生物药物分析

1 / 16 生物药物分析复习

第一章 绪论

药物分析性质：应用化学，物理化学和生物化学方法和技术对药物质量进行全面控制学科。

药物分析任务：药物研制过程中“眼睛”；制定药物质量标准；生产过程中质量控制；开展临床药学研究；常规药品检验。

*药品质量标准： 国家对药品质量及检验方法所做技术规定。是药品生产，经营，使用以及检验和监督管理部门共同遵循法律依据。

*中国药典内容：凡例，正文，附录，索引。

药检工作基本程序：取样，鉴定，检查，含量测定，书写检查报告。

酶法分析（终点法，酶循环放大分析法，速度法）是利用酶作为工具对特定物质（底物、辅酶、抑制剂和激动剂等）进行定量分析方法。

终点法(总变量法 ) 测定原理：先借助酶反应（单个酶反应或几种酶构成偶联酶反应）使被测物定量进行转变，然后在转变完成后，测定底物，产物或辅酶物质变化量，因此称为终点法。

终点法条件：1.必须有专一地作用该被测物质酶，并能得到它制品；2能够确定使这种酶反应接近进行完全条件；3.反应中底物减少或产物增加或辅酶物质改变等可以借助某种简单方法进行测定；4.在能满足这些条件情况下，最好是采用单一酶反应就能进行定量检测。使用终点法测定应注意问题：酶底物专一性（最好是绝对专一性）；反应平衡；反应液中酶量；反应产物抑制。

终点法种类

（一）单酶反应定量法：

1、底物减少量测定：胞嘧啶（280nm）、腺嘌呤（280nm）和尿酸（293nm或297nm）。

2.产物增加量测定：（1）各种氨基酸和草酸（2）黄嘌呤、次黄嘌呤以及CoA

** 3.辅酶变化量测定（理解例子 学会如何进行实验设计和分析）

条件：测定以NAD或NADP为辅酶脱氢酶底物量。

原理：NADH和NADPH在340nm有特征最大吸收峰，而NAD和NADP在340nm却无这一吸收带，故可应用于NAD或NADP为辅酶脱氢酶反应，通过测定340nm吸光度变化，就可以对作用相应脱氢酶底物物质进行定量分析。

（二）和指示酶反应偶联定量法

1.以脱氢酶为指示剂（理解例子 学会如何进行实验设计和分析）

2.以脱氢酶以外酶作为指示剂

酶循环放大分析法具有化学放大作用，理论上可无限放大其灵敏度。是利用酶循环设计一种超微分分析法。

步骤：转换反应，循环反应，指示反应

转换反应 ： 以试样中待测组分为底物，经特异反应生成及待测组分相当定量循环底物。

循环反应 ：生成循环底物反复参加由两个酶反应组成偶联反应，所得产物量为循环底物若干倍。

指示反应 ：采用酶法测定反应产物。由反应产物量及循环次数，计算出循环底物量，再推算出试样中待测组分量。

酶循环放大分析法应用范围

1.有循环底物参加酶反应底物或酶可测定(NAD、NADP、CoA)

2.能及以上反应偶联酶反应底物或酶可测定（G ATP HK）

酶循环放大分析应该注意问题:

1.在进行循环之前，必须完全除去转换反应中剩余辅酶；

2.在循环反应中底物（不是辅酶）必须过量；

3.要用已知量循环底物做循环反应和指示反应以求得循

免疫分析——利用抗原抗体反应检测各种物质（药物、激素、蛋白质、微生物等）方法。

抗原及抗体 性质 及其相互作用

免疫球蛋白分子由两条重链（H链）和两条轻链（L链）通过不同数目二硫键结成Y形。在抗体分子N端为“多变区”（V区），是抗体分子及抗原决定簇结合部位；抗体分子C端为“稳定区”（C区），是抗体抗原特异性部位。

抗原抗体结合具有 高度特异性 。抗原特异性取决于抗原决定簇数目、性质和空间构型，而抗体特异性则取决于抗体Ig Fab段可变区及相应抗原决定簇结合能力。抗原及抗体通过很弱短矩引力而结合，如 范德华引力、静电引力、氢键及疏水性作用等。

