分子克隆技术操作手册

分子克隆步骤：一、贴壁细胞总RNA 提取：1、吸掉培养液，用PBS 洗一遍 ?2、往培养皿中加入1ml,TRIzol, 吹打几次3、移至 1.5mlEP 管，静置 5 分钟(每 10cm2面积 ,即3.5cm直径的培养板加1ml)4、加入5、4 度6、加入7、4 度200ul 三氯甲烷，震荡混匀，室温静置12000r/min ，离心 15 分钟，取上清，约500ul 异丙醇，混匀后，静置30 分钟？12000r/min ，离心 15 分钟，弃上清5 分钟600ul8、加入 1ml70% 预冷酒精洗涤沉淀物9、 4 度 7500r/min ，离心 5 分钟10、弃上清，自然晾干11、加入 50ulDEPC 水溶解，测OD值＊鼠尾基因组DNA粗提取：1、 100ul lysis buffer for each tail,and 2ul 10mg/ml PK,55℃ ,overnight.2、 Then,100 ℃ for 10min to denature the PK, use 0.5~1ul lysate as template to do PCR.Lysis buffer:(store at 4KCl 0.5M Tris0.1M NP-40 1%Tween-20 1%℃)二、 RT-PCR：1、预变性体系12ul ：Total RNAOligo （ dT18） primer DH water 2ul 1ul 9ul65℃5min速置冰上2、 RT 体系： 20ul ：预变性体系5×buffer RNAase inhibiter 10m dNTP MMLV 12ul 4ul 1ul 2ul 1ul42 ℃60min 70 ℃5min 12 ℃forever3、 PCR体系20ul ：10×buffer2ul10m dNTP0.5ulPrimer(F+R)1ul（ 0.5ul+0.5ul）稀释后cDNA （ 50ul ）1ulPfu0.2uldd water15.3ul95 ℃ 3min 、（ 95℃ 30s ， 55 ℃30s ， 72℃ 35s ）×29cycle 、72 ℃ 10min 、 12 ℃ forever三、跑胶鉴定PCR 产物：四、醇沉PCR 产物：1、将 PCR 产物转移至 1.5mlEP 管中2、加入 0.1 倍体积预冷NaAC ， 3 倍体积 70%预冷乙醇，混匀3、— 80℃静置30min4、4 度5、4 度6、加入14000r/min ， 10min 离心弃上清，加1ml70%14000r/min ， 10min 离心弃上清，自然晾干25-20ul dd water吹匀静置10-20min待溶解预冷乙醇洗涤沉淀五、原始质粒 /PCR 醇沉产物双酶切体系50ul：Enzyme11ulEnzyme21ul10×Buffer5ul（在体系中被稀释成 1×）10×BSA5ul（看需要）Template1ugADD dd water to50ul酶切过夜？六、单独鉴定质粒酶切产物：1、采用 20ul 体系：酶各0.5ul、 buffer2ul 、 bsa0.5ul、 template2ul）酶切 2h2、跑胶鉴定七、电泳，切胶回收与纯化：使用 DNA 回收试剂盒（QIAquick Gel Extraction Kit Protocol）PCR 酶切产物纯化：1.将 PCR 产物于需要的电压和电流下跑电泳2.紫外灯下仔细切下含待回收DNA 的凝胶，置 1.5ml 离心管中，称重。

分子克隆技术操作手册摘要：一、分子克隆技术简介1.分子克隆技术的定义2.分子克隆技术的发展历程二、分子克隆技术的原理1.基本原理2.克隆过程详解三、分子克隆技术的应用1.基因工程2.生物制药3.基因诊断4.转基因技术四、分子克隆技术的操作步骤1.设计引物2.PCR扩增3.酶切鉴定4.连接转化5.筛选重组子6.鉴定克隆子五、分子克隆技术的注意事项1.实验操作规范2.试剂选择与储存3.防止污染4.优化实验条件六、分子克隆技术的发展趋势1.高效自动化设备2.单细胞克隆技术3.基因编辑技术4.个性化医疗正文：一、分子克隆技术简介分子克隆技术是一种生物技术方法，主要用于复制特定DNA序列。

