等电聚焦电泳

等电聚焦电泳测定血清蛋白质等电点

【实验原理】

等电聚焦电泳是利用具有pH梯度的两性电解质为载体，分离等电点(pI)不同的蛋白质等两性分子的电泳技术。在IEF电泳系统中，具有一个从阳极到阴极，pH值逐渐增大的连续而稳定的pH梯度，处于此系统的各种蛋白质分子，将根据各自的pI值与所处位点的pH值的差别带上正电或负电。当蛋白质分子向相反电极移动的过程中，其逐渐靠近与其DI相同的pH位点，直至到达pH=pI，净电荷为零而停止移动，从而达到聚焦。因此，将pI不同的蛋白质混合物加入有pH梯度的凝胶介质中，在电场内经过一段时间后，各组分会分别聚焦在各自pI相应的pH位置上，形成分离的蛋白质区带。根据电泳装置的不同，IEF可分为管型IEF和平板型IEF，本实验介绍管犁PAGE—IEF．

【试剂与器材】

1．凝胶贮备液称取丙烯酰胺(Acr)20g，甲叉双丙烯酰胺(Bis)0．8g，蒸馏水溶解后定容至100mL，过滤，将未溶物滤去，盛于棕色瓶中，4℃冰箱保存。

2．1％(V/V)TEMED溶液。

3．5g/L过硫酸铵 称取过硫酸铵0．5g，溶于蒸馏水100mL，冰箱存放，每周新配。

4．40％两性电解质载体。

5．0．5mmol/L磷酸溶液 量取85％磷酸16mL，加蒸馏水定容至500mL。

6．0．5mmol/L NaOH溶液 称取NaOH10g，加蒸馏水溶解并定容至500mL。

7．1g/L考马斯亮蓝固定染色液称取考马斯亮蓝R250 lg，溶于含甲醇200mL、乙酸100mL和蒸馏水700mL的混合液中，过滤后备用。

8．酸性乙醇脱色液 乙醇25份，蒸馏水25份，冰醋酸8份，混匀备用。

9．血清样本 血清无须稀释，但最好透析去除离子。

10．电泳仪 选用电子管或晶体管整流电源，电压0~600V，电流0~300mA。

11．电泳槽 圆盘电泳槽及电泳玻管。

12．锥形瓶，250px长针头或腰椎穿刺针头，5mL或10mL注射器。

等电聚焦电泳介绍

点击次数：315 作者：佚名 发表于：2008-08-07 00:00 转载请注明来自丁香园

来源：互联网

主要仪器试剂

仪器：微型电泳系统、电源、注射器、固定和染色用容器

试剂：丙稀酰胺、双－丙稀酰胺、载体两性电解质、尿素、过硫酸胺、TEMED、TritonX－100、2－巯基乙醇、溴酚蓝、磷酸、氢氧化钠、氯化钾、三氯乙酸、考马斯亮蓝、甲醇、乙酸。

储存液：1）30%（w/v）丙稀酰胺，1%（w/v）双－丙稀酰胺；2）20%Triton X100；3）10%三氯乙酸；4）1%三氯乙酸；5）1%溴酚蓝；6）考马斯亮蓝染色液；7）考马斯亮蓝脱色液；

灌胶

以灌制8cm×7cm×0.75mm pH4-6变性等电聚焦凝胶的配方。其他pH范围等电聚焦可以参考表格来配置。

水：5.4ml； 储存液1）：2.0 ml； 载体两性电解质溶液pH3.5-10 48μl； 载体两性电解质溶液pH4-6 240μl； 超纯尿素 6.0 g ；10%过硫酸胺25μl； TEMED：20μl

灌胶步骤：

1.组装灌胶器；

2.将尿素、水、溶液和载体两性电解质溶液混匀，避免剧烈摇动，轻微加热尿素溶解更快（带手套，丙稀酰胺有毒）；

3.加入过硫酸胺和TEMED，轻轻混匀（开始聚合，操作要迅速）；

4.将上述混匀溶液倒如灌胶器（尽量避免气泡产生）；

5.插入梳子，将梳子侵入胶内（不要产生气泡）；

6.聚合约1小时；

7.聚合完成，小心拔去梳子；

8.将凝胶同冷却装置连接后插入电泳池，蛋白样品上样前最好用阳极电极液注入上槽中确定是否有渗漏。

注意：

1.上样前冲去上样空底部未聚合的丙稀酰胺，否则电泳过程中会发生聚合；

2.现在有商品化的等电聚焦凝胶，但只限于水平平板电泳系统（如Pharmmacia－LKB,Hoefer）.

