黑曲霉液体发酵产纤维素酶酶系均衡性研究

第３１卷第４期　２００３年８月　浙江工业大学学报　ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＺＨＥＪＩＡＮＧ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ　０Ｆ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ　Ｖｏ１．３１　Ｎｏ．４　Ａｕｇ．２００３　

文章编号：１００６—４３０３（２００３）０４—０４３９—０５　

黑曲霉液体发酵产纤维素酶酶系均衡性研究　

吴石金，郑丽琴，夏一峰　（浙江工业大学生物与环境工程学院，浙江杭州３１００３２）　

摘要：采用ｐＨ值和温度两因素用正交实验法分析出黑曲霉７１０７１２纤雏素酶系各组分最适　酶解条件，其组合分男ｑ为：Ｃ１酶（ｐＨ５．０，４５℃），Ｃｘ酶（ｐＨ４．０，６０。Ｃ），　（ｐＨ５．０，６５℃）。　

在液体发酵条件下，探讨缓冲系统以及ＣａＣ１　及吐温一８Ｏ对产酶的影响；分析了不同碳源　

以及碳源与碳源的配比对黑曲霉产纤维素酶系均衡性的相关性。结果表明碳源的种类和配　比对最大酶活及其形成时间、比酶活和分泌变化规律均有不同影响效应。纤维素粉和麦麸　

浓度配比为１．Ｏ　和２．Ｏ　时可明显改善所产纤维素酶系的均衡性；用０．１Ｍ柠檬酸一磷酸　氢二钠缓冲液和添加适量ＣａＣ１　（Ｏ．３％）和吐温一８Ｏ（Ｏ．３％）对产酶有正向影响。　

关键词：黑曲霉纤维素酶系；发酵工艺；酶系特性　中图分类号：Ｑ５５６．０３　文献标识码；Ａ　

Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ｏｆ　ｃｅｌｌｕｌａｓｅ　ｓｙｓｔｅｍｓ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ７１０７１２　

Ｏ　ＷＵ　Ｓｈｉ—ｊｉｎ，ＺＨＥＮＧ　Ｌｉ—ｑｉｎｇ。ＸＩＡ　Ｙｉ—ｆｅｎｇ　（Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ　３１００１４，Ｃｈｉｎａ）　

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｂｙ　ａｄｏｐｔｉｎｇ　ｏｒｔｈｏｇｏｎｏｌ　ｔｅｓｔｓ，ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍａｌ　ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ｈｙｄｒｏｌｙｔｉｃ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｅｌｌｕｌａｓｅ　ｓｙｓｔｅｍ　ｏｆ　ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ７１０７１２　ａｒｅ　ｆｏｕｎｄ　ｔｏ　ｂｅ　ｐＨ　５．０，４５。Ｃ　ｆｏｒ　ｅｎｚｙｍｅ　Ｃ１，　

ａｎｄ　ｐＨ　４．０，６０℃ｆｏｒ　ｅｎｚｙｍｅ　Ｃｘ　ａｎｄ　ｐＨ　５．０，６５℃ｆｏｒ　ｅｎｚｙｍｅｌ￣Ｇ．Ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌｉｑｕｉｄ　ｓｔａｔｅ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，ｗｅ　ｓｔｕｄｉｅｄ　ｔｈｅ　ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ＣａＣ１，ａｎｄ　Ｔｕｗｅｎ一８０　ｏｎ　ｔｈｅ　ｐｒｏｄｕｃ—　

ｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｅｌｌｕｌａｓｅ　ｓｙｓｔｅｍｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｃ—ｒｅｓｏｕｒｃｅ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｂａｌａｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｅｌｌｕｌａｓｅ　ｓｙｓ—　

ｔｅｍ　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ７１０７１２．Ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅｒｅ　ｅｘｉｓｔ　ｃｅｒｔａｉｎ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｂａｌａｎｃｅ　ｏｆ　ｃｅｌｌｕｌａｓｅ　ｓｙｓｔｅｍ　ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ　ｃｏｉｎｃｉｄｉｎｇ　ｗｉｔｈ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　Ｃ—ｒｅｓｏｕｒｃｅ　ａｎｄ　ｔｈｅ　

ｄｏｓｅ　ｖｏｌｕｍｅｓ　ｏｆ　Ｃ—ｒｅｓｏｕｒｃｅ　ａｂｏｕｔ　ｔｈｅ　ｃｅｌｌｕｌａｓｅ　ｓｙｓｔｅｍ．Ｔｈｅ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＣａＣ１２（０．３　）　

ａｎｄ　Ｔｕｗｅｎ一８Ｏ（Ｏ．３　）ａｌｓｏ　ｓｈｏｗｓ　ａ　ｃｅｒｔａｉｎ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｎｚｙｍｅｓ．　

Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ；ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｓｓ；ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ｏｆ　ｃｅｌｌｕｌａｓｅ　ｓｙｓｔｅｍ　

引　

真菌纤维素酶系（Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ　ｓｙｓｔｅｍ）是一类复杂的复合酶，一般包括３种水解酶：（１）内切ｆ｝＿１，　

