兔软骨细胞的分离培养及其生物学特征的检测

家兔关节软骨细胞的分离与培养实验动物3周龄新西兰大白兔实验试剂胎牛血清, 胰蛋白酶, II型胶原酶, 台盼蓝, DMEM培养基, 甲苯胺蓝染色剂主要试剂配制方法一NaCI 克KCI 克KH2PO3 克Na2HPO3·12H2O 克精确称量上述药品并充分溶解于1000mL三蒸水中，用1mol/L HCI和1mol/L NaOH溶液调整pH值至一。

培养液将DMEM干粉一包溶于1O00mL三蒸水中，按说明书加入NaHCO3，并加入双抗(终浓度为:青霉素100U/mL，链霉素100U/mL)和维生素C(终浓度为:50mg/L)，调节PH到一，超净工作台内过滤除菌。

置一200C冰箱保存备用。

如需含血清的培养基，于使用前加入足量56℃水浴灭活30分钟的胎牛血清(FCS)。

.主要实验仪器倒置显微镜, 数码照相机, 二氧化碳培养箱(2300型),超净工作台(SW-CJ一IF型), 低温离心机型),电子天平(MAllo型)磁力搅拌器.2方法.兔关节软骨细胞的培养与传代将一只健康的三周龄新西兰大白兔耳缘静脉空气栓塞处死，备皮，用碘酒消毒背部及四肢皮肤，在无菌操作下，在超净工作台内用手术刀削下双侧膝关节软骨，以不渗血为度。

充分漂洗软骨小块。

用眼科剪将软骨组织剪成约lmm3小的碎块，收集置于离心管中，以PBS冲洗2次，向离心管加10一巧mLO.%胰酶。

吹打成组织悬液，装入50mL玻璃培养瓶。

放进二氧化碳培养消化1时。

消化后将培养瓶静置桌上，待软骨组织沉淀后，吸出胰蛋白酶。

将配好型胶原酶10mL以滤器过滤入培养瓶，加入胎牛血清。

放进二化碳培养箱消化4一6小时。

细胞从基质中释放于消化液中，经过滤除去未被消化的软骨碎片，将消化液置于离心管中100orpm、10min离心，弃上清液收集软骨细胞，加DMEM液，1000印m、10而n离心，冲洗2次，弃上清液，加入上述细胞培养液(含10%FBS的青霉素、链霉素的DMEM培养液)制成细胞悬液，滤网过滤，血球计数板计数，并把细胞悬液稀释成2x105/c时的密度，接种于25c衬的培养瓶中，血球记数板计数。

·论著·利用P L A、P G A、P L G A三种支架再生兔关节软骨陈哲峰范卫民刘峰【摘要】目的观察兔关节软骨细胞在聚乳酸(P L A),聚羟基乙酸(P G A),以及两者的共聚物P L-G A三种三维支架上的贴附和生长情况,利用组织工程技术培养工程化关节软骨。

方法多聚赖氨酸包埋P L A,P G A,P L G A三维细胞支架。

分离培养兔关节软骨细胞,体外扩增后种植到三种支架中。

在体外培养软骨细胞一支架复合物,4周终止培养,进行H E、M a s s o n组织学染色、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色。

结果(1)体外培养发现,软骨细胞在P L G A支架材料内贴附生长良好,长期培养仍保持软骨细胞特性,其贴附生长能力,分泌Ⅱ型胶原能力较P G A,P L A支架组强。

