微生物室实验操作方法

1 DNA 甲基化重亚硫酸氢盐修饰法（DNA

METHYLATION BISULFITE MODIFICATION）

实验操作原理及方法

一、实验目的：

通过本实验，可以检测特定DNA序列的甲基化状态。

二、实验原理：

DNA 甲基化是指由S-腺苷甲硫氨酸（SAM）提供甲基基团，在DNA 甲基转移酶（DNA

methyltransferases，DNMTs）的作用下，将CpG 二核苷酸的胞嘧啶（C）甲基化为5-甲基化胞嘧啶（5-mC）的一种化学反应。DNA 甲基化是调节基因转录表达的一种重要的表观遗传的修饰方式。

DNA 甲基化主要在转录水平抑制基因的表达。DNA 甲基化引起基因转录抑制的机制可能主要有以下3 种：（1）DNA甲基化直接干扰特异性转录因子与各基因启动子中识别位置的结合。（2）序列特异性的甲基化DNA 结合蛋白与启动子区甲基化CpG 岛结合，募集一些蛋白，形成转录抑制复合物，阻止转录因子与启动子区靶序列的结合，从而影响基因的转录。（3）DNA 甲基化通过改变染色质结构，抑制基因表达。

重亚硫酸氢盐修饰法检测DNA甲基化的基本原理是基于DNA变性后用重亚硫酸氢盐处理，可将未甲基化胞嘧啶修饰成尿嘧啶。此反应的步骤是：1、在C-6位点磺化胞嘧啶残基；2、在C-4处水解去氨基来产生尿嘧啶磺酸盐；3、在碱性条件下去硫酸化。在这个过程中，5-甲基胞嘧啶由于甲基化基团干扰了重亚硫酸氢盐进入到C-6位点而保持着未反应的状态。在重亚硫酸氢盐处理后，使用针对每个修饰后DNA链的引物进行PCR反应。在这个PCR产物中，每5-甲基胞嘧啶显示为胞嘧啶，而由未甲基化胞嘧啶转变成的尿嘧啶则在扩增过程中被胸腺嘧啶所取代。

BSP(bisulfate sequencing PCR) ：重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，进行PCR扩增。最后，对PCR产物进行测序，并且与未经处理的序列比较，判断是否CpG位点发生甲基化。

1 从实验误差分析谈实验操作方法

普通高中物理实验内容标准中指出：能根据实验要求合理选择并安装实验器材，正确进行实验操作，能排除实验中的一般故障。现就高中力学实验误差分析谈操作方法。

一、长度的测量

1、误差分析：

用刻度尺测量物体长度的误差：

①对小于1mm的部分长度估读不准确；

②刻度线未与被测长度平行；

③刻度尺的起点（可以不是“0”刻度线）与被测长度的起点未对齐；

④视线未与刻度尺垂直等。

2、操作方法：

（1）用刻度尺测量

①测量时米尺的刻度线要紧贴待测物体，以减小视差；

②使用前注意观察刻度尺的量程和最小刻度值；

③测量起点不一定选在“0”刻度线，应使操作尽量简便；

④读数时视线要与尺面垂直；测量精度要求较高时，要进行重复测量，然后取平均值；

⑤毫米以下的数值靠目测估读一位，估计值至少是最小刻度的1/10。

（2）使用游标卡尺测量

①在看游标尺上的哪条刻线与主尺上的某条刻线重合时，要选一条重合得最好的来读数；

②在看是游标尺上第几条刻条与主尺刻线重合时，不包括游标尺的零刻度在内；

③在读数前，先拧紧紧固螺钉，以免游标尺移动影响读数；

④精确度为0.1mm，0.05mm和0.02mm的游标卡尺的读数，以mm为单位时，读数保留到小数点后第1位、第2位和第3位。

二、验证力的平行四边形定则

1、误差分析

①用描点法记录的拉力方向不够准确；

②所作平行四边形的对边不严格平行；

③拉橡皮条时，没有做到橡皮条及两细绳套平行于方木板，使在纸上所描下的拉力方向并不是拉力的真实方向；④没有校准弹簧秤的零点，两只弹簧秤的刻度不准确；⑤弹簧的拉杆与限位孔有磨擦，使弹簧读数并不能真正表示细绳中拉力的大小。

