沙门氏菌对养猪业的危害及防治措施
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养猪SWINEPRODUCTION2018第3期
图1猪沙门氏菌病肝脏剖检变化沙门氏菌对养猪业的危害及防治措施
马梓承,古金元,彭涛,王玉超,孟凡亮,刘照虎,王宏宇,胡东方,王方坤,刘思当(山东农业大学动物科技学院,山东泰安271000)
中图分类号:S858.282.61+2文献标志码:A文章编号:1002-1957(2018)03-0123-04
1沙门氏菌分类与临床病变
猪沙门氏菌病(Swinesalmonellosis)是由沙门氏
菌属包括猪霍乱沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌变型、猪
伤寒沙门氏菌、猪伤寒沙门氏菌变型、鼠伤寒沙门氏
菌、德尔卑沙门氏菌、肠炎沙门氏菌等细菌引起的一
种传染病,多发生于2~4月龄仔猪,故又称仔猪副伤
寒。该菌两端钝圆,无芽孢无荚膜,有鞭毛,能运动,革
兰氏染色阴性。沙门氏菌为需氧或兼性厌氧菌,适宜
生长温度为34益,适宜pH为6.7~7.7,在普通的平板
培养基上培养即可,对营养需要不高,菌落呈圆形,直
径为2~3mm,光滑整齐,无色半透明,湿润,对外界因
素如光照等有一定的抵抗力,可以生存数周或数月,
常用化学消毒剂可以将其杀死,对消毒药抵抗力不
强。多数沙门氏菌具有毒素,尤其是肠沙门氏菌、猪霍
乱沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌,具有很强的毒性,75益加热1h毒力依然存在,人食用可引发中毒[1]。1.1不同类型沙门氏菌感染猪后的临床表现
猪副伤寒沙门氏菌。急性型:又称败血型,多发
生于断乳前后的仔猪,常突然死亡。病程稍长者,表
现体温升高(41耀42益),腹痛,下痢,呼吸困难,耳
根、胸前和腹下皮肤有紫斑,多以死亡告终。病程1耀4d。
亚急性和慢性型:为常见病型;表现为体温升高,眼
结膜发炎,有脓性分泌物;初便秘后腹泻,排灰白色
或黄绿色恶臭粪便。病猪消瘦,皮肤有痂状湿疹。病
程持续可达数周,终至死亡或成为僵猪。
猪霍乱沙门氏菌。猪霍乱沙门氏菌是副伤寒沙门
菌的一种,是引起仔猪副伤寒的主要病原菌,可见病畜
体温升高,精神沉郁,食欲减退,发抖,常趴下不起身。
肠炎沙门氏菌。肠炎沙门氏菌是引起急性胃肠
炎的主要病原菌,感染后的典型症状包括发热、腹泻
和呕吐等。
鼠伤寒沙门氏菌。感染后临床表现可分为4
型,即胃肠炎型、败血症型、病灶感染型和无症状带菌型。苍蝇、跳蚤是传播媒介。感染主要通过受污染
的食物传播。鼠伤寒沙门氏菌为侵袭性细菌,主要
侵犯回肠和结肠,也可侵犯整个胃肠道。1.2临床剖检变化
病猪体温高达40.2~41.4益,精神不振、沉郁、寒
颤、食欲降低及下痢,粪便恶臭呈灰黄色水样。眼有
黏性分泌物,呼吸困难。一些病猪出现皮肤发绀,在
耳根、胸前、腹下等皮肤出现紫红色斑点,多数病例
在1~3d内死亡。剖检可见尸体皮下水肿;皮下有大
量出血点;颌下淋巴结肿大、出血坏死;脾脏肿大,颜
色较暗带蓝,似橡皮,有大量出血点及坏死灶;肠系
膜淋巴结索状肿大、出血;肝肿大、充血或出血,有的
肝实质有灰黄色坏死点;肾脏肿大,被膜易剥离,有
出血点;胃肠黏膜、浆膜有散在点状出血;胸腔积液,
心包积液。肠管内有大量液体蓄积,肠道呈坏死性
肠炎,结肠、盲肠壁增厚,黏膜表面覆盖一层弥漫性
糠麸样坏死假膜,剥去假膜可见色红、边缘不规则的
溃疡面[2]。其中,最典型的特殊病变为肝脏布满灰黄
色坏死灶,如图1。
收稿日期:2018-01-07基金项目:国家重点研发计划项目“猪重要疫病免疫防控新技术研究”子课题“规模化猪场科学合理的免疫程序的研究(2017YFD0500605)”支持
作者简介:马梓承(1993-),男,山东济南人,硕士,主要从事动物临床病理学研究工作