该技术在我国科研领域得到了广泛的应用，为基因研究、生物制药、转基因技术等领域提供了重要的技术支持。

自20世纪70年代以来，分子克隆技术不断发展，为生命科学研究带来了革命性的变革。

二、分子克隆技术的原理分子克隆技术的基本原理是将目标DNA片段通过PCR扩增，然后利用限制性内切酶切割得到特定片段，将这些片段连接到载体DNA上，最后将连接产物转化到受体细胞中。

在转化过程中，载体DNA与受体细胞的染色体DNA 结合，实现目标基因的复制和表达。

克隆过程详解：首先，设计一对特异性引物，使目标DNA片段在PCR扩增过程中产生特定的扩增子。

接下来，通过PCR扩增得到目的基因。

然后，利用限制性内切酶对扩增产物进行酶切，得到具有粘性末端的目的基因片段。

将目的基因片段与载体DNA连接，形成重组载体。

最后，将重组载体转化到受体细胞中，实现基因的克隆。

三、分子克隆技术的应用1.基因工程：分子克隆技术为基因工程提供了重要的技术支持，使得科学家可以对基因进行改造、编辑，进而创造新的生物品种和药物。

2.生物制药：分子克隆技术在生物制药领域具有广泛应用，如制备抗体、细胞因子、酶等生物制品。

3.基因诊断：通过分子克隆技术，可以快速、准确地检测特定基因序列，为遗传病诊断提供依据。

分子克隆技术操作手册
摘要：
一、废品损失的定义及种类
二、废品损失的会计分录
1.不可修复废品损失的会计分录
2.可修复废品损失的会计分录
3.回收废品残料价值以及应向责任人索赔款项的会计分录
4.结转废品净损失的会计分录
三、废品损失的会计核算
正文：
废品损失是指在生产过程中发生的、入库后发现的不可修复废品的报废损失和可修复废品的修复费用。

废品损失的会计分录对于生产型企业会计人员而
言，经常会处理废品损失的业务。

核算废品损失时，一般设置废品损失”科目进行处理。

废品损失的会计分录主要包括：
1.不可修复废品损失的会计分录：
借：废品损失——不可修复废品损失
贷：生产成本——基本生产成本
2.可修复废品损失的会计分录：
借：废品损失
贷：原材料、制造费用等
3.回收废品残料价值以及应向责任人索赔款项的会计分录：
借：原材料
其他应收款
贷：废品损失——不可修复废品损失
4.结转废品净损失的会计分录：
借：生产成本——基本生产成本
贷：废品损失——不可修复废品损失
废品损失属于损益类科目，其会计核算对于企业准确计算成本、评估生产效率等方面具有重要意义。

