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中蒙药制剂指纹图谱建立和辨认的方法和步骤杨永生 2009级研究生学号：2009110100摘要目的：介绍中蒙药制剂指纹图谱建立和辨认的方法和步骤，为祖国传统医药走向世界提供手段方法。
方法：归纳国内近年关于指纹图谱的大量文献，分析其研究的方法，在中蒙药制剂质量控制中起到了重要作用。
结果：中蒙药制剂指纹图谱技术进展很快完全可以利用其作为中蒙药质量控制的手段。
结论：中蒙药制剂指纹图谱的研究进展很快其科学的方法和步骤可以更好的提升中蒙药质量，中蒙药制剂指纹图谱技术一定可以加速祖国传统医药走向世界。
关键词中蒙药制剂指纹图谱；方法和步骤中蒙药是我国人民在数千年治疗疾病过程中积累起来的宝贵财富，中蒙药生产和质量的规范化和现代化是祖国传统医药走向世界的重要前提，目前中蒙药正处于迈向现代化的瓶颈阶段，中蒙药制剂指纹图谱的出现为解决这个问题提供了现代技术手段、中蒙药制剂指纹图谱近年来进展很快，本文综合了国内近年的有关文献对中蒙药制剂指纹图谱的建立和辨认的方法和步骤作一论述。
1、中蒙药指纹图谱的定义、特点、分类1.1 定义：中蒙药指纹图谱是指某种（或某产地）中蒙药材或中成药经适当处理后，采用一定的分析手段,得到的能够标志该中蒙药材或中成药特征的色谱或光谱的图谱。
利用色谱技术进行指纹图谱分析的中蒙药材因生长年限，生长环境的变化而可能产生个体间较为明显的差异，但个体间必然有群体共有的相似性[1]。
1.2 特点：①通过指纹图谱的特异性，能有效鉴别样品的真伪或产地；②通过指纹图谱主要特征峰的含量或比例的制定，能有效控制样品的质量，确保质量的相对稳定。
中蒙药指纹图谱有两个基本属性[2]：整体性和模糊性。
1.3 分类：按应用对象来分类，可分为中蒙药材(原料药材)指纹图谱、中蒙药原料药(包括饮片、配伍颗粒)指纹图谱、中蒙药中间体（工艺生产过程中间产物）指纹图谱和中蒙药制剂指纹图谱。
按测定手段可分为：中蒙药化学指纹图谱和中蒙药生物指纹图谱。
中药指纹图谱（Finger diagram）在前一阶段的课程中，我们已经讨论了很多控制中药质量的方法.今天我们讨论一个新方法“中药指纹图谱”,请翻到教材的360页。
一建立中药指纹图谱的意义1、中药治疗疾病的物质基础是其中含有的化学成分。
2、中药中的化学成分具有多样性和复杂性、3、任何单一的有效成分或指标性成分均不能反映中药所体现的整体疗效。
阐明中药有效成分成为一个极为困难的研究课题。
近百年来，人们力图从中药中得到能代表、反映中药疗效的有效成分、为此从中药中分离得到大量的各种化合物、如从鸦片中分离得到吗啡和可代因、从麻黄中分离得到麻黄素、从黄连中分离得到黄连素、从麝香中分离得到麝香酮、从板兰根中分离得到靛玉红、靛兰，但迄近为至，能反映中药疗效的不过百种、而且是部分的疗效。
如麻黄的主要功效是止咳、发汗，而麻黄素的仅具有止咳的作用、黄连的主要功效是清热燥湿、泻火介毒、而黄连素的主要作用是治疗泻痢。
这种情况不仅是在中药研究中、国外対天然药物的研究中也是如此、如美国用贯叶连翘治疗抑郁症、用金丝桃苷作为控制质量的指标、而近代的研究表明金丝桃苷并不具有治疗抑郁症的作用，中药产生的疗效，不是单一成分作用的结果，也不是一些成分简单作用的加和，很多的研究表明中药的疗效是多种化学成分综合作用的结果、具有多成分（包括已知和未知的成分）、多途径、多靶点的特点。