收稿日期：２００２—０８一ｌ５；修订日期：２００３—０４一ｌ２　基金项目：青年发展基金科研资助项目（Ｘ１０５２０１３）　作者筒介：吴石金，男（１９７１一），硕士，讲师，从事生物化学与分子生物学等方面的研究。

　维普资讯 http://www.cqvip.com 浙江工业大学学报　第３１卷　

４一葡聚糖酶（ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅ，ＥＣ３．２．１．４，简称Ｃ１酶或ＥＧ；（２）外切　１，４一葡聚糖酶（ｅｘｏｇｌｕｃａｎａｓｅ，　

ＥＣ３．２．１．９１，简称Ｃｘ酶或外切纤维二糖水解酶即ＣＢＨ）；（３）　葡萄糖苷酶（　ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ，ＥＣ３．２．　

１．２１，简称ＢＧ或纤维二糖水解酶）［¨。Ｃ　酶和Ｃｘ酶均有多种异构体，只有各组分酶的共同协同作　

用，才能将纤维素成分彻底水解为葡萄糖。纤维素酶的生产过去多采用固体曲发酵法，后来由于这　

种方法难于控制和酶提取过程复杂，　利于现代化流水作业。相反，液体深层发酵具有易控制易提　

取等优点，具有十分看好的研发潜力　］。我国液体深层发酵生产纤维素酶尚处于初步试验和开发阶　

段，许多发酵条件有待于优化，这是本文立题的依据。就黑曲霉纤维素酶分泌特性方面，人们一般是　

从单一组分酶的考虑分析，而未对三种酶组分同时进行其均衡性及相互之间的影响效应进行分　

析Ｅ。“］，本文在液体发酵条件下就针对酶系均衡性等问题进行了探讨，为进一步深入研究提供理论　

依据。　

１材料与方法　

１．１培养基　（１）种子培养基：ＮａＮＯ３　２　ｇ，ＫＨ２ＰＯ　１　ｇ，ＫＣ１　０．５　ｇ，ＭｇＳＯ　０．５　ｇ，ＦｅＳＯ　０．０１　ｇ，蔗糖３０　ｇ，　

琼脂１５　ｇ，水定容１０００　ｍｌ，ｐＨ自然。　

（２）分离纯化培养基：ＫＨ　ＰＯ　０．２５　ｇ，ＭｇＳＯ　０．１２５　ｇ，琼脂７．０　ｇ，明胶１．０　ｇ，微晶纤维素０．　

９４　ｇ，刚果红０．１　ｇ，蒸馏水５００　ｍｌ，ｐＨ７。　

（３）基础培养基：Ｋ２ＨＰＯ４　３．０　ｇ，ＭｇＳＯ４　０．５　ｇ，ＮＨ４ＮＯ３　５．０　ｇ，ＣａＣ１２　３．０　ｇ，ＭｎＳＯ４　２．５　ｍｇ，　

ＦｅＳＯ４・７Ｈ２ｏ　７．５　ｍｇ，Ｃｏｌ２　３．０　ｍｇ定容１０００　ｍｌ，ｐＨ值自然［５］。　

（４）产酶培养基：即在基础培养基中添加不同浓度的营养物质。　

１．２菌种筛选、孢子悬液和酶液的制备　（１）菌种为本实验室筛选，经初步诱变改良。　

（２）孢子悬液的制备：从新长成的斜面洗下孢子，用磁力搅拌器搅拌约２０　ｒａｉｎ，打散孢子后通　

过血球记数板在显微镜下记数，并调节孢子浓度至（１．Ｏ０±０．０５）×１０　个／ｍｌ。　

（３）粗酶液制备：将孢子悬液以１Ｏ％接种量接入装有５Ｏ　ｍｌ产酶培养基的２５０　ｍｌ摇瓶中，转　

速２００　ｒ・ｒａｉｎ＿。，３０￣３１＿Ｃ发酵培养，发酵一定时间后取适量发酵液，４　０００　ｒ・ｒａｉｎ－１离心１５　ｒａｉｎ，　

以缓冲液适当稀释上清液就是酶液。　

１．３试验处理与发酵条件优化　（１）通过两因素（ｐＨ值和温度ｔ／℃）五水平正交试验，探讨黑曲酶７１０７１２纤维素酶系各组分　

最适作用条件。　（２）分析不同缓冲系统和添加ＣａＣ１　及吐温一８Ｏ对产酶的影响。　

（３）不同碳源对纤维素酶系最高酶活及其形成时间、比酶活和分泌变化规律的不同影响效应。　

以上试验重复数均为３。　１．４总还原糖测定：见参考文献Ｉ－６－］，ＤＮＳ法，以葡萄糖为标准。　

１．５蛋白质测定：参考文献［７３，Ｂｒａｄｆｏｒｄ法，以牛血清白蛋白为标准。　

１．６酶活测定与比酶活的计算　Ｃ　酶、Ｃｘ酶和ＢＧ酶活的测定依据文献Ｉ－６－］进行，比酶活的计算依据文献Ｅ８－１进行。以上涉及的　