分子克隆技术的使用方法分子克隆技术是在分子生物学领域中最常用的一种实验方法，它可以帮助研究人员复制并分离出特定的DNA序列，用于进一步研究和应用。

分子克隆技术的使用方法主要包括DNA提取、限制性内切酶切割、连接反应、转化和筛选等步骤。

下面将对这些步骤逐一进行介绍。

首先，DNA提取是分子克隆技术的第一步，它的目的是从样品（例如细菌、植物或动物组织）中提取出目标DNA。

提取方法主要有酚/氯仿法、盐法和商用DNA提取试剂盒等。

在提取过程中，我们需要将样品细胞破裂，并通过使用蛋白酶分解蛋白质，最后通过乙酸盐、异丙醇等溶剂沉淀目标DNA。

其次，限制性内切酶是分子克隆技术中的关键工具，它能够识别并切割DNA 的特定序列。

在实验中，我们选择与目标DNA序列相匹配的限制性内切酶，将其与目标DNA一起反应，酶可以精确切割DNA链，产生特定的末端序列。

这样的切割可以生成需要的DNA片段用于后续的连接反应。

连接反应是分子克隆技术的核心步骤，通过该步骤可以将目标DNA片段与载体DNA连接起来。

通常情况下，载体DNA是一种循环的DNA分子，如质粒或噬菌体。

在连接反应中，我们需要将目标DNA片段与已经经过限制性内切酶切割处理的载体DNA进行连接。

连接反应可以使用DNA连接酶和缓冲液，在适当的温度下进行反应。

连接反应的最终产物是重组载体，内含目标DNA的插入片段。

然后，转化是将重组载体导入到宿主细胞中的过程。

对于大多数分子克隆实验来说，大肠杆菌是最常见的宿主细胞。

在转化过程中，我们需要将重组载体与宿主细胞共同处理，使其能够进入细胞内。

转化方法主要有热激、电击和化学法等。

通过转化，重组载体可以复制并表达其携带的目标DNA片段。

最后，筛选是分子克隆技术中的关键步骤，它可以确定是否成功克隆了目标DNA片段。

筛选依赖于所克隆目标的特性和选择的标记方法。

常用的筛选方法包括酶切鉴定、PCR扩增、限制性酶切图谱分析以及DNA序列分析等。

这些方法可以帮助我们鉴定和验证克隆的目标DNA片段是否符合预期。

分子克隆技术实验操作手册《分子克隆技术》实验操作手册李香花吴昌银邢永忠华中农业大学生命科学技术学院课程简介分子克隆技术是指DNA的无性繁殖技术。

分子克隆技术课程主要是针对生物技术专业、生物科学专业、生命科学与技术基地班本科生及生物学类专业研究生而开设的实验课。

实验内容涉及分子克隆的一些基本方法及基本操作技巧，主要包括分子克隆、分子杂交和表达检测三部分分子克隆技术：DNA重组技术是分子生物学的核心内容。

本实验利用质粒载体克隆外源DNA片段，通过这个实验大家可以掌握质粒载体的抽提、外源DNA的准备、酶切、连接及感受态细胞的制备、连接产物的转化以及阳性克隆子的鉴定和验证等。

分子杂交技术：实验室常用的分子杂交技术主要有Southern blotting，Northern blotting，Western blotting及Dot blotting 等。

Southern blotting是通过用一种或多种限制性内切酶消化基因组或其它来源的DNA，经过琼脂糖凝胶电泳按大小分离酶切所得的片段，随后DNA在原位发生变性并从凝胶转移到一固相支持物上（硝酸纤维素膜或尼龙膜）。

DNA转移至固相支持物的过程中各DNA的相对位置保持不变，用一定方法(如放射性同位素或DIG)标记的DNA探针与固着在膜上的DNA 杂交，经显影或显色显现出与探针DNA互补的DNA电泳条带的位置，然后进行分析。

本实验要求掌握植物总DNA的抽提、质量检测、限制性内切酶操作、DNA的琼脂糖凝胶电泳、转膜、探针的制备、同位素操作等方面的实验技术。

系列一分子克隆技术实验一质粒的制备质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，它在基因操作中具有重要作用。

质粒的分离与提取是最常用、最基本的实验技术。

质粒的提取方法很多，大多包括3个主要步骤：细菌的培养、细菌的收集和裂解、质粒DNA的分离和纯化。

本实验以碱裂解法为例，介绍质粒的抽提过程。

实验目的：掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的作用。

分子克隆技术操作手册摘要：I.引言- 分子克隆技术简介- 分子克隆技术在生物学研究中的应用II.分子克隆技术的基本原理- 分子克隆技术的定义- 分子克隆技术的基本原理III.分子克隆技术的操作流程- 准备工作- 实验操作步骤- 结果分析IV.分子克隆技术的应用实例- 基因克隆- 基因组克隆- 蛋白质表达V.分子克隆技术的优缺点- 优点- 缺点VI.分子克隆技术的发展趋势- 技术的发展- 应用领域的扩展正文：I.引言分子克隆技术作为一项重要的生物技术手段，在生物学研究中扮演着不可或缺的角色。

