Folin-酚试剂法(Lowry法)测定蛋白质浓度

蛋⽩浓度测定的各种⽅法蛋⽩质的定量分析是⽣物化学和其它⽣命学科最常涉及的分析内容，是临床上诊断疾病及检查康复情况的重要指标，也是许多⽣物制品，药物、⾷品质量检测的重要指标。

在⽣化实验中，对样品中的蛋⽩质进⾏准确可靠的定量分析，则是经常进⾏的⼀项⾮常重要的⼯作。

蛋⽩质是⼀种⼗分重要的⽣物⼤分⼦：它的种类很多，结构不均⼀，分⼦量⼜相差很⼤，功能各异，这样就给建⽴⼀个理想⽽⼜通⽤的蛋⽩质定量分析的⽅法代来了许多具体的困难。

⽬前测定蛋⽩质含量的⽅法有很多种，下⾯列出根据蛋⽩质不同性质建⽴的⼀些蛋⽩质测定⽅法：物理性质：紫外分光光度法化学性质：凯⽒定氮法、双缩脲法、Lowry 法，BCA法，胶体⾦法染⾊性质：考马⽒亮蓝染⾊法、银染法其他性质：荧光法蛋⽩质测定的⽅法很多，但每种⽅法都有其特点和局限性，因⽽需要在了解各种⽅法的基础上根据不同情况选⽤恰当的⽅法，以满⾜不同的要求。

例如凯⽒定氮法结果最精确，但操作复杂，⽤于⼤批量样品的测试则不太合格；双缩脲法操作简单，线性关系好，但灵敏度差，样品需要量⼤，测量范围窄，因此在科研上的应⽤受到限制；⽽酚试剂法弥补了它的缺点，因⽽在科研中被⼴泛采⽤，但是它的⼲扰因素多；考马⽒亮兰染⾊法因其灵敏⽽⼜简便开始重新受到关注；BCA法⼜以其试剂稳定，抗⼲扰能⼒较强，结果稳定，灵敏度⾼⽽受到欢迎；胶体⾦法具有较⾼的灵敏度，可达到毫微克⽔平，⽤于微量蛋⽩的测定。

常⽤的测定蛋⽩质含量⽅法的⽐较⽅法测定范围（µg/ml）不同种类蛋⽩的差异最⼤吸收波长(nm)特点凯⽒定氮法⼩标准⽅法，准确，操作⿇烦，费时，灵敏度低，适⽤于标准的测定紫外分光光度法100—1000⼤280205灵敏，快速，不消耗样品，核酸类物质有影响双缩脲法1000—10000⼩540重复性、线性关系好，灵敏度低，测定范围窄，样品需要量⼤Folin-酚试剂法20—500⼤750灵敏，费时较长，⼲扰物质多考马⽒亮蓝G-25050—500⼤595灵敏度⾼，稳定，误差较⼤，颜⾊会转移BCA50—500⼤562灵敏度⾼，稳定，⼲扰因素少，费时较长由于凯⽒定氮法的操作作过于复杂，双缩脲法的灵敏度⼜太低，下⾯介绍Folin—酚试剂法，考马⽒亮蓝G—250染⾊法，紫外分光光度法、胶体⾦法等⼏种最常⽤使⽤的⽅法。

实验（四）蛋白质浓度测定——Folin-酚试剂法[原理]实验室常规测定蛋白质含量方法中，以Lorry等人发展的Folin-酚试剂法应用最为普遍。

该方法的优点是：灵敏度高，较紫外吸收法灵敏10～20倍，双缩脲法灵敏100倍；操作简单快速，不需要复杂的仪器设备。

但它的不足之处是反应过程中受干扰因素较多。

Folin-酚试剂由试剂A和试剂B两部分组成。

在Folin-酚试剂法中，蛋白质中的肽键首先在碱性条件下与酒石酸钾钠-铜盐溶液（试剂A）起作用生成紫色络合物（类似双缩脲反应）。

由于蛋白质中酪氨酸、色氨酸的存在，该络合物在碱性条件下进而与试剂B（磷钼酸和磷钨酸、硫酸、溴等组成）形成蓝色复合物，其呈色反应颜色深浅与蛋白质含量成正比。

通过比色测定，参照已知含量的标准蛋白质的标准曲线，可确定待测样品的蛋白质含量。

本法可测定蛋白质含量的范围在25～250μg/mL。

由于不同蛋白质所含酪氨酸和色氨酸残基的量不同，致使等量的不同蛋白质所显示的颜色深度不尽一致，产生误差。

如果所用溶液或样品中含有带“-CO-NH2”、“-CH2-NH2”、“-CS-NH2”基团的化合物，或者溶液或样品中含有氨基酸、Tris、核酸、蔗糖、硫酸铵、巯基及酚类等化合物时，会给本方法的测定带来干扰。