.E-mail:843721928@qq.com123目前,有关动物和动物产品沙门氏菌检测方法
中国现行的国家标准为NY/T550—2002,传统的培
养检测方法仍广泛使用。该方法虽然准确度高,但
耗时长,至少要3d才能有初步结果,需要4~7d才
可得到明确的诊断结果,不够方便快捷[4]。2.2免疫学方法
由于细菌存在特征性的菌体抗原或鞭毛抗
原,制备相应特异性的抗体便可用于快速检测特
定的病原。利用抗体抗原结合的特异性和免疫放
大技术,可建立十分灵敏的检测方法。目前,免疫
学方法被广泛地应用于沙门氏菌检测,主要包括
酶联免疫吸附法(ELISA)、斑点酶联免疫吸附法
(Dot-ELISA)、免疫荧光标记法(FIA)、免疫磁性分
离法(IMS)[5]。2.3分子生物学方法
分子生物学方法采用体外分子探针检测细菌
核酸某段特异性的序列片段,对探针加以酶标、同位
素等标志物,即可达到检测目的。目前主要的技术方法包括:PCR、多重PCR、实时荧光定量PCR、原位
荧光环介导等温扩增(LAMP)技术、基因芯片技术、
核酸探针技术。盘宝进等[6]对沙门氏菌进行PCR扩
增,其产物片段大小为284bp,引物序列如表1,电
泳结果如图3。
表1PCR/RT-PCR引物序列
病原引物序列(5'—3')退火温度/益扩增大小/bp
沙门氏菌5'-TCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3'552845'-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3'2沙门氏菌的检测方法
由沙门氏菌引起的中毒病在世界各地的食物
中毒病例中所占比例非常高。有资料统计,在我
国70%~80%细菌性食物中毒事件是由沙门氏菌
引起,而由沙门氏菌引起中毒的食品中,约90%
是肉、蛋、奶等畜产品。目前,在进行食品质量安
全监控的中国计量认证检测时,沙门氏菌的检测
已成为必检的卫生指标之一。传统的检测方法是
先采用非选择性和选择性增菌,然后分离培养、
生化反应和血清学鉴定,检验程序十分繁琐,且
肠杆菌科细菌间的生化反应多有交叉,需4~7d
才能完成,因此传统的检测方法在快速、敏感与
特异性等方面有自身的局限性。随着分子生物学
及分子细菌学的发展,病原菌分离培养鉴定、酶
联免疫吸附法(ELISA)、PCR等以其迅速、简便和
灵敏等优点成为科研和临床诊断的技术热点,已
广泛用于食品中以及临床样品和环境中的沙门氏
菌的检测[3]。2.1传统分离鉴定培养
首先应采集病变样品,病猪取肝脏,粪便,回肠、
盲肠或结肠内容物,然后对样品进行沙门氏菌的分
离和鉴定,通常包括4个步骤:淤预增菌:将样品置
于营养性培养基中,保证正常和受损的沙门氏菌的
存活;于选择性富集:保证沙门氏菌的生长并抑制其
它微生物生长,多采用两种选择性培养基进行平行
试验;盂分离纯化:在沙门氏菌选择性平板上划线培
养,然后挑取单菌落进行纯培养;榆鉴定:方法主要
包括显微镜检查、生化鉴定和血清凝集试验。将纯化
后的沙门氏菌进行革兰氏染色,以参考菌株为对照
在油镜下进行辨别观察。然后进行生化鉴定试验,读
取生化鉴定试纸条生化指标,判断是否符合沙门氏
菌特性。还可采用诊断血清对纯培养菌株进行玻片
凝集试验,以无菌生理盐水为对照,1min内明显凝
集即为阳性,呈均匀浑浊者即为阴性。图2分别列举
了沙门氏菌分离纯化(DHL板)、革兰氏染色镜检
(双侧对称短杆状)及生化试验结果。
图2沙门氏菌传统分离鉴定方法
M284bp
图3琼脂糖凝胶电泳结果M为DL2000DNAMarker,其余孔道均为所提纯的沙门氏菌。2018养猪SWINEPRODUCTION(3)124养猪SWINEPRODUCTION2018第3期
3沙门氏菌不同血清型间差异与药敏试验
沙门氏菌具有复杂的抗原结构,一般分为菌体O抗原和鞭毛H抗原,极个别的沙门氏菌含有荚
膜Vi抗原。目前,根据Kauffman-White(K-W)血清