通过分子克隆技术，研究者可以有效地获取目标基因或DNA片段，并进行后续的分析和研究。

分子克隆技术的应用领域广泛，包括但不限于基因工程、基因组学、蛋白质组学等。

II.分子克隆技术的基本原理分子克隆技术，又称分子杂交技术，是指将目标DNA片段与载体DNA结合，形成一个新的DNA分子的过程。

这一过程主要依赖于核酸酶的切割作用，将目标DNA片段与载体DNA切割出来，并通过连接酶将两者连接成一个新的DNA分子。

III.分子克隆技术的操作流程分子克隆技术的操作流程可以分为三个主要步骤：准备工作、实验操作步骤和结果分析。

1.准备工作在进行分子克隆技术之前，需要准备以下材料和工具：目标DNA片段、载体DNA、核酸酶、连接酶、引物、模板DNA、PCR仪、离心机等。

2.实验操作步骤(1) 使用核酸酶切割目标DNA片段和载体DNA，产生相同的粘性末端。

(2) 使用连接酶将切割后的目标DNA片段和载体DNA连接成一个新的DNA分子。

(3) 将连接好的DNA分子转化到宿主细胞中，进行扩增。

(4) 提取扩增后的DNA分子，进行检测和分析。

3.结果分析通过对扩增后的DNA分子进行电泳检测、PCR验证等方法，分析实验结果，确认是否成功克隆了目标DNA片段。

IV.分子克隆技术的应用实例1.基因克隆分子克隆技术可以用于获取目标基因的DNA片段，进行后续的基因功能研究和基因编辑操作。

分子克隆技术操作手册【最新版】目录1.分子克隆技术的概念2.分子克隆技术的操作步骤3.分子克隆技术的应用4.分子克隆技术的优缺点正文一、分子克隆技术的概念分子克隆技术是一种生物技术方法，用于在体外将各种来源的 DNA 片段进行拼接组合，形成新的 DNA 分子。

这种技术可以在短时间内大量复制特定 DNA 序列，为基因工程、生物制药等领域提供重要的研究手段。

二、分子克隆技术的操作步骤分子克隆技术主要包括以下几个操作步骤：1.提取 DNA：从实验材料中提取 DNA，并通过特定方法进行纯化。

2.切割 DNA：使用限制性内切酶将 DNA 切割成特定大小的片段。

3.链接 DNA：将切割好的 DNA 片段通过 DNA 连接酶进行拼接组合。

4.转化细胞：将拼接好的 DNA 分子转化到受体细胞中，让细胞表达新的 DNA 序列。

5.筛选克隆：通过特定筛选方法，选出含有目标 DNA 序列的克隆细胞。

三、分子克隆技术的应用分子克隆技术在生物领域有广泛的应用，主要包括：1.基因工程：通过分子克隆技术，可以对特定基因进行拼接组合，研究基因的功能和调控关系。

2.生物制药：利用分子克隆技术，可以大量生产具有特定功能的蛋白质，用于药物研发和生产。

3.基因诊断：通过分子克隆技术，可以制备特定基因片段作为诊断试剂，用于疾病的早期诊断。

4.基因治疗：将正常或功能性基因通过分子克隆技术导入患者细胞，以治疗遗传性疾病。

四、分子克隆技术的优缺点分子克隆技术的优点包括：操作简便、效率高、可大量制备特定 DNA 序列。

但其缺点是：可能产生非特异性拼接、克隆产物可能不稳定、需要使用有毒的化学试剂等。

总之，分子克隆技术是一种重要的生物技术手段，广泛应用于基因工程、生物制药等领域。

分子克隆技术操作手册摘要：一、分子克隆技术的概念与原理二、分子克隆技术的操作步骤1.提取目的基因2.构建基因表达载体3.将目的基因导入受体细胞4.目的基因的检测与表达三、分子克隆技术在科研和生产中的应用四、分子克隆技术的发展趋势正文：一、分子克隆技术的概念与原理分子克隆技术是指在体外将各种来源的遗传物质——DNA 片段，与适当的载体DNA 相结合，然后导入受体细胞，使这些DNA 片段在受体细胞内复制、表达的操作技术。

分子克隆技术的原理主要基于重组DNA 技术，通过切割、连接、导入等步骤，实现外源基因与载体DNA 的重组，从而形成一个新的基因表达载体，最终达到在受体细胞中表达目的基因的目的。

二、分子克隆技术的操作步骤1.提取目的基因提取目的基因是分子克隆技术的第一步，通常采用PCR 扩增或化学合成的方法获取目的基因。

PCR 扩增是一种常见的方法，通过设计特定的引物，从基因组DNA 中扩增出目的基因。

化学合成则是根据目的基因的序列，通过化学合成方法直接合成目的基因。

2.构建基因表达载体构建基因表达载体是分子克隆技术的核心步骤，主要包括以下几个方面：（1）选择合适的载体：常用的载体有大肠杆菌的质粒等，根据实验目的和受体细胞的类型选择合适的载体。

（2）切割载体：使用限制性内切酶切割载体，暴露出载体的粘性末端，便于与目的基因连接。

（3）连接目的基因：将提取到的目的基因与切割后的载体DNA 片段通过DNA 连接酶连接，形成重组载体。

（4）转化受体细胞：将重组载体导入受体细胞，使目的基因在受体细胞内表达。

3.将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞是分子克隆技术的关键步骤，根据受体细胞的类型选择不同的导入方法。

