活性均强于抗坏血酸，稍强于葡萄叶子提取物，而与原花青素的低聚体、高聚体相差不大。
原花青素在不同温度、光照、氧气的条件下1～2天内具有较好的稳定性。
经长期(10天)紫外光照射不稳定，含量下降甚至消失，溶液颜色逐渐加深，但其抗氧化、清除自由基能力无显著性变化(p＞0.05)。
抗坏血酸对紫外照射引起的原花青素不稳定能起到保护作用，并且存在剂量依赖效应。
类似于口服液等的原花青素溶液产品较适用微波法灭菌。
葡萄籽中分离提取原花青素的研究花青素是一类多酚类化合物，其具有高效的清除自由基的功能，是一种新型、高效、低毒的天然抗氧化剂。
本实验通过浸提的方法从葡萄籽中提取原花青素，考察了不同溶剂、浸提时间、浸提温度、乙醇体积分数和料液比等单因素对浸提效果的影响，确定了最佳的单因素水平。
研究结果表明：本项目产品投资费用少，操作费用低，产品附加值高；原料为废物利用，变废为宝符合国家相关产业政策；几乎没有“三废”排放，使用的溶剂全部回收利用，废渣可以作为造纸或者饲料综合利用。
标签：花青素；葡萄籽；提取；正交实验1 概述原花青素是广泛存在于植物中的一类天然多酚类化合物，多以糖苷的形式存在，也称花色苷。
属于缩合鞣质或黄烷醇类。
最早而最丰富的花青素是从红葡萄渣中提取的葡萄皮红。
它于1879年在意大利上市。
由于原花青素的多种功效，由葡萄籽提取的原花青素已被我国卫生部批准为保健原料。
目前对原花青素的提取研究及保健作用研究已非常成熟。
已经将其应用到工业化产业，开发出多种原花青素的保健产品和化妆产品。
原花青素的产品已被广大消费者普遍接受。
2 葡萄籽中花青素的提取本实验通过浸提的方法从葡萄籽中提取原花青素，考察了不同溶剂、浸提时间、浸提温度、乙醇体积分数和料液比等单因素对浸提效果的影响，确定了最佳的单因素水平。
并通过设计正交实验，得出原花青素提取最佳工艺条件。
2.1 实验方法2.1.1 葡萄籽中原花青素的提取本实验采用甘肃紫轩酒业葡萄酒厂生产葡萄酒产生的葡萄籽下脚料作为本实验的原材料。
在生产葡萄酒压榨葡萄汁的糟粕和葡萄酒生产前和发酵后压榨的榨粕，所得的这些榨渣中，以换成干品计，约有50%的葡萄皮，45%的葡萄籽和少量的梗等，将该榨渣经粗选分离出葡萄籽，作为提取的原料。
所得的葡萄籽用粉碎机粉碎后，过20目筛，于磨口三角瓶中，经石油醚脱脂脱水份，得脱脂葡萄籽粉，用一浸提液在50℃的恒温水浴中回流浸提，离心后取上清液，反复提取若干次，最后洗涤残渣，将上清液和洗涤液合并，加入固体无水硫酸钠脱水，倾出上层溶液，在真空度为0.095MPa，温度为40℃的条件下真空浓缩，浓缩液冷却至室温，得到原花青素粗提液，干燥，制得粗提物。
葡萄籽低聚原花青素体外抗氧化活性研究梁红敏;高德艳;胡文效【摘要】Using grape seed oligomeric procyanidins isolated and purified from laboratory as research object,vitamin E and vitamin C as control,the effect of grape seed oligomeric proanthocyanidins on the scavenging capacity of DPPH free radical,ABTS free radical,superoxide anion free radical and ferric ion reducing antioxidant power (FRAP) was investigated.The results showed that grape seed oligomeric procyanidins had higher scavenging capacity against DPPH free radical,ABTS free radical and superoxide anion radical,with IC50 value of 23.52 μg/ml,51.38 μg/ml and 684.46 μg/ml,respectively,and they were all higher than vitaminparing with vitamin C,the scavenging capacity of ABTS free radical and reducing power of procyanidins was better than that of vitamin C,and the scavenging capacity of DPPH free radical were equivalent.At very low concentration (0.05-1.00 μg/ml),procyanidins and vitamin E had scavenging ability against superoxide anion radicals,and the scavenging rate was 30％-40％.With the increase of concentration,the scavenging capacity of vitamin C against superoxide anion free radical was better than that of grape seed oligomeric procyanidins.