磷钼酸-磷钨酸试剂（Folin-酚试剂B）仅在酸性条件下稳定，而蛋白质的显色反应需在pH10的环境中进行，因此当试剂B加入后应当立即充分混匀，以便在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前与蛋白质发生显色反应，这对于结果的重现性非常重要。

[方法与步骤]1、标准曲线的绘制取六支试管，标明编号（0～5），放置在试管架上，在试管内分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL标准酪蛋白溶液，用蒸馏水补足至每管总体积1.0mL。

再加入新配制的试剂A 5.0mL，充分混合，在室温下放置10min。

各管中加入0.5mL试剂B，立即摇匀，然后在室温下放置30min。

以零号管作空白对照，在660nm波长下比色测定。

蛋白质含量测定方法——Folin—酚试剂法Folin—酚试剂法是一种常用的蛋白质定量方法，其原理是蛋白质分子中酪氨酸和半胱氨酸残基在Folin试剂存在下氧化成碘，与酚试剂结合形成一种蓝色复合物。

由于蛋白质的量与Folin 试剂呈正比，因此可以通过比色法测定蛋白质含量。

步骤：1. 准备一系列浓度的标准蛋白质溶液（从低到高），并设置空白对照。

2. 取一定量的Folin试剂和样品混合，充分摇匀后静置2-3分钟。

3. 用酚试剂对样品进行稀释，制备出一系列浓度的标准样品。

4. 对比观察各标准样品的颜色变化，找到蛋白质浓度和颜色的对应关系。

5. 绘制标准曲线，再用于样品蛋白质的测定。

6. 根据样品中剩余的Folin试剂颜色，求出样品中的蛋白质含量。

注意事项：1. 必须严格控制反应温度和时间，以免影响测定的准确度。

2. 在加入Folin试剂后，需要摇动几次以确保充分反应。

3. 如果要测定的样品含有维生素C或其他具有抗氧化性质的物质，需要事先进行去除或中和。

4. 对于浓度过高的样品，建议先进行稀释再进行测定。

在实践中，除了遵循以上步骤，还可以参考以下技巧和经验：* 使用干净的玻璃器具来操作，避免使用塑料器具导致的颜色干扰。

* 在加入Folin试剂后，可以加入少量无水乙醇来稳定颜色反应。

* 在绘制标准曲线时，可以使用不同浓度的标准蛋白质溶液制备一系列梯度样品，这样可以更准确地找到蛋白质浓度和颜色的对应关系。

* 对于未知样品，可以先进行预实验，大致确定蛋白质浓度范围，以便更好地控制实验进程。

总之，Folin—酚试剂法是一种简便、灵敏的蛋白质定量方法，通过遵循正确的步骤和注意事项，可以获得较为准确的测定结果。

然后乘以稀释倍数（300），得出每毫升未稀释血 清含蛋白质的微克数，即每毫升血清中蛋白质的 微克数(μg/ml)。
血清蛋白浓度(μg/ml)=样品蛋白质浓度×2×300
本方法的特点：
优点：1.灵敏度高，比双缩脲法灵敏约100倍。 2.操作简单，不需特殊仪器设备。
缺点：1.费时间较长，要精确控制操作时间 2.标准曲线也不是严格的直线形式 3.专一性较差，干扰物质较多。
– 水浴10min，冷却后，每一分钟测一管。
数据处理
各管A值
测定次数
2
3
4
5
6
1
2
3
各管平均A值
绘制标准曲线
以A500值为纵坐标，牛血清白蛋白标准液浓度 为横坐标，绘制标准曲线。
吸光度A
0.6
.
0.4
.
.
0.2
.
蛋白质浓度C（μg/ml）
计算
根据未知样品溶液的吸光度值，在绘制好的标准 曲线图中查出样品溶液中的蛋白质含量。
40
0.60 2.0
80
0.40 2.0
120
0.20 2.0
160
0.50 0.50 2.0
未知
各管混匀，室温放置10min。 向各管内加入Folin-酚试剂0.20mL, 2s内迅速混匀！ 40℃放置10min。 冷却至室温后，以500nm波长比色，用1号管作空白，读取各管吸光度。
注意事项
复习思考题
1、试述Folin-酚试剂法的优点？ 2、应用本方法有哪些干扰作用？为什么？应
如何注意？
请将答案附在实验报告上！
Lowry’s法（Folin-酚试剂法） 测定蛋白质含量
Determination of protein content by Lowry‘s method