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分子克隆实验设计一、总体实验流程二、实验内容(一)PCR（聚合酶链式反应）1.原理：利用DNA在体外摄氏95度时解旋，45-60度时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至72度左右，DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。
2.PCR操作：反应体系：Template 1ulPrimer1 1ulPrimer2 1ul2*Taq master MIX 25ulH2O 22ulTotal 50ul反应条件：94℃5min94℃30s58℃30s 40 cycles72℃40s72℃5min(二)琼脂糖凝胶电泳1.原理：琼脂糖凝胶具有网络结构，分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小。
2.凝胶电泳步骤：1)称取0.5g琼脂糖至50ml 电泳缓冲液（TAE）中，摇匀；同时装置制胶架。
2)加热至琼脂糖完全融化，期间停止加热摇动3次，即无可见漂浮物，澄清为止。
3)加入1ulEB染液，充分摇匀。
4)缓慢倒入制胶架内，冷却30-60min，至凝胶充分凝固，放入电泳槽中即可使用。
5)使用时，将样品点入相应的加样孔内，即可开始电泳，待指示剂位于整块凝胶2/3位置时，停止电泳，在紫外灯下观察样品条带。
(三)切胶回收（天根生化公司凝胶回收试剂盒）1. 将空小离心管称重。
将回收的带DNA 片段的凝胶放入其中、再次称重，确定凝胶净重。
2. 将离心管中的凝胶捣碎以助于凝胶溶解。
按胶的重量加入三倍体积的Extraction buffer （1mg凝胶加3μl Extraction buffer ）。
3. 55℃恒温加热直到凝胶完全融化（5-15 分钟）,每隔2-3分钟需将管内混悬液混匀一次。
4. 按照1：1比例加入异丙醇（1mg凝胶加1μl异丙醇），混匀。
5. 将混合液全部移入Spin column、6000rpm离心1分钟，弃去接液管中的液体。
分子克隆技术操作手册（原创版）目录一、分子克隆技术的概念与意义二、分子克隆技术的基本原理三、分子克隆技术的操作步骤四、分子克隆技术在实践中的应用五、分子克隆技术的发展前景与挑战正文一、分子克隆技术的概念与意义分子克隆技术，又称为分子复制技术，是指在体外将特定 DNA 片段与载体 DNA 结合，然后通过转化等方式将重组 DNA 引入受体细胞，从而使得目的基因在受体细胞中得以表达和扩增的一种技术。
分子克隆技术的出现，为生物学、医学和基因工程等领域的研究提供了强大的支持，使得科学家们可以更加方便地研究和操控基因。
二、分子克隆技术的基本原理分子克隆技术的基本原理主要包括以下几个步骤：1.获取目的基因：从供体细胞中提取出需要研究的目的基因。
2.构建载体：将目的基因与载体 DNA 结合，构建成一个完整的克隆载体。
3.转化受体细胞：将构建好的克隆载体引入受体细胞中，使得目的基因在受体细胞中得以表达和扩增。
4.筛选克隆子：通过特定的筛选方法，从众多受体细胞中筛选出真正含有目的基因的克隆子。
5.提取和纯化目的基因：从筛选出的克隆子中提取和纯化目的基因，以供后续研究使用。
三、分子克隆技术的操作步骤分子克隆技术的操作步骤主要包括以下几个方面：1.提取目的基因：通过 PCR、限制性内切酶等方法从供体细胞中提取出目的基因。
2.构建载体：将目的基因与载体 DNA 结合，构建成一个完整的克隆载体。
这一步通常需要使用限制性内切酶和 DNA 连接酶等工具。
3.转化受体细胞：将构建好的克隆载体引入受体细胞中。
转化方法有很多种，如化学法、电穿孔法、热激法等。
4.筛选克隆子：通过特定的筛选方法，如抗生素筛选、荧光筛选等，从众多受体细胞中筛选出真正含有目的基因的克隆子。
5.提取和纯化目的基因：从筛选出的克隆子中提取和纯化目的基因，通常需要使用限制性内切酶和 DNA 连接酶等工具。
四、分子克隆技术在实践中的应用分子克隆技术在实践中的应用非常广泛，主要包括以下几个方面：1.基因工程：通过分子克隆技术，可以将目的基因与载体 DNA 结合，从而实现对基因的改造和调控。