%以实验室分离纯化得到的葡萄籽低聚原花青素为研究对象,水溶性维生素E和维生素C为对照,分别考察葡萄籽低聚原花青素对DPPH自由基、ABTS自由基、超氧阴离子自由基(O2-·)的清除能力以及铁离子还原能力(FRAP).结果表明,葡萄籽低聚原花青素对DPPH自由基、ABTS 自由基以及超氧阴离子自由基具有较高的清除能力,IC50值分别为23.52μg/mL、51.38 μg/mL和684.46 μg/mL,具有较高的还原能力,且均优于对照水溶性维生素E.与维生素C相比,原花青素对ABTS自由基的清除能力以及还原能力均优于维生素C,两者DPPH自由基的清除能力相当,原花青素和水溶性维生素E在极低质量浓度(0.05～1.00 μg/mL)范围内,对超氧自由基具有清除能力,清除率为30％～40％,随着质量浓度的增加,维生素C的超氧阴离子自由基清除能力优于葡萄籽低聚原花青素.【期刊名称】《中国酿造》【年(卷),期】2017(036)004【总页数】4页(P149-152)【关键词】葡萄籽低聚原花青素;还原力;自由基;抗氧化活性【作者】梁红敏;高德艳;胡文效【作者单位】山东省葡萄研究院,山东济南250100;山东省葡萄研究院,山东济南250100;山东省葡萄研究院,山东济南250100【正文语种】中文【中图分类】R285.3近年来，国内以葡萄籽原花青素为原料的保健食品和膳食营养补充剂越来越多，但是由于还没有相应的国家和行业标准，各原料生产企业按照各自的企业标准生产，导致了现在市场上原料和产品质量的差异，而原花青素的生产应该以较高活性的组分为主，以提高产品质量，扩大其应用范围。
刺葡萄籽原花青素提取、提纯及其抗氧化性的研究的开题
报告
一、选题背景
花青素是一类天然的多酚化合物，广泛存在于植物中，如红酒、葡萄、柿子、紫薯等。
花青素具有良好的抗氧化性能、降低血糖、抗炎等多种生物活性，因此在食品、医药、化妆品等领域具有广阔的应用前景。
刺葡萄是一种生长于中国南方的果树，其果实富含花青素，并且具有丰富的营养价值。
因此，对刺葡萄籽中花青素的提取、提纯及其抗氧化性进行研究，对于充分利用刺葡
萄资源，开发新型抗氧化剂具有重要意义。
二、研究内容
本研究主要围绕刺葡萄籽原花青素的提取、提纯及其抗氧化性开展。
具体步骤如下：
1. 采集刺葡萄果实，分离出籽，干燥后制备成粉末。
2. 采用酒精提取、正硅酸钙柱层析、聚合物吸附树脂等方法对刺葡萄籽中花青素进行
提纯。
3. 对提取、提纯后的样品进行UPLC、HPLC等方法的分析，确定其组成及含量。
4. 测定提取、提纯后花青素的总抗氧化能力、DPPH自由基清除能力、还原力等指标，评价其抗氧化性能。
5. 对提取、提纯后的花青素进行稳定性、溶解性、保存条件等方面的评价。
三、研究意义
本研究将对刺葡萄籽中花青素的提取、提纯及其抗氧化性进行深入的研究，可以为刺
葡萄资源的开发利用提供重要科学依据。
同时，本研究所得的刺葡萄籽花青素提纯制
备工艺、抗氧化性能等方面的成果，也有望为制备高附加值的抗氧化剂、食品添加剂、保健品等提供有效的技术支持。
・实验研究Experimental R esearch ・葡萄籽原花青素的梯度分离及其抗氧活性研究3Studies of G radient Extraction of G rape Seed Proanthocyanidin and Their Anti 2oxidative Effects杨怀霞Yang Huaixia 1,马庆一Ma Qingyi 2,许 闽Xu Min 11.河南中医学院Henan College of Traditional Chinese Medicine ;2.郑州轻工业学院Zhengzhou Institute of Light Industry摘要:目的:研究葡萄籽原花青素的梯度分离方法及各组分的抗氧化性能。
方法:葡萄籽样品通过乙醇粗提后,用不同溶剂梯度分离得到各组分,以乙酸乙酯组分为代表确定DPPH ・法测定活性的最佳浓度范围,再比较各组分自由基淬灭能力。