免疫扩散技术

基本原理 ：可溶性抗原和相应抗体在溶液或凝胶中彼此接触，形成不溶性抗原-抗体复合物沉淀。 2 / 16 双向免疫扩散基本原理 ：指可溶性抗原及相应抗体在琼脂介质中相互扩散，彼此相遇后形成一定类型特异性沉淀线。如果反应体系中含两种以上抗原抗体系统，则小孔间可出现两条以上沉淀线。

双向免疫扩散 应用 ：1.抗原、抗体相对含量测定；2.抗原、抗体相对分子量分析

酶免疫分析技术基本原理 ：指酶标记抗体或酶标记抗体进行抗原抗体反应。它采 用抗原及抗体特异反应及酶连接，然后通过酶及底物产生颜色反应，用于定量测定。

酶联免疫吸附试验（ ELISA ） ：结合在固相载体上抗原（抗体）及待检抗体（抗原）酶偶联物（标记物）反应后，催化水解或氧化还原酶相应底物呈色，其颜色深浅及待测抗原（抗体）含量成正比。

包被 ：指将抗原或抗体固相化过程。它是通过物理吸附作用，一般靠疏水键连接。

封闭：指用封闭剂封闭经包被固相载体表面残留未饱和位吸附位点过程。

常规使用ELISA技术主要有：

直接ELISA：测抗原 间接ELISA：测抗体 夹心ELISA：测抗原 竞争ELISA：测抗体或抗原及半抗原

反向捕捉ELISA：测特异性IgM 单位点非竞争ELISA：主要测半抗原 细胞ELISA：测细胞表面抗原

夹心ELISA

• 基本原理 ：样品中抗原及载体上抗体结合，经洗涤加入该抗原酶标记抗体，洗去未结合酶标抗体，加底物显色，可定量测定抗原。

• 双抗体夹心法测抗原 ：应用针对抗原两个不同决定族两种单抗分别作为固相载体包被和酶标抗体，以检测相应抗原。此法适用于测定二价或二价以上大分子抗原。

• 双抗原夹心法测抗体 ：用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应抗体。及间接法测抗体不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。

• 此法适用于多价大分子抗原（血清中HBsAg、AFP和尿液hCG）检测，而不能用于测定半抗原等小分子物质。

竞争ELISA

• 竞争法测抗体 ：待测抗体和一定量酶标抗体竞争及固相抗原结合。当抗原材料中干扰物质不易除去，或不易得到足够纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。

竞争法测抗原 ：待测抗原和一定量酶标抗原竞争及固相抗体结合，结果如待测抗原含量越多，及固相抗体结合酶标抗原就越少，显色越浅，二者呈负相关。

放射免疫测定RAI基本原理：放射性标记已知抗原（*Ag）和非标记待检抗原（Ag）同时及限量特异性抗体进行竞争结合或竞争性抑制反应，通过测定结合（ *Ag-Ab ）或游离（ *Ag ）放射性标记抗原量，根据标准曲线即可推算出被测物含量一种超微量分析技术。

免疫放射分析（ IRMA ）基本原理：用过量核素标记抗体及待测抗原形成复合物，并用固相免疫吸附剂作为B或F分离手段除去多余游离抗体，测量抗原抗体复合物放射性。

放射免疫及免疫放射原理区别

IRMA及RIA工作原理主要区别

项目 RIA（放射免疫） IRMA（免疫放射）

反应机制 竞争性反应 非竞争性全量反应灵敏度提高（10-100倍）

反应试剂 三种 标记抗原 二种 标记抗体

分离方法 抗原只需一个抗原决定簇 一般需单抗作分离剂，抗原需两个或两个以上决定簇

待测抗原复合物

放射性 及待测抗原呈负相关 及待测抗原呈正相关

非特异性结合 主要影响高剂量反应 主要影响低剂量反应

待检抗原性质 半抗原及大分子 蛋白质、酶等生物大分子

ELISA操作要点：

• 加样 ：即加标本、酶结合物和底物，注意交叉污染和产生气泡。

• 温育 ：常采用温度：43℃、37℃、室温和4℃（冰箱温度）。

• 洗涤 ：是ELISA最主要关键技术，目是分离游离和结合酶标记物。洗涤方式自动板机、手工操作（浸泡式和流水冲洗式）。 3 / 16 • 显色 ：影响因素：反应温度和时间；OPD底物液应避光显色，硫酸终止；TMB显色终止液：叠氮钠、SDS、各类酸性终止液。