型分型方法,基于沙门氏菌菌体抗原及鞭毛抗原的
差异,可分为2600种沙门氏菌血清型[7]。O抗原是
包含在脂多糖(LPS)中的特异性多糖物质,是革兰
氏阴性细菌的一个重要组成部分。编码O抗原的
基因通常位于染色体上一个称为rfb的基因簇中,rfb基因参与核普酸糖的生物合成途径以及重复单
元组件的转移。Wzx基因(即rfbX基因)可编码一
种跨膜蛋白,这种跨膜蛋白由12种跨膜片段组合
而成,并存在于所有这些沙门氏菌O抗原基因簇
中。不同O抗原簇中的Wzx蛋白具有结构同源性。
然而它们在氨基酸序列水平上极少相似[8]。有研究
指出,Wzx蛋白的功能就是负责把O-单元从细胞
质运送到细胞质膜的周质侧[9]。另一方面,鞭毛抗原H1和H2分别由fliC基因和fljB基因编码,这两个
基因的末端都很保守,而在其编码抗原的中心区域
却高度可变[10-11]。
人们一直在研究代替或补充传统血清分型方
法的分子检测方法,如核糖分型[12]、RAPD分子标记
技术[13]、IS200分型技术[14]分析等。随着人们研究的
不断深入,PCR及其它以核酸为基础的分子诊断技
术在生物学分类鉴定方面应用愈加广泛,大幅缩短
了实验室检测时间,而且易于规范化,对人员要求不
高,在一定程度上弥补了传统鉴定分型方法的不足[15]。
施开创等[16]采用MLST预测及PCR直接测定的方法
对沙门氏菌21种常见血清型进行鉴定,其中PCR方
法是基于编码不同抗原O抗原、H1抗原和H2抗原
的基因设计的,相较于MLST预测方法,PCR方法能
够更为准确、直接地鉴定沙门氏菌血清型,具有耗时
少、费用低等优点,并能与其它分型方法相结合,具
有更为广阔的应用空间。
药敏试验根据血清型的不同,选用34种沙门
氏菌病原进行,其中有A群1株、B群15株、C2群1株、D群14株和未定型3株,如表2。对已鉴定的34株致病性沙门氏菌分离株采用ATBVET药敏试剂条法和K-B纸片法进行抗菌
药物敏感性试验,分别通过ATB仪读取结果和人
工游标卡尺测量结果并进行比较分析。由表3可
知,34株分离株均对美洛培南、亚胺培南、大观霉
素和安普霉素敏感;对氯霉素、卡那霉素、庆大霉
素的耐药率小于10%,对阿莫西林、链霉素、氟甲
喹、噁喹酸、磺胺甲噁唑、四环素和呋喃妥因耐药
率介于50%和90%之间,而对红霉素、林可霉素、
原始霉素、泰洛星、青霉素、苯唑西林、夫西地酸、
利福平和甲硝唑的耐药率达到100%,耐药性严
重,且存在多重耐药现象,如表3。
表234株沙门氏菌分离株的血清型分析
沙门氏菌O抗原H抗原所属亚群分离株数目第1相第2相副伤寒沙门氏菌1、2、12a-A1鼠伤寒沙门氏菌1、4、5、12i1、2B14里定沙门氏菌4、5、12e、h1、5B1纽波特沙门氏菌6、8e、h1、2C21鸡白痢沙门氏菌1、9、12--D12肠炎沙门氏菌1、9、12g、m1、7D1伤寒沙门氏菌9、12d-D1沙门氏菌属(未定型)A-F价凝集---3总分离株数34注:“-”表示没有。马梓承,等.沙门氏菌对养猪业的危害及防治措施
最小抑菌浓度/(滋g·mL-1)耐药菌数耐药率/%
青霉素0.2534100.00
克拉霉素41647.06
阿莫西林41955.88
苯唑西林234100.00
头孢噻吩81544.12
头孢哌酮41338.24
美洛培南0.1500
亚胺培南0.1500
氯霉素812.94
链霉素83088.24
大观霉素6400
卡那霉素825.88
庆大霉素412.94
安普霉素1600
红霉素134100.00
林可霉素234100.00
原始霉素234100.00
泰洛星234100.00
多黏菌素4617.65
氟甲喹42161.76
噁喹酸22573.53
依氟沙星0.51544.12
复方新诺明2514.71
磺胺甲噁唑1002985.29
四环素41955.88
多西环素41647.06
呋喃妥因252470.59