结果:最佳活性测定样品浓度范围1.0～10μg/ml ,运用此法测得的清除率在25%～80%之间,灵敏度和准确度较高;葡萄籽梯度分离各组分清除自由基能力:乙酸乙酯组分≥丙酮组分>乙醇组分>乙醚组分>乙醇粗提物>二氯甲烷组分>石油醚组分;其中乙酸乙酯组分和丙酮组分活性尤其突出,表明有高活性成分富集其中。
结论:梯度分离葡萄籽原花青素提取物的效果令人满意。
Abstract :Objective :To explore gradient extraction of grape seed proanthocyanidin and their antioxdative effect.Method :After sam 2ple grape seeds were extracted with ethanol ,the active components were obtained by application of different organic solvents.Through investigation of the free 2radical scavenging effect of ethylacetate components ,the optimum concentration range was deter 2mined by DPPH method and a comparison was made on the antioxidative effects of the different components from grape seeds.Re 2sult :The optimum assay range was 1.0～10ug/ml with the scavenging rate between 25%～80%.The sensitivity and accuracy of this method were satisfying.The free 2radical scavenging effects of different components from grape seed proanthocyanidin came in the following :Ethyl acetate >Acetone >Ethanol >Ether >the primary extracts of ethanol >Dichloromethane >Petroleum ether.A 2mong all components ,the activities of Ethyl acetate and Acetone extracts were excellent marked by the active components highly con 2centrated.Conclusion :Gradient extraction of grape seed proanthocyanidin was very promising.关键词:葡萄籽;梯度分离;抗氧化性;DPPH ・法K ey w ords :grape seed ;gradient extraction ;anti 2oxidative effect ;DPPH method中图分类号CLC number :R284.2 文献标识码Document code :A 文章编号Article ID :1672-6839(2004)05-0014-03 许多生理、病理现象都与体内自由基的产生和积累密切相关,寻找阻遏自由基反应的抗氧化剂的工作格外重要[1]。
近年来,植物源抗氧化剂由于其低毒、高效成为研究热点,葡萄籽中提取的原花青素更因其独特的抗氧化特性及高生物利用率倍受青睐,但因其组成复杂,各类成分之间性质相近,难以分离,极大地影响了有效成分的开发利用[2]。
DPPH ・法简便、快速、重现性好,广泛用于各种自由基清除剂筛选研究的分析跟踪[3]。
本文以梯度提取方法分离葡萄籽中的有效成分,以乙酸乙酯组分为代表确定DPPH ・法测定活性的最佳样品浓度范围,并对比了各组分的自由基淬灭能力,即其抗氧化活性的强弱。
该研究方法简便、有效,既为葡萄籽提取物的开发应用提供理论依据,也为其它同类研究提供参考。
1 实验材料材料:葡萄籽样品(民权葡萄酒厂下脚料)。
试剂:DPPH ・(1,1-二苯基-2-苦肼基自由基,日本东京工业株式会社生产),原花青素标准品(Sigma 公司生产,含3基金项目:河南省教育厅科技攻关项目(编号:20023600010)量98%),其它试剂均为分析纯。
主要仪器:RE -52旋转蒸发器(上海安亭电子仪器厂),LD4-2离心机(北京医用离心机厂),752型紫外光栅可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司),DZF -IB 型真空干燥箱(上海跃进医疗器械厂)。