用一个或几个活性成分的含量作为指标并不能完全说明中药的内在质量。
4、中药材来源的复杂性和中药制剂生产的不规范性造成了中药制剂质量的波动和临床疗效的不稳定性。
5、现有的中药质量控制方法（显微鉴别法、TLC法、光谱法、色谱法等）还很不完善、尚不能真正反映中药制剂的内在质量。
中药在其漫长的发展过程种，其质量主要依靠药材的道地性和炮制的经验来控制，道地药材，遵古炮制、经验鉴别、师徒相承，1963年版的药典只收录了处方和制法，対检验方法未作任何规定。
1977年版的药典，引入了显微鉴别，近近年的药典虽然引入了大量的定量方法，用一个或几个成分作为指标来控制中药的质量并以此了建立中药的质量标准。
中药指纹图谱建立的原则和步骤（一）建立指纹图谱的一般原则中药指纹图谱的建立，应以系统的化学成分研究和药理学研究为依托，体现系统性、特征性和稳定性三个基本原则。
唯此，才能保证指纹图谱的标准化、规范化、客观化，从而便于推广和应用。
1.系统性是指指纹图谱中反映的化学成分应包括该中药有效部位所含大部分成分，或指标性成分的全部，如中药两头尖中抗肿瘤的有效成分为皂苷类化合物，则其指纹图谱应尽可能地反映其中的皂苷类成分；银杏叶的有效成分是黄酮类和银杏内酯类，则其指纹图谱可采用两种方法，针对这两类成分分别分析，达到系统全面的目的。
2.特征性是指指纹图谱中反映的化学信息（如保留时间）应具有较强的选择性，这些信息的综合结果，将能特征性地区分中药的真伪与优劣，成为中药自身的“化学条码”。
如北五味子的HPLC指纹图谱和TLC指纹图谱，不仅包括多种的五味子木脂素类成分，而且具有许多未知类成分，这些成分的峰位顺序、比值在一定范围内是固定的，并且随药材品种不同而产生差异，依此可以很好地区别其来源、产地，判别药材的真伪优劣。
3.稳定性是指所建立的指纹图谱在规定的方法、条件下的耐用程度，即不同操作者、不同实验室所重复做出的指纹图谱应在所允许的误差范围内，以体现其通用性和实用性。
因而要求包括样品制备、分析方法、实验过程、数据采集、处理、分析等全过程都要规范化操作，同时，还应建立相应的评价机构，对其进行客观评价。
（二）建立指纹图谱的一般步骤1.方案设计与思路（1）研究对象的确定在调研有关文献、新药申报资料(质量部分和工艺部分)及其它研究结果的基础上，尽可能的详尽地了解药材、中间体及成品中所含成分的种类及其理化性质，综合分析后找出成品中的药效成分或有效成分，作为成品和中间体指纹图谱的研究对象，即分析检测目标。
例如，黄芪含黄酮、皂苷及多糖三类有效组分，黄芪多糖注射液及其中间体的指纹图谱则以多糖为研究对象，黄芪原药材的指纹图谱应把黄酮、皂苷及多糖作为研究对象。
药指纹图谱建立的原则和步骤
中药指纹图谱建立的原则和步骤
（一）建立指纹图谱的一般原则
中药指纹图谱的建立，应以系统的化学成分研究和药理学研究为依托，体现系统性、特征性和稳定性三个基本原则。
唯此，才能保证指纹图谱的标准化、规范化、客观化，从而便于推广和应用。
1.系统性是指指纹图谱中反映的化学成分应包括该中药有效部位所含大部分成分，或指标性成分的全部，如中药两头尖中抗肿瘤的有效成分为皂苷类化合物，则其指纹图谱应尽可能地反映其中的皂苷类成分；银杏叶的有效成分是黄酮类和银杏内酯类，则其指纹图谱可采用两种方法，针对这两类成分分别分析，达到系统全面的目的。
