微生物检查操作方法

11 微生物检查中无菌操作注意事项

一、关于采用酒精棉球消毒的注意事项

1.用酒精棉球擦拭双手，包括手掌、手背，尤其是手指，更换一个酒精棉球擦拭酒精灯附近（约10cm）桌面。

2.点燃酒精灯，在酒精灯附近拆器皿包装，并对器皿做相应标记。

3.用酒精棉球再次擦拭双手，开始实验操作。

4.消毒用酒精棉球湿度以不挤压出酒精为宜。

二、关于酒精灯正确使用的注意事项

1.酒精量以大于1/3，小于2/3为正确量。

2.防风罩应小口朝上放置于酒精灯上，反过来放置会导致氧气没有充分燃烧。

3.使用酒精灯前要检查灯芯帽是否盖得太紧，以防酒精不能上升，影响酒精灯燃烧。点燃酒精灯时严禁两个酒精灯对点。

4.熄灭酒精灯方法：先用灯芯帽扣压并熄灭火焰，再揭帽重新扣压一次。这样可防止蒸汽倒吸灯帽，再次使用酒精灯时难以揭开灯帽。

5.做样品稀释及从试管取样实验时，酒精灯应放在操作人员和试管架之间，便于无菌操作。

三、关于吸量管使用的注意事项

1.左手拿洗耳球，右手持吸量管，用右手食指平按住吸量管的顶部。

2.吸取样品后进行定量时，吸量管吸液口应贴附于试管内壁；放样时，吸量管吸液口也应贴附于试管约1/2内壁，不应贴附在管口处放液。吸量管应尽可能垂直放液。

3.用吸量管往空平皿加入1ml溶液时，吸量管应贴附于平皿底部中央位置放液；用吸量管在平板上加入溶液做涂布接种时，吸量管应垂直、悬空放液于平板中央。

4.因吸量管拆封包装后应马上使用，故无须对吸量管吸液口过火焰消毒。

5.整个取样放样的过程应尽可能保证试管口或锥瓶口靠近酒精灯火焰附近。

22 四、关于样品梯度稀释的注意事项

1.从试管架上取出所需试管于酒精灯火焰附近拔出试管塞，并在火焰外焰处对试管口过火焰进行消毒。

2.将试管放回试管架后用吸量管进行取样，然后取出该试管于火焰附近调节吸量管内溶液体积。

3.取样完成后对试管口再次消毒并塞上试管塞，将试管放回试管架原处。

4.从试管架上取出所需加样的试管于火焰附近进行加样放液操作。

第 1 页 共 11 页 制药GMP管理文件

题 目 微生物限度检查操作规程

制 定 审 核 批 准

制定日期 审核日期 批准日期

颁发部门 GMP办 颁发数量 2 生效日期

分发部门 质量管理部、综合办公室

一、 引用标准：中华人民共和国S药典（2005年版）一部。

二、 目 的：本标准规定了微生物限度检查法标准操作规程。

三、 适用范围：适用于微生物限度的检查。

四、 责 任 者：质检人员。

正 文：

1、简述 微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。

微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。单向流空气区域、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。

供试品检查时，如果使用了表面活性、中和剂或灭活剂，应证明其有效性及对微生物的生长和存活无影响。

除另有规定外，本检查法中细菌培养温度为30～35℃；霉菌、酵

第 2 页 共 11 页 母菌培养温度为23～28℃；控制菌培养温度为35～37℃。

检验结果以1g、1ml、10g、10ml或10㎝2为单位报告。

检验量： 检验量即一次试验所用的供试品量（g、ml、㎝2）。除另有规定外，一般供试品的检验量为10g或10ml；贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。要求检查沙门氏菌的供试品，其检验量应增加10g或10ml。

检验时，应从2个以上最小包装单位中抽取供试品。一般应随机抽取不少于检验用量（两个以上最小包装单位）的3倍量供试品。

2、供试液的制备

根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。供试液制备若需用水浴加温时，温度不应超过45℃供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。