分子克隆技术实验讲义黑龙江大学生命科学学院3月甜菜M14品系BvM14-glyI基因的克隆与鉴定一・实验目的1、熟悉和了解目的基因克隆与鉴定的过程和方法。
2、学习和掌握质粒、T载体的特点。
3、学习和掌握TA克隆的连接体系及操作要点。
4、学习和掌握X® I酶切制备T载体的过程及方法。
5、学习和掌握CaC12法制备大肠杆菌感受态细胞的原理和方法。
6、学习并掌握热激法转化技术的原理和操作步骤。
7、学习并掌握重组子鉴定和筛选的原理及蓝白筛选的原理和方法。
8、学习并掌握碱法小量制备质粒DNA的原理及操作步骤。
二.相关知识(一)T载体的制备PMD18-T Vector 种高效克隆PCR产物(T-A Cloning)的商业化专用载体，由pMC 18载体改建而成。
在pMC 18多克隆位点处的Xbal和Sa/I 识别位点之间插入了EcoRV识别位点，用EcoRV进行酶切反应后，再左两侧的3,端添加” T”而成，能够大大提高PCR产物的连接.克隆效率。
相关知识点:(1)质粒的提取;(2)酶切;(3) PCR等。
(二)DNA的重组与连接(PCR产物的克隆)把DNA片段从某一类型的载体无性繁殖到启一类型载体中，例如从某种质粒克隆到另一种质粒，这个过程称为亚克隆。
所谓重组，就是把外源目的基因''装进"载体的过程，即DNA的重新组合。
为了将目的基因重组于载体分子中，需要将载体DNA和目的基因分别进行适当处理，一般采用内切酶法将载体DNA分子切割成可与外源基因连接的线性分子，使其与相同酶切过的载体分子相互连接，彼此成为配伍末端(compatible end),以产生末端连接。
现在一些生物公司也开发了针对不同插入DNA片段的专用载体，如专门用于克隆PCR产物的载体，大大方便了实验操作。
相关知识点：(1)克隆与亚克隆；(2) DNA重组;(3)内切酶;(4)粘性末端与平末端;(5)连接酶;(6)连接酶的分类及功能等。
分子克隆技术实验操作手册《分子克隆技术》实验操作手册李香花吴昌银邢永忠华中农业大学生命科学技术学院课程简介分子克隆技术是指DNA的无性繁殖技术。
分子克隆技术课程主要是针对生物技术专业、生物科学专业、生命科学与技术基地班本科生及生物学类专业研究生而开设的实验课。
实验内容涉及分子克隆的一些基本方法及基本操作技巧，主要包括分子克隆、分子杂交和表达检测三部分分子克隆技术：DNA重组技术是分子生物学的核心内容。
本实验利用质粒载体克隆外源DNA片段，通过这个实验大家可以掌握质粒载体的抽提、外源DNA的准备、酶切、连接及感受态细胞的制备、连接产物的转化以及阳性克隆子的鉴定和验证等。
分子杂交技术：实验室常用的分子杂交技术主要有Southern blotting，Northern blotting，Western blotting及Dot blotting 等。
Southern blotting是通过用一种或多种限制性内切酶消化基因组或其它来源的DNA，经过琼脂糖凝胶电泳按大小分离酶切所得的片段，随后DNA在原位发生变性并从凝胶转移到一固相支持物上（硝酸纤维素膜或尼龙膜）。
DNA转移至固相支持物的过程中各DNA的相对位置保持不变，用一定方法(如放射性同位素或DIG)标记的DNA探针与固着在膜上的DNA 杂交，经显影或显色显现出与探针DNA互补的DNA电泳条带的位置，然后进行分析。
本实验要求掌握植物总DNA的抽提、质量检测、限制性内切酶操作、DNA的琼脂糖凝胶电泳、转膜、探针的制备、同位素操作等方面的实验技术。
系列一分子克隆技术实验一质粒的制备质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，它在基因操作中具有重要作用。
质粒的分离与提取是最常用、最基本的实验技术。
质粒的提取方法很多，大多包括3个主要步骤：细菌的培养、细菌的收集和裂解、质粒DNA的分离和纯化。
本实验以碱裂解法为例，介绍质粒的抽提过程。
实验目的：掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的作用。