定糖分析均以相同稀释倍数的酶液作为空白对照。　

１．７数据分析：方差分析法和ｑ检验法ｐ］。

　维普资讯 http://www.cqvip.com 第４期　吴石金，等：黑曲霉液体发酵产纤维素酶酶系均衡性研究　

２结果与分析　

２．１　以基础培养基添加纤维素粉和麦麸各１．５　作为产酶培养基，通过两因素（ｐＨ值和温度　ｔ／￣ｃ）五水平正交试验进行分析，得出９组理想的最大酶活组合（表１）。　

表１　黑曲霉７１０７１２纤维素酶系各组分最大酶活条件组合　

从表１结果可见，Ｃ　霉最大酶活组合为ｐＨ４．５～５．５和４５℃，最适温度范围较窄。Ｃｘ酶最适　

作用条件组合为ｐＨ３．５～４．５和６０～６５℃。ｐＧ酶最适作用条件组合为ｐＨ４．０￣ｐＨ５．０和６０～６５　

℃。酶系各组分最高酶活悬殊比较大，这亦是单一真菌产纤维素酶系各组分不均一的明证。　２．２以基础培养基添加纤维素粉和麦麸各１．５％作为产酶培养基，探讨不同缓冲系统和添加Ｃａ—　

Ｃｌ。及吐温一８０对纤维素酶系分泌特性的影响，结果如下表：　

表２不同缓冲系统和其它因素对黑曲霉７１０７１２纤维素酶系分泌特性的影响　

臁水平质　数…　ＳＡ酶２　Ｔ。　一ｃ　Ｔ　一　Ｔ　Ａ　１４．６　６．７　６　１１０．９　１７８．８　６　１６５．５　２４５．６　１Ｏ　Ｂ　１７．０　１６．７　６　１１４．７　１９６．５　５　１８２．５　２６７．５　１０　Ｃ　０　０　０　０　０　０　０　０　０　Ｄ　１Ｏ．４　７．９　６　１１Ｏ．５　２０２．１　６　１４６．７　２８　９．７　１Ｏ　ＣａＣＩ２　０．３　１５．７　４３．７　６　１１７．９　１９８．９　５　１８９．８　２１４．５　９　吐温一８０　０．３　１０．８　４３．６　６　１３５．９　２２３．４　５　２１４．６　３０５．８　９　

注：１）最大酶活（Ｕ／ｍ１）；２）比酶活（Ｕ／ｍｇ・ｐｒｏｔ）；３）最大酶活形成时间（ｄ）；４）为０．０１Ｍ柠檬酸缓冲液；５）为０．　１Ｍ柠檬酸一磷酸氢二钠缓冲液；６）为０．１Ｍ　ＮａＡｃ—ＨＡＣ缓冲液；７）为０．０１Ｍ　ＮａＡｃ—ＨＡＣ缓冲液；其它用０．１Ｍ　柠檬酸一磷酸氢二钠缓冲液。　由上述结果发现，用０．１Ｍ柠檬酸一磷酸氢二钠缓冲液效果比其它都要好，而高浓度ＮａＡｃ—　

ＨＡＣ缓冲液会严重影响产酶。添加ＣａＣ１。可提高Ｃｘ酶和ｐＧ酶的最大酶活，缩短最大酶活形成时　

间，但对Ｃ　酶影响不大。添加吐温一８０可明显提高酶系各组分的比酶活，缩短最大酶活形成时间，　

大大提高了　酶的最大酶活，而Ｃ　酶的最大酶活却有明显的降低。说明，添加ＣａＣ１。和吐温～８Ｏ　

整体上有助于酶分泌的改善。缓冲系统的选择固然重要，亦要综合对酶系均衡性和其它因素的影　响。　

２．３碳源对黑曲霉７１０７１２纤维素酶系各组分酶特性及均衡性的影响　使用单一及混合碳源（以纤维素粉和麦麸）分析其对酶系各组分最大酶活、比酶活及其形成时　间的影响。结果见表３。　从表３我们发现，以纤维素粉为唯一碳源时，随浓度增加各组分最高酶活形成时间基本不变，　

最大酶活显著（Ｐ＜Ｏ．０５）提高，比酶活差异不显著（Ｐ＞０．０５）。以麦麸为单一碳源时，随浓度增加　各组分最大酶活形成时间均不变，最大酶活在０．２　、０．３　水平之间差异不显著（Ｐ＞０．０５），但　

０．２　９／５、０．３　９／５水平与０．１％水平之间差异极显著（Ｐ＜０．０１），比酶活各水平间均差异极显著（Ｐ＜　０．０１）。使用混合碳源时，Ａ、Ｂ两因素之间各组分酶的最大酶活和比酶活均存在极显著（Ｐ＜０．０１）　

互作效应，且两因素对Ｃ　酶和ｐＧ酶的酶活和比酶活及Ｃｘ酶比酶活的影响为Ａ＞Ｂ，对Ｃｘ酶酶活　

的影响为Ｂ＞Ａ；Ａ因素各水平对各组分最大酶活和比酶活的影响除　酶外均为Ａ　＞Ａ。

＞Ａ。，差　维普资讯 http://www.cqvip.com