1 微生物检查中无菌操作注意事项

一、关于采用酒精棉球消毒的注意事项

1.用酒精棉球擦拭双手，包括手掌、手背，尤其是手指，更换一个酒精棉球擦拭酒精灯附近（约10cm）桌面。

2.点燃酒精灯，在酒精灯附近拆器皿包装，并对器皿做相应标记。

3.用酒精棉球再次擦拭双手，开始实验操作。

4.消毒用酒精棉球湿度以不挤压出酒精为宜。

二、关于酒精灯正确使用的注意事项

1.酒精量以大于1/3，小于2/3为正确量。

2.防风罩应小口朝上放置于酒精灯上，反过来放置会导致氧气没有充分燃烧。

3.使用酒精灯前要检查灯芯帽是否盖得太紧，以防酒精不能上升，影响酒精灯燃烧。点燃酒精灯时严禁两个酒精灯对点。

4.熄灭酒精灯方法：先用灯芯帽扣压并熄灭火焰，再揭帽重新扣压一次。这样可防止蒸汽倒吸灯帽，再次使用酒精灯时难以揭开灯帽。

5.做样品稀释及从试管取样实验时，酒精灯应放在操作人员和试管架之间，便于无菌操作。

三、关于吸量管使用的注意事项

1.左手拿洗耳球，右手持吸量管，用右手食指平按住吸量管的顶部。

2.吸取样品后进行定量时，吸量管吸液口应贴附于试管内壁；放样时，吸量管吸液口也应贴附于试管约1/2内壁，不应贴附在管口处放液。吸量管应尽可能垂直放液。

3.用吸量管往空平皿加入1ml溶液时，吸量管应贴附于平皿底部中央位置放液；用吸量管在平板上加入0.1ml溶液做涂布接种时，吸量管应垂直、悬空放液于平板中央。

4.因吸量管拆封包装后应马上使用，故无须对吸量管吸液口过火焰消毒。

5.整个取样放样的过程应尽可能保证试管口或锥瓶口靠近酒精灯火焰附近。

四、关于样品梯度稀释的注意事项

1.从试管架上取出所需试管于酒精灯火焰附近拔出试管塞，并在火焰外焰处对试管口过火焰进行消毒。

2.将试管放回试管架后用吸量管进行取样，然后取出该试管于火焰附近调节吸量管内溶液体积。

3.取样完成后对试管口再次消毒并塞上试管塞，将试管放回试管架原处。

4.从试管架上取出所需加样的试管于火焰附近进行加样放液操作。

微生物限度检查方法验证方案

六、验证内容

1.供试液的制备

1.1.取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液至100ml，充分振摇使混匀，作为1:10的供试液。

1.2.取1:10供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液至100ml，充分振摇使混匀，作为1:100的供试液。

1.3.取1:100供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液至100ml，充分振摇使混匀，作为1:1000的供试液。

备注：供试液制备若需加温时，应均匀加热，且温度不超过45℃。供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。

2.菌液制备

2.1.接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养 物至胰酪大豆胨液体培养基中，30〜35℃培养18～24小时；分别取上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，依次稀释至、、、制成每1ml含菌数为小于100cfu的菌悬液。

2.2.接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中，20〜25℃培养2～3 天；取此培养物用0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，依次稀释至，制成每1ml含菌数为小于100cfu的菌悬液。

2.3.将黑曲霉菌斜面的新鲜培养物接种至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，20〜25℃培养5〜7天，使大量的孢子成熟。加入3-5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，将孢子洗脱。然后，采用适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液依次稀释至，制成每 1ml 含孢子数小于100cfu 的孢子悬液。

2.4.上述菌悬液制备后若在室温下放置，应在2小时之内使用；若保存在2~8℃，可在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在2~8℃，在验证过的贮存有效期内使用。