第一章目录第一章质粒DNA的分离、纯化和鉴定第二章DNA酶切及凝胶电泳第三章大肠杆菌感受态细胞的制备和转化第四章RNA的提取和cDNA合成第五章重组质粒的连接、转化及筛选第六章基因组DNA的提取第七章RFLP和RAPD技术第八章聚合酶链式反应(PCR)扩增和扩增产物克隆第九章分子杂交技术第十章测序技术第二章质粒DNA的分离、纯化和鉴定第一节概述把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术,送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)。
细菌质粒是重组DNA技术中常用的载体。
质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA 分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。
质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。
质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活,而宿主即使没有它们也可以正常存活。
质粒的存在使宿主具有一些额外的特性,如对抗生素的抗性等。
F质粒(又称F因子或性质粒)、R质粒(抗药性因子)和Col质粒(产大肠杆菌素因子)等都是常见的天然质粒。
质粒在细胞内的复制一般有两种类型:紧密控制型(Stringent control)和松驰控制型(Relaxed control)。
前者只在细胞周期的一定阶段进行复制,当染色体不复制时,它也不能复制,通常每个细胞内只含有1个或几个质粒分子,如F因子。
后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制,在每个细胞中有许多拷贝,一般在20个以上,如Col E1质粒。
在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时,细胞内蛋白质合成、染色体DNA复制和细胞分裂均受到抑制,紧密型质粒复制停止,而松驰型质粒继续复制,质粒拷贝数可由原来20多个扩增至1000-3000个,此时质粒DNA占总DNA的含量可由原来的2%增加至40-50%。
分子克隆技术DNA重组技术是在分子水平对基因进行体外操作，因而也称为分子克隆（Molecular Cloning）或基因克隆，是在体外对DNA分子按照既定的目的进行人工重组，并导入到合适的受体细胞中，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得DNA 分子大量复制，并使受体细胞获得新的遗传特征的过程。
其基本原理是：将编码某一多肽或蛋白质的基因（外源基因）经过特定限制性酶切割以及与目标载体连接，组装到细菌质粒（质粒是细菌染色体外的双链环状DNA分子）中，再将这种质粒（重组质粒）转入大肠杆菌体内，这样重组质粒就随大肠杆菌的增殖而复制，从而表达出外源基因编码的相应多肽或蛋白质，并且来源于一个菌株的质粒是一个分子克隆，而随质粒复制出的外源基因也就是一个分子克隆。
分子克隆技术的成就对于工业、农牧业和医学产生深远影响，并将为解决世界面临的能源、食品和环保三大危机开拓一条新的出路。
实验前准备实验开始前，需准备好所需的试剂，如PCR扩增及酶切，连接所需酶类试剂及相应的buffer，均为TaKaRa产品分装，Buffer、dNTP、引物试剂等需要从-20℃取出至室温融化、涡旋震荡混匀离心后使用，酶类试剂从-20℃取出瞬时离心（小于4000 rpm）放置冰浴中备用。
还有各项实验所需的药品（如琼脂糖），以及配置好培养基，抽提质粒用的溶液一、二、三等试剂。
本次实验所涉及的常规仪器及耗材有：Thermo Scientific Arktik PCR仪，水平电泳槽，超净工作台，恒温水浴锅，紫外照胶仪，赛默飞公司提供的F1，F2和F3一系列量程的单道移液器等仪器，1.5ml离心管，玻璃试管，赛默飞公司提供的QSP盒装吸头及15ml离心管等。
接下来进入实验部分，本实验操作流程为：首先在GenBank中查询目的基因序列，然后根据得到的序列进行酶切位点分析及引物的设计，通过RT-PCR获取目的基因，酶切以及与载体连接，转化进入宿主菌中，针对得到的菌落进行菌落PCR快速筛选，得到初步的阳性克隆，最后通过质粒提取及鉴定，得到的阳性克隆，测序分析及得到正确的重组质粒。