2、操作方法

①不要直接以橡皮条端点为结点，可拴一短细绳再连两细绳套，以三绳交点为结点，使结点小些，便于准确地记录结点O的位置。

②不要用老化的橡皮条，检查方法是用一个弹簧秤拉橡皮条，要反复做几次使橡皮条拉伸到相同的长度看弹簧秤读数有无变化。

Southern Blot原理及实验方法

Southern Blot原理及实验方法原理：

将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将

其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它

标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过

碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示

出待检的片段及其相对大小。

用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。

试剂和器材

一、试剂

变性液：1.5mol/L NaCl，0.5mol/L NaOH。

中和液：0.5mol/L Tris-HCl (pH=7.5)，1.5mol/L NaCl。

20×SSC：3mol/L NaCl，0.3mol/L 柠檬酸钠。

以上溶液均在100Kpa灭菌20分钟。

2×SSC：用无菌移液管吸取20×SSC溶液5mL，加无菌水45mL。

6×SSC：用无菌移液管吸取20×SSC溶液15mL，加无菌水75mL。

二、器材

22cm×15cm瓷盘

操作方法

1. 在琼脂糖凝胶上电泳分离DNA。取出凝胶，切去边缘多于部分，EB染色，在紫外灯下照

相（放一标尺，可从像片中读出DNA迁移的距离）。

2. 将凝胶置于200mL变性液中，浸泡45分钟，并温和地不断振荡，使凝胶上的ds-DNA转

变为ss-DNA，然后用重蒸水冲洗凝胶几次。

3. 用中和液浸泡凝胶并不断地振荡45分钟，将凝胶中和至中性。防止凝胶的碱性破坏硝酸

纤维膜。

4. 取一个瓷盘，在底部放一块玻璃板（或一块海绵）使盛器内的20倍SSC转移滤液低于玻

板表面，在玻板表面盖一张3mm的二号滤纸，滤纸两边浸没于20倍SSC溶液中，在玻璃和

滤纸之间，赶掉所有的气泡。

5. 把凝胶底面朝上放在滤纸上，赶走两层之间出现的气泡。

酸碱中和滴定实验报告

班级 姓名 学号 合作者 日期

一、实验目的：用已知浓度溶液（标准溶液）【本实验NaOH为标准溶液】测定未知溶液（待测溶液） 浓度【本实验盐酸为待测溶液】

二、实验用品：

1.所用仪器：酸式滴定管、碱式滴定管、锥形瓶、滴管、烧杯

2.所用试剂：0.1000mol/LNaOH溶液、待测盐酸、酚酞

三、实验原理：c（标）×V（标） = c（待）×V（待）【假设反应计量数之比为1：1】

【本实验具体为：c（H+）×V（酸） = c（OH-）×V（碱）】

四、实验操作：

（1）查：检查是否漏水和堵塞。

（2）洗：洗净后用指定的酸和碱液润洗。（锥形瓶只用蒸馏水洗净即可）

（3）盛、调：用烧杯沿漏斗注入滴定管中，放出液体，赶气泡、调起点。

（4）取：左手控制酸式滴定管的活塞，将一定体积未知浓度的酸溶液放入锥形瓶中，滴入几滴酚酞。

（5）滴定：操作要点及滴定终点的观察。

左手挤压碱式滴定管玻璃小球，右手摇动锥形瓶，眼睛注视锥形瓶内溶液颜色的变化。（指示剂变色，半分钟内不褪色）

（6）记和算：数据记录和处理，求出酸的浓度

C（盐酸）=

五.常见误差分析：［根据：c（H+）×V（酸） = c［（OH-）×V（碱）分析］

操作及读数 误差原因 导致

未用标准液洗涤滴定管

未用待测液洗涤移液管或所用的滴定管

用待测液洗涤锥形瓶 滴定次数 待测酸溶液体积/mL 标准碱溶液的体积

滴定前读数 滴定后读数 实用体积

第一次

第二次

第三次 洗涤后的锥形瓶未干燥

标准液漏滴在锥形瓶外1滴

待测液溅出锥形瓶外1滴

移液管悬空给锥形瓶放待测液

移液管下端的残留液吹入锥形瓶内

滴定前仰视滴定管读数，滴后平视

滴前平视，滴后仰视