常用的方法有转化、转染、显微注射等。

4.目的基因的检测与表达在将目的基因导入受体细胞后，需要对目的基因进行检测和表达。

检测方法包括PCR、Western blot、南方杂交等，表达方法包括实时荧光定量PCR、Western blot、酶联免疫吸附试验等。

分子克隆操作方法
分子克隆是一项常用的生物技术，用于将特定DNA 片段定向克隆到载体DNA 上，生成包含目的基因的重组DNA 分子。

以下是分子克隆的常用方法：
1. 限制酶切剪接：利用限制酶切剪配对的方式，将目的DNA 片段和载体DNA 上的相应区域进行切割，得到两个切口，然后将两个断裂的DNA 片段连接起来，形成含有目标DNA 片段的重组DNA 分子。

2. PCR 扩增：利用PCR 技术对目的DNA 片段进行扩增，并将其与载体DNA 进行连接，形成重组DNA 分子。

3. TA 克隆：TA 克隆是一种优化的克隆方法，使用缺十二碳酸二酯酶的Taq DNA 聚合酶进行PCR 扩增，将目的DNA 片段amplified 插入含有单一胞嘧啶（T）的TA 克隆载体上，然后将TA 克隆载体转化到大肠杆菌中进行筛选。

4. 原位杂交：将互补的DNA 探针标记并与目的细胞DNA 结合，发现目的DNA 片段的位置，然后将其在载体上克隆。

5. 基因文库筛选：将目的DNA 片段插入到原核或真核生物基因文库中，然后筛选出含有目的DNA 片段的重组DNA 分子。

6. 自主克隆：将目的DNA 片段插入到自主复制的质粒上，使其复制并表达出
目的蛋白质。

需要根据具体实验目的，选择适合的方法进行分子克隆，为后续的分子生物学研究提供可靠的材料基础。

基因工程分子克隆实验操作流程英文回答：Molecular Cloning Experiments Using Gene Engineering: A Comprehensive Protocol.Introduction:Molecular cloning is a fundamental technique in biotechnology that involves the isolation, manipulation, and amplification of specific DNA sequences. It plays a pivotal role in various research areas, such as gene function studies, protein production, and genetic engineering. This protocol outlines the detailed steps involved in a typical molecular cloning experiment using gene engineering techniques.Materials:Gene of interest (target DNA)。

Cloning vector (plasmid or viral vector)。

Restriction enzymes.DNA ligase.Competent cells (e.g., E. coli)。

Antibiotics.Culture media.Molecular biology reagents and equipment.Methods:1. Gene Isolation:Extract DNA from the source organism using appropriate methods.Amplify or synthesize the target gene using PCR or other techniques.2. Vector Preparation:Digest the cloning vector with appropriate restriction enzymes to create compatible ends.Dephosphorylate the vector to prevent self-ligation.3. Gene Insertion:Combine the digested gene and vector.Ligate the DNA fragments using DNA ligase.4. Transformation:Introduce the recombinant plasmid into competent cells (e.g., E. coli) by transformation.Plate the transformed cells on selective mediacontaining antibiotics.5. Colony Screening:Identify colonies that have successfully taken up the recombinant plasmid.Screen colonies for the presence of the target gene using PCR, restriction digestion, or other methods.6. Plasmid Isolation:Culture the positive clones and isolate the recombinant plasmid using plasmid extraction methods.7. Sequence Verification:Perform DNA sequencing to confirm the accuracy of the cloned gene.8. Gene Expression:If necessary, subclone the gene into an expression vector for protein production.Optimize expression conditions and purify the target protein.Applications:Molecular cloning has numerous applications in research and biotechnology, including:Gene cloning and sequencing.Protein production and characterization.Gene therapy.Genetic engineering of organisms.Development of diagnostic tools and therapeutics.Conclusion:Molecular cloning using gene engineering is a powerful technique that enables researchers to manipulate and study DNA at the molecular level. By following the outlined protocol, scientists can successfully design, execute, and analyze cloning experiments for various research and biotechnology applications.中文回答：利用基因工程进行分子克隆实验操作流程。