分子克隆技术实验讲义黑龙江大学生命科学学院2016年3 月甜菜M14 品系BvM14-glyI 基因的克隆与鉴定、实验目的1、熟悉和了解目的基因克隆与鉴定的过程和方法。
2、学习和掌握质粒、T 载体的特点。
3、学习和掌握TA 克隆的连接体系及操作要点。
4、学习和掌握Xcm l酶切制备T载体的过程及方法。
5、学习和掌握CaCb法制备大肠杆菌感受态细胞的原理和方法。
6、学习并掌握热激法转化技术的原理和操作步骤。
7、学习并掌握重组子鉴定和筛选的原理及蓝白筛选的原理和方法。
8、学习并掌握碱法小量制备质粒DNA 的原理及操作步骤。
二、相关知识(一)T 载体的制备pMD18-T Vector是一种高效克隆PCR产物(T-A Cloning )的商业化专用载体，由p M C 18载体改建而成。
在p M C 18多克隆位点处的Xba l和Sall识别位点之间插入了Eco R V识别位点，用Eco R V进行酶切反应后，再左两侧的3'端添加“ T”而成，可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。
相关知识点：(1)质粒的提取；(2)酶切；(3) PCR等。
(二)DNA的重组与连接(PCR产物的克隆)把DNA 片段从某一类型的载体无性繁殖到另一类型载体中，例如从某种质粒克隆到另一种质粒，这个过程称为亚克隆。
所谓重组，就是把外源目的基因“装进”载体的过程，即DNA 的重新组合。
为了将目的基因重组于载体分子中，需要将载体DNA 和目的基因分别进行适当处理，一般采用内切酶法将载体DNA 分子切割成可与外源基因连接的线性分子，使其与相同酶切过的载体分子相互连接，彼此成为配伍末端(compatible end),以产生末端连接。
现在一些生物公司也开发了针对不同插入DNA片段的专用载体，如专门用于克隆PCR产物的载体，大大方便了实验操作。
相关知识点： (1)克隆与亚克隆； (2) DNA 重组；(3)内切酶；( 4)粘性末端与平末端；(5)连接酶；( 6)连接酶的分类及功能等。
分子克隆技术实验讲义黑龙江大学生命科学学院2016年3月甜菜M14品系BvM14-glyI基因的克隆与鉴定一、实验目的1、熟悉和了解目的基因克隆与鉴定的过程和方法。
2、学习和掌握质粒、T载体的特点。
3、学习和掌握TA克隆的连接体系及操作要点。
4、学习和掌握XcmⅠ酶切制备T载体的过程及方法。
5、学习和掌握CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的原理和方法。
6、学习并掌握热激法转化技术的原理和操作步骤。
7、学习并掌握重组子鉴定和筛选的原理及蓝白筛选的原理和方法。
8、学习并掌握碱法小量制备质粒DNA的原理及操作步骤。
二、相关知识（一）T载体的制备pMD18-T Vector是一种高效克隆PCR产物（T-A Cloning）的商业化专用载体，由pΜC 18载体改建而成。
在pΜC 18多克隆位点处的XbaⅠ和SalⅠ识别位点之间插入了Eco RⅤ识别位点，用Eco RⅤ进行酶切反应后，再左两侧的3′端添加“T”而成，可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。
相关知识点：（1）质粒的提取；（2）酶切；（3）PCR等。
（二）DNA的重组与连接（PCR产物的克隆）把DNA片段从某一类型的载体无性繁殖到另一类型载体中，例如从某种质粒克隆到另一种质粒，这个过程称为亚克隆。
所谓重组，就是把外源目的基因“装进”载体的过程，即DNA的重新组合。
为了将目的基因重组于载体分子中，需要将载体DNA和目的基因分别进行适当处理，一般采用内切酶法将载体DNA分子切割成可与外源基因连接的线性分子，使其与相同酶切过的载体分子相互连接，彼此成为配伍末端（compatible end），以产生末端连接。
现在一些生物公司也开发了针对不同插入DNA片段的专用载体，如专门用于克隆PCR产物的载体，大大方便了实验操作。
相关知识点：（1）克隆与亚克隆；（2）DNA重组；（3）内切酶；（4）粘性末端与平末端；（5）连接酶；（6）连接酶的分类及功能等。