2.特征性是指指纹图谱中反映的化学信息（如保留时间）应具有较强的选择性，这些信息的综合结果，将能特征性地区分中药的真伪与优劣，成为中药自身的“化学条码”。
如北五味子的HPLC指纹图谱和TLC指纹图谱，不仅包括多种的五味子木脂素类成分，而且具有许多未知类成分，这些成分的峰位顺序、比值在一定范围内是固定的，并且随药材品种不同而产生差异，依此可以很好地区别其来源、产地，判别药材的真伪优劣。
3.稳定性是指所建立的指纹图谱在规定的方法、条件下的耐用程度，即不同操作者、不同实验室所重复做出的指纹图谱应在所允许的误差范围内，以体现其通用性和实用性。
因而要求包括样品制备、分析方法、实验过程、数据采集、处理、分析等全过程都要规范化操作，同时，还应建立相应的评价机构，对其进行客观评价。
（二）建立指纹图谱的一般步骤
1.方案设计与思路
（1）研究对象的确定
在调研有关文献、新药申报资料(质量部分和工艺部分)及其它研究结果的基础上，尽可能的详尽地了解药材、中间体及成品中所含成分的种类及其理化性质，综合分析后找出成品中的药效成分或有效成分，作为成品和中间体指纹图谱的研究对象，即分析检测目标。
例如，黄芪含黄酮、皂苷及多糖三类有效组分，黄芪多糖注射液及其中间体的指纹图谱则以多糖为研究对象，黄芪原药材的指纹图谱应把黄酮、皂苷及多糖作为研究对象。
复方注射剂应根据君臣佐使的原则，以君药、臣药中的有效成分作为指纹图谱的研究对象，佐使药中的成分可采用其它指纹图谱方法进行辅助、补充研究。
（2）研究方法的选择
研究方法应根据研究对象的物理化学性质来选择。
大多数化合物可采用HPLC。
例如黄芪中黄酮、皂苷、多糖等。
挥发性成分应采用GC。
例如鱼腥草中的鱼腥草素、土木香中的土木香内酯、异土木香内酯和二氢土木香内酯等。
某些有机酸经甲酯化后亦可用GC分析。
采用上述方法难以分离检测的成分，可考虑使用TLC和CE。
一个中药制剂的指纹图谱可以同时采用多种方法进行研究。
选择方法时，还需考虑药品检验系统复核时的设备、技术等因素。
（3）研究内容
根据国家食品药品监督管理局《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》(暂行)的规定，
主要研究内容有原药材、中间体、注射剂的指纹图谱，涉及样品名称、来源、制备、测定方法、指纹图谱及技术参数等。
2.样品的收集
这是最初也是最关键的步骤。
至少要收集10个批次样品。
注意样品的代表性。
(1)切不可将同一批次样品分散成数个批次，充当样品。
(2)原药材尽可能固定产地(GAP基地药材，地道药材)、采收期和炮制方法。
对光线稳定，疗效稳定，无临床不良反应的药材批次应重点选择。
(3)中间体、注射剂样品的收集应重点选择工艺稳定、疗效稳定、无不良反应的批次。
(4)留样应不少于实验用量的3倍。
3.供试品溶液的制备(样品的预处理)
（1）药材供试液的制备
根据所含成分的理化性质，通过溶剂提取、液液萃取、沉淀、吸附等方法，分离富集样品。
例如，黄芪中黄酮类成分通过碱的萃取、皂苷类通过大孔吸附树脂吸附；苦参中总生物碱通过阳离子交换树脂分离；挥发性样品常用水蒸气蒸馏法制备。
样品富集后，还需通过氧化铝预柱、C18预柱、硅胶预柱、聚酰胺预柱等，除去色素等杂质，最后通过微孔滤膜，供HPLC测试。
（2）中间体供试液制备