样品制备和上样

一般不同厚度的凝胶，不同的梳孔数目会有不同的上样量，例如：0.75mm厚、15孔的凝胶每孔最大上样量大约15μl。

等电聚焦电泳（IEF）分离蛋白及测定蛋白质等电点

等电点聚焦 （IEF ）是在电场中分离蛋白质技术的一个重要发展， 等电聚焦是在稳定的 pH 梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方法。 在电场中充有两性载体和抗对流介质， 当加上电场后， 由于两性载体移动的结果， 在两极间 逐步建立稳定的 pH 梯度，当蛋白质分子或其他两性分子存在于这样的 pH 梯度中时，这种

分子便会由于其表面电荷在此电场中运动， 并最终达到一个使其表面静电荷为 0 的区带， 这 时的

pH 则是该分子的 pI ，聚焦在等电点的分子也 会不断扩散，一旦偏离其等电点后，由 于 pH 环境的改变，分子又立即得到正电荷或负电荷，从而又向 pI 迁移。因此，这些分子 总会是处于不断扩散和抗扩散的平 衡中，在 pI 处得以 “聚焦 ”.

二、仪器与试剂 1．材料：蛋白样品 2．试剂： 聚丙烯酰胺、甲乙聚丙烯酰胺、两性电解质、尿素、 NP-40、 teiton-100

电极液： 1M 磷酸（阳极液） 、 1M 氢氧化钠（阴极液）

固定液：100g三氯乙酸、10g磺基水杨酸溶于 500ml，定容为1000ml

染色液：0.35g考马斯亮蓝 R— 150溶于300ml脱色液中，加热到 60 - 70C,加入0.3g硫酸 铜。

脱色液： 25％乙醇、 8％冰乙酸溶于水

样品缓冲液 :1％Ampholine 、 2％Triton X-100 、 9M 尿素

三、操作步骤：

1, 样品制备： 用 IEF 样品缓冲液提取待分析样品， 如其他缓冲液提取的样品则应透析后， 冷冻干燥、 再复 溶于 IEF 样品缓冲液。充分溶解后，离心去除不溶杂质。

2, 制模具：

洗干净两块 IEF 专用玻璃板，进行硅化和反硅化处理，两块玻璃板的硅化和反硅化面相对， 放上夹条，夹子夹好。

3, 配胶：

胶液组成： 6ml 胶母液（ 10％， 19/1）

6— 8 ％尿素

- 1 - 等电聚焦电泳

等电聚焦电泳（dielectrophoreticfocusing）是一种用于细胞、分子、纳米颗粒和其他微流体的微流控技术，通过利用非线性电势场的电力作用力而形成。等电聚焦电泳被广泛应用于医学、生物、农业等领域，用于扩大细胞、分子的空间分布，增强特定类型的细胞和分子的活性，以及改善生物和化学分离等。

等电聚焦电泳技术是借助电力作用力而产生的，它可以控制和操纵介观尺寸细胞及其他形态、性质及体积的微流体，并将它们集中在一定的位置上，使得它们可以形成一个固定的浓度差，从而有效地改变细胞组织或分子组织。此外，等电聚焦电泳可以将细胞和分子单独分离，用于研究其功能、形态和特性，对细胞组织的分离比传统的手工分离有更高的灵活性和精确度。

等电聚焦电泳技术主要包括三个关键步骤：电场的制备，细胞或分子组织的悬浮和集中以及离心纯化等步骤。首先，电场的制备涉及制造一个稳定的电场，也就是控制静电场的强度，以及形成旋转电场的大小及方向，以使细胞或分子组织能够在最佳的条件下在电场中运动。其次，通过几种方法将细胞或分子组织悬浮在溶液中，并且在电场中形成一定的浓度差。最后，采用离心力来调节浓度差，以集中细胞或分子组织。

等电聚焦电泳技术有许多优势可以利用，其中最大的优势是可以在低成本、高效率和高精确度的情况下分离细胞、分子和纳米颗粒。等电聚焦电泳技术也具有较强的灵活性，可以根据实验需求设 - 2 - 计合适的电场，以实现一些特殊的功能要求，例如分离染色体、调整细胞的形态和性质、对微流体进行排序，并且可以在体外环境实现实验工作，不会受到体内环境的限制。

等电聚焦电泳技术是一种重要的技术，它可以确保细胞、分子和纳米颗粒的有效分离，有助于研究各种特定类型的细胞及其功能，也可以用于分离细胞组织或分子组织，增强特定类型的细胞和分子的活性，以及改善生物和化学分离。随着技术的进步和发展，等电聚焦电泳技术的应用也会越来越广泛，在不久的将来会得到更多的应用，有助于推动科学和技术的发展。