（三）大肠杆菌感受态细胞的制备外源基因与载体在体外连接成重组体DNA分子后，需将其导入受体细胞进行扩增和筛选，得到大量、单一的重组体分子，这就是外源基因的无性繁殖，或称为克隆。
受体细胞也叫宿主细胞，大肠杆菌宿主菌是目前基因工程最常用的受体细胞。
感受态细胞（competent cell）是经过一定方法处理后，具有接受外源DNA能力的大肠杆菌，只有发展了感受态的细胞才能稳定地摄取外来的DNA分子。
相关知识点：（1）克隆；（2）宿主细胞的定义及分类；（3）感受态细胞定义及其功能；（4）转化定义及方法（DMSO、MnCl2、TB aq、PEG）等。
（四）重组DNA的转化及重组子的鉴定将外源DNA分子导入某一宿主细胞的过程称为转化。
把重组DNA分子导入到细菌中产生克隆有两个目的，一是大量产生重组DNA分子，在完成连接反应后，重组DNA分子往往只有纳克级的量，不易操作和进行下一步的分析，若把重组DNA分子导入到细菌细胞中，细菌细胞可分裂多次产生克隆，克隆中每一个细胞都含有很多个拷贝的重组DNA分子，这样重组DNA分子的量就多了；二是对重组DNA 分子进行纯化，在构建重组DNA分子的过程中很难保证体系中不污染其他的DNA分子，连接过程完成以后体系中有多种分子存在，除了需要的重组DNA分子以外，还含有没有连接上的载体分子、没有连接上的DNA片段、自身环化的DNA分子和连接上污染DNA片段的重组DNA分子，未连接上的载体和DNA片段对实验影响不大，因为它们即使导入细菌细胞，因为不能复制，很快就要被细菌细胞中的酶降解掉；对克隆工作带来影响的是后两种分子，因为它们都为环状，在细菌细胞中都能复制，因而都能产生克隆，但是每个细胞中只能导入一个质粒DNA分子，每个单克隆都是由一个细胞形成的，因此在每个克隆中所有的细胞都只含有同一种质粒。
所以只要对不同的克隆进行筛选，就可以鉴定所需的重组DNA 分子。
所谓的重组子（recombinant）也叫做转化子（transformant）是指吸收了重组DNA分子的转化细胞。
将重组子从其它细胞群中（如上面提到的对克隆影响较大的自身环化的DNA分子和连接上污染DNA片段）分离出来，并鉴定无性繁殖的外源基因确实为目的基因，这过程称为筛选（screening）。
根据载体体系、宿主细胞的特性以及外源基因在受体细胞表达情况的不同，初步把筛选方法分为直接筛选和间接筛选，直接筛选法又可进一步分为DNA鉴定筛选法、选择性载体筛选法、分子杂交选择法；间接筛选也可以进一步分为免疫学方法、mRNA翻译检测法；本试验采用平板筛选法中的蓝白筛选法。
相关知识点：①转化（transformation）质粒（plasmid）②转染(transinjection) 噬菌体（phage）③显影注射（1）导入的方法④电转化 2.5kv⑤基因枪geneblaster⑥脂质体介导法⑦其它方法：快速冷冻法、碳化硅纤维介导法（2）重组子：转化子（3）重组反应体系中的成分：①②③④⑤⑥（4）筛选的方法DNA鉴定筛选法：定位、测序①直接筛选法选择性载体筛选法：λph包裹、抗药性α-互补分子杂交筛选法：ISH、Southern Blot免疫化学免疫学方法②间接筛选法酶免疫检测mRNA翻译检测法（五）质粒DNA的提取（碱裂解法）原核生物没有真正的细胞核，DNA一般位于一个类似“核”的结构——称为类核体上（因为不是一个完整的细胞核）。
E.coli的遗传物质主要是染色体DNA ，E.coli的染色体为双股环状DNA，含有1400个以上的基因，另外还有一些质粒DNA。
1、质粒的概念质粒是细菌（如E.coli）染色体外的小型环状双链DNA分子。
一般说来，质粒不是细菌生长繁殖所必须的结构，就细胞生存而言，质粒是可有可无的。
质粒分子本身含有复制功能的遗传结构，故能在细菌内独立地进行复制，并在细胞分裂时恒定地遗传给子代细胞。
2、研究质粒的意义（1）质粒作为一种裸露的，比病毒更简单、更有自主复制能力的DNA分子，正好处于生命与非生命的分水岭上。
由于质粒能够复制、能够传递、能够表达其遗传信息，说明质粒是独立的有机体，是亚细胞生命体系的成员，是比病毒更简单的原始生命形态，所以质粒是研究生命起源的一块重要的基石。
（2）要把一个有用的基因通过基因工程手段送进生物细胞中，需要运载工具。
携带外源基因进入受体细胞的这种工具叫载体。