可针对有效成分处理，并参照原药材的制备方法。
（3）注射剂供试液制备
液体注射剂一般无需特殊处理，可直接分析检测。
4.参照物的选择
一般选取样品中容易获得且含量较高的一个主要活性成分或指标成分作为参照物（S）。
参照物主要用于指纹图谱技术参数的确定，如特征峰(共有峰)的相对保留时间，峰面积比值等。
并有助于图谱的稳定性、重现性的考查。
例如三七药材的指纹图谱中以三七皂苷R1为参照物。
由于指纹图谱比较复杂，内标物不易选择、插入，故一般不以内标物做为参照物。
5.实验方法和条件的选择
其目的是通过比较实验，从中选取相对简便易行的方法和条件，获取足以代表品种特征的指纹图谱，以满足指纹图谱的专属性、重现性和普遍适用性的要求。
方法和条件须经过严格的方法学考察。
例如稳定性试验，精密度试验，重现性试验等。
注意事项：供试液的制备和色谱分析时均须定量操作，以保证图谱在整体特征上进行半定量(差异程度或相似程度)的比较。
指纹图谱分析不同于含量测定，提高其分离度应以不牺牲色谱的整体特征为前提，故不应孤立地苛求分离度达到含量测定的要求。
采用HPLC和GC制定指纹图谱，记录时间一般为1小时。
(实测2小时)
6.对照指纹图谱及其技术参数的建立
(1)测得的大量色谱数据需经分析和数据处理，才能获得对照指纹图谱(拟合指纹图谱)及其技术参数，以此作为药品指纹图谱检验的依据。
(2)技术参数主要包括总峰面积、共有峰序号、参照峰(S)、共有峰相对保留时间(RRT)，共有峰峰面积比(RA)，非共峰面积等。
RRT=RTi/RTs RA=Ai/As
共有峰亦称特征峰（包括参照峰），系指所有被检批次中均含有的相同色谱峰，主要来源于样品中主要有效成分或指标成分。
共有峰的化学归属，可采用对照品加入法或HPLC/DAD/MS/MS联用技术进行鉴别，后者可在无对照品的情况下使用。
例复方丹参注射液指纹图谱应有9个特征峰
相对保留时间／分钟(峰序号)：0．145(1) 0．186(2) 0．298(3) 0．378(4) 0．425(5) 0．499(6) 0．594(7) 1．000(s原儿茶醛) 1．145(8)
峰面积比值：0．059(1) 0．064(2) 0．036(3) 0.112±30％(4) 0．054(5) 0．297±25％
(6) 0．055(7) 1．000(s原儿茶醛) 0．040(8)
7.药材、中间体和注射剂指纹图谱的相关性
注射剂中各特征峰均可在药材及中间体指纹图谱中得到追踪，中间体与注射剂的指纹图谱应非常接近，药材图谱中的色谱峰应比注射剂多。
必要时可采用加入某一药材、有效部位或中间体的供试品，或制备某一药材、有效部位或中间体阴性供试品的方法，标定各指纹图谱之间的相关性。
提供相关性研究的指纹图谱。
8.指纹图谱的评价
中药指纹图谱的评价系指将样品指纹图谱与建立起来的对照指纹图谱进行相似性比较，从而对药品质量进行评价和控制。
中药指纹图谱的评价不同于含量测定，它强调的是相似性(Similarity)，而不是相同性(Identity)，也即着重辨识完整图谱“面貌”，而不是求索细枝末节。
分析比较的结果是对供试品与对照品之间的差异或一致性作出的评价。
相似性的比较可以用“相似度”表达，相似度可借助国家药典委员会推荐的“中药指纹图谱计算机辅助相似度评价软件”计算，一般情况下相似度在0．9~1．0之间即认为符合要求。