比色 ：以蒸馏水校零点，测读底物孔（未经任何反应仅加底物液孔）和空白孔（以生理盐水或稀释液代替标本作全过程孔）。

*生物检定 是利用生物体包括整体动物、离体组织/器官、细胞和微生物等评估药物生物活性一种方法。它以药物药理作用为基础，以生物统计为工具，运用特定实验设计在一定条件下比较 供试品 和相当 标准品 或 对照品 所产生特定反应，通过等反应剂量间比例运算或限值剂量引起生物反应程度，从而测定供试品效价、生物活性或杂质引起毒性。

生物检定作用：

生物检定法具有独到优势，主要表现在：

(1)直接关切生化药物有效性和安全性；

(2)量效关系确切，可为临床用药剂量规范化提供参考；

(3) 是反映产品质量重要指标，具有专属性。

生物检定在药物分析中应用：1、药物效价测定；2、大分子结构测定；3、微量生理活性物质测定；4、药物毒性成分及有害杂质限度检查；5、新药研究。

电泳技术基本原理

电泳：带电粒子在电场中定向移动。

在电解质溶液中，位于电场中带电离子在电场力作用下，以不同速度向其所带电荷相反电极方向迁移现象，称之为电泳。由于不同离子所带电荷及性质不同，迁移速率不同，可实现分离。

电泳法:指带电微粒如蛋白质、核苷酸、其他微粒分子或离子在电场作用下，向其对应电极方向按各自速度泳动而使组分分离，再进行检测或计算百分含量方法。

颗粒在溶液中迁移 驱动力 ：颗粒有效电荷和电位梯度。

影响电泳速度 因素 ：颗粒性质；电场强度；溶液性质；电渗；焦耳热；筛孔:

聚丙烯酰胺凝胶电泳原理：以孔径大小不同聚丙烯酰胺凝胶为支持物，采用电泳基质不连续体系（即凝胶层、缓冲液离子成分、PH、电位梯度均不连续），使样品在不连续两层凝胶之间积聚浓缩成很窄样品区带（厚度为0.1毫米），然后再进行分离，从而提高了分辨率。

PAGE不连续系统原理及技术

不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳三种物理效应 ：样品浓缩效应 ; 分子筛效应 ; 电荷效应。

样品浓缩效应:①凝胶孔径不连续性 ②缓冲液离子成份不连续性 ③PH不连续性④电位梯度不连续性

*三种物理效率使样品分离效果好，分辨率高。

⑴一般电泳分离电荷效应：带电多，MW小，迁移快

⑵不连续系统对样品浓缩效应：迁移率，被压成薄层

⑶凝胶对样品分子筛选效应

影响蛋白质及SDS结合程度因素：溶液中SDS单体浓度；样品缓冲液离子强度；二硫键是否完全被还原

SDS-PAGE测定蛋白质分子量原理和技术

十二烷基硫酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂，能使蛋白质氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质—SDS复合物。蛋白质带上相同密度负电荷；SDS及蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象改变；凝胶电泳中迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状影响，只及蛋白质分子量相关。蛋白质分子电泳迁移率主要取决于它分子量大小，而及所带电荷和形状无关。

影响迁移率因素：⑴二硫键是否完全被还原；⑵溶液中SDS浓度；⑶溶液离子强度

等电聚焦电泳(IEFE)是一种利用具有 pH梯度 支持介质分离 等点电不同 蛋白质电泳技术。

等电聚焦 就是在电泳介质中放入载体两性电解质，当通以直流电时，两性电解质即形成一个由阳极到阴极逐步增加pH梯度，在此体系中，不同蛋白质即移动到或聚焦于其相当等电点位置上，也就是说被聚焦于一个狭区带中。

*理想载体两性电解质应具备特征：

①分子量要小，以便及被分离大分子物质分离；

②化学性质稳定；

③各成分pI彼此接近，并在其pI值附近有良好缓冲能力；

④在pI处具有足够电导，导电性均匀；