由于质粒具有遗传传递和遗传交换的能力，因此，质粒作为基因工程的重要运载工具，在现代分子生物学占有重要地位。
3、质粒的分类不同的质粒在宿主细胞中的拷数也不同，根据质粒在细胞中拷贝数的多少，Rownd（1969）把质粒分为严密型质粒和松弛型质粒。
（1）严密型质粒（stringent plasmid）：严密型质粒多半是一些具有自身传递能力的大质粒，其DNA的复制与宿主染色体DNA的复制相偶联，受到某种程度的控制，每个细胞仅有1-2个拷贝。
（2）松驰型质粒（relaxed plasmid）：松驰型质粒多半是分子量较小、不具传递能力的质粒，其复制是在松驰控制下进行的，每个细胞的拷贝数约为10～200个。
当向培养基中加入氯霉素时，细胞的蛋白质合成被抑制，细胞染色体DNA和严密型质粒DNA的复制停止，松驰型质粒DNA的复制继续进行。
松驰型质粒DNA的拷贝数可达数百个，基因工程中使用的质粒都是松弛型质粒。
相关知识点：（1）质粒的分类：①与宿主相关程度：严密型质粒（stringent plasmid）、松弛型质粒（relaxed）②是否有转移基因：接合型质粒、非接合型质粒③带有特殊用途的基因：生殖质粒（F质粒）、抗性质粒（R-质粒）、col质粒（编码杀死其他细菌的蛋白质）、降解质粒、致病质粒（Ti）（2）质粒的提取方法：煮沸法、CsCl、试剂盒、碱裂解法；①SC构型：cccDNA (covalently closed circle DNA)②OC构型：ocDNA (open circle DNA)③L构型：L-DNA (linearDNA)三、实验原理（一）T载体的制备XcmⅠ是一种Ⅲ型的限制性核酸内切酶，其识别序列为：5′-CCANNNNN^NNNNTGG-3′3′-GGTNNNN^NNNNNACC-5其中阴影部分为XcmⅠ的识别序列，“^”为XcmⅠ的切割位点，其识别序列中间的9个任意核苷酸（N）对XcmⅠ的酶切特异性及酶切效率没有影响。
为了能得到用XcmⅠ酶切后3′末端均是T的载体，本实验利用了XcmⅠ的识别序列的特点，引物的3′端带有XcmⅠ酶切位点，其序列如下：Primer1：5′-CGCCCATGCTA^GCGCTGGTAAT- 3′Primer2：3′- TCTCTAAGGTATGC^ATATGACCCGC- 5′引物中“^”为XcmⅠ的切割位点，当XcmⅠ对PCR得到的线性片段进行酶切的时候，便会产生一个与T载体形式完全一样的3′-T粘性末端。
（二）DNA的重组与连接（PCR产物的克隆）1988年，Clarke发现所有的PCR产物都在Taq DNA聚合酶的作用下在3′端附加上了一个3′突出的腺苷酸，因为Taq DNA聚合酶具有非模板介导的核苷酸转移酶活性，可在双链DNA末端加上一个单一的3′突出的dATP，利用Taq DNA聚合酶的这一特性，在克隆载体上附加3′胸腺嘧啶（dTTP）形成T-A克隆系统，即可直接对PCR产物进行有效的克隆，这样的载体称为T-载体。
（三）大肠杆菌感受态细胞的制备大肠杆菌感受态细胞的制备技术是从20世纪70年代初期发展起来的，当时人们发现如果把E.coli 细胞浸在一冰冷的盐溶液，它吸收DNA分子的能力要比不浸的细胞强；经过摸索和总结，人们终于采用50 mmol/L的氯化钙（CaCl2）溶液来制备感受态细胞。
其他的盐（如氯化铷RbCl）也很有效。
尽管对这一处理的确切机制仍不清楚，但有人对感受态提出了两种假说，一种认为是细菌细胞壁的局部失去了壁结构或局部溶解，让外源DNA分子通过质膜进入；另一种认为DNA分子能进入细菌细胞是由于细胞处于感受态时表面形成了一种可接受DNA的酶位点。
一旦细胞被处理制备成感受态细胞，它们就能稳定地摄取外源DNA分子了。
（四）重组DNA的转化及重组子的鉴定转化是使重组体DNA分子在热休克的短暂时间内被导入受体。
一般认为DNA分子在转化过程中将经历四个阶段，第一个阶段是吸附阶段，完整的双链DNA分子将吸附于感受态细胞的表面；第二个阶段为转入阶段，双链DNA分子解链，以单链的形式进入细胞，而另一链则被降解；第三阶段是自身稳定阶段，外源质粒在细胞内又复制成双链环状DNA；第四个阶段是表达阶段，即目的基因随同质粒的复制子一起复制。
有些株系的E.coli尽管用抗生素抗性基因的插入失活法来筛选重组子很方便，但有的质粒还是采用了其他基因进行筛选，效果同样不错。