2 实验方法2.1 样品处理及有效成分分离提取取风干恒重的葡萄籽样品100g ,粉碎过20目筛,用700ml 80%乙醇浸泡过夜,水浴回流5h ,将提取液浓缩至粘稠油状,加入硅藻土拌匀,以滤纸包裹,移入索氏提取器,依次用石油醚、二氯甲烷、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、乙醇等溶剂在避光下提取3h ,提取液减压浓缩后分别用乙醇定容记为A ,不溶部分用乙酸乙酯溶解后记为B 备用。
2.2 清除自由基活性试验(DPPH ・法)取0.20ml 样品溶液,加入4.00ml 的50μmol/L 的DPPH ・溶液混匀,放置30min ,以原溶剂调零点,在517nm处测吸光度记为Ai ,同法0.20mL 溶剂+DPPH ・溶液混匀测定吸光度记为Ac ;0.20ml 样品溶液+4.00ml 的溶剂混匀测吸光度记为Aj 。
按照以下公式计算自由基清除率:・41・2004年10月第5期No.5 Oct. 2004河南中医学院学报JOURNAL OF HENAN UNIVERSITYOF CHINESE MEDICINE 第19卷总第114期Vol.19Serial No.114IP (%)=[1-(Ai -Aj )/Ac ]×100其中Aj :反映样品自身对吸光度的贡献;Ac :为DPPH ・本身在测定波长的吸收;Ai :样品对DPPH ・作用后的吸光度数值。
2.3 样品用量选择与抗氧化活性测定先将乙酸乙酯组分A 部分用95%乙醇稀释为不同浓度,进行清除自由基活性试验以确定最佳样品用量,再分别用95%乙醇、乙酸乙酯稀释其它各组分A 、B 部分,取同样量进行样品活性测定。
2.4 原花青素含量测定采用香草醛-盐酸法[4],以原花青素为标准品作标准曲线,计算样品中原花青素含量。
2.5 薄层分析以甲苯∶丙酮∶醋酸=3∶3∶1体系展开,参考文献[5]进行分析。
表1 梯度提取各组活性测定结果%组分乙醇丙酮乙酸乙酯AB乙醚AB二氯甲烷AB石油醚乙醇粗提颜色暗红色棕红色红色红色红色红色黄绿色黄绿色灰绿色暗红色收率 1.0250.9610.1960.0010.2720.0040.1090.0050.326 3.050原花青素54.3358.6793.33101.0042.0040.319.070.000.0042.00IP86.4193.3393.5990.2485.9075.6135.904.884.5576.413 实验结果3.1 样品用量的选择乙酸乙酯组分A 部分用95%乙醇稀释为不同浓度,进行清除自由基活性测试结果见图1、图2。
图1 不同浓度样品的淬灭自由基活性测试图2 不同浓度样品的自由基清除率 图1的Aj -C 曲线显示:样品在测定波长517nm 下有吸收,并且随浓度的增加而增大,但当样品用量低于25μg/ml 时,Aj <0.005样品在测定波长下的吸收与测定值相比微不足道,毋须考虑样品本身对吸收度的贡献;从图2样品用量与清除率的关系看来,样品浓度0.25～10μg/ml 与清除率呈正相关关系;在样品加入浓度超过10μg/ml 时,自由基清除率在80%以上,此时若用量继续增加,清除率变化不大,且样品浓度过大,样品吸收使背景加深影响测定,在此浓度区间测定灵敏度和准确度都不高;而当C <1μg/mL 清除率小于25%测定结果的绝对误差会比较大,显然活性测定浓度范围1～10μg/ml ,清除率在25%～80%,对于比较各个组分的活性十分有利,方法灵敏度、准确度均较高。
3.2 样品测定葡萄籽样品梯度分离各组分加入浓度10μg/ml 的活性测定结果见表1。
显然:乙酸乙酯组分≥丙酮组分>乙醇组分>乙醚组分>乙醇粗提物>二氯甲烷组分>石油醚组分。
各组分活性与原花青素含量呈正相关的关系。
4 讨论由葡萄籽各级提取物的抗氧化性测定过程可以知道,判断物质的抗氧化效果,样品用量选取至关重要。
清除率与样品浓度呈正相关关系,在一定浓度范围内测定的灵敏度和准确度令人满意。
样品本身在测定波长的吸收不得不考虑,样品用量并非越大越好,其用量大到一定程度,样品活性强弱难以比较,如果用量太大,样品本身对吸收值的贡献远远超过它淬灭自由基所引起的吸光度值的减少(Aj >Ac -Ai ),样品本身的吸收会掩盖它对自由基的清除能力,由此还可能得出样品无抗氧化性或有助氧化作用的错误结论。
从梯度提取各组分的活性测定结果可见原花青素是主要抗氧化活性成分。
普遍地各组分的醇溶部分比乙酸乙酯溶解物的活性强,说明活性高的成分是水溶性好的原花青素低聚体,乙醇粗提物、石油醚组分、二氯甲烷组分、乙醚组分、乙醇组分的活性差异大,此样品用量可以明显地比较出它们清除自由基能力的差异。