(2)支架经过多聚赖氨酸包埋后,软骨细胞的贴附生长及分泌Ⅱ型胶原能力均较对照组好。

结论多聚赖氨酸处理的P L G A三维支架适合软骨细胞贴附生长和分泌Ⅱ型胶原,可作为软骨组织工程的细胞载体。

【关键词】软骨细胞;细胞支架;多聚赖氨酸E x p e r i m e n t a l s t u d y o n r e g e n e r a t i o n o f a r t i c u l a r c a r t i l a g e o n P L A,P G A,P L G A s c a f f o l d b y t i s s u e e n g i n e e r i n g8/5).’2K2+,,A<);2%M%+,L I UA2+,N B2E-@3M2+3*K J@3’*E27%=Q,A%@Q3<K K%1%-327/*Q E%3-1,)-+G%+,C27%=-1U+%O2@Q%3D,)-+G%+,210029,8/I)<【A b s t r a c t】O b j e c t i v e T o s t u d y t h e a b i l i t y o f p o l y l a c t i c a c i d(P L A),p o l y g l y c o l i c a c i d(P G A),P L G A i ns u p p o r t i n g t h e g r o w t ho f r a b b i t c h o n d r o c y t e s,a n d t o r e c o n s t r u c t a r t i c u l a r c a r t i l a g eb y t i s s u e e n g i n e e r i n g.M e t h o d s C o a t e dP L A,P G A,P L G Aw i t h p o l y-l-l y s i n e,f r e e c h o n d r o c y t e s i s o l a t e d f r o m r a b b i t a r t i c u l a r c a r-t i l a g ew e r e s e e d e do n t o t h r e ek i n d s o f s c a f f o l d s a f t e r e x p a n s i o nb y i nv i t r o c u l t u r e.T h e c o m p l e xo f c e l l-s c a f f o l dw a s t h e n c u l t u r e d i n v i v o.A f t e r4w e e k s o f c u l t u r e,t h e c o m p l e xw a s a s s e s s e d b y h i s t o l o g i c a l s t a i-n i n g o fH-E a n dM a s s o n.I m m u n o h i s t o c h e m i c a l a n a l y s i sw a s p e r f o r m e d t o e v a l u a t e c o l l a g e n t y p eⅡs y n t h e-s i s.R e s u l t s(1)A r t i c u l a r c h o n d r o c y t e s w e r e w e l l d i s t r i b u t e d a n d a d h e r e d t o P G A,P L G A s c a f f o l d s a n dm a i n-t a i n e d t h e i r c h a r a c t e r i s t i c s o f a r t i c u l a r c a r t i l a g e t h r o u g h o u t t h e c u l t u r e p e r i o d.(2)C h o n d r o c y t e sw e r ew e l ld i s t r i b u te d a n d a d h e r e d t o s c af f o l d s a f t e r c o a t e dw i t h p o l y-l-l y s i n e,a n d s e c r e t e dm o r e t y p eⅡc o l l ag e n i n c o n-t r a s t t o n o n-c o a t e d s c a f f o l d s.C o n c l u s i o n P L G A s c a f f o l d c o a t e dw i t h p o l y-l-l y s i n e c a n s u p p o r t t h e c h o n d r o-c y t e p r o l i f e r a t i o nw i t hm a i n t e n a n c e o f t h e i r p h e n o t y p e,a nd c a n be s u i t a b l e c a r r i e r sf o r t i s s u e e ng i n e e r i n g o fa r t i c u l a r c a r t i l a g e.【K e y w o r d s】C h o n d r o c y t e;S c a f f o l d;P o l y-l-l y s i n e[(%-+,Q9C27(,<9,9Q32005,31(8):599S601N]由于软骨自身修复能力有限,创伤等病因导致关节软骨缺损后,常继发成为骨关节炎。

摘要：本研究旨在通过体外培养软骨细胞，探讨软骨细胞的生长特性、增殖能力及其在生物医学领域的应用潜力。

通过一系列实验，我们对软骨细胞的体外培养条件、增殖状态、细胞形态及功能进行了深入研究。

以下为实验总结。

一、实验目的和要求：1. 建立软骨细胞体外培养体系，优化培养条件。

2. 观察软骨细胞的增殖状态、细胞形态变化及功能表达。

3. 探讨软骨细胞在生物医学领域的应用前景。

二、实验仪器设备：1. 培养箱2. 超净工作台3. 移液器4. 倒置显微镜5. CO2培养箱6. 电热恒温水浴锅7. 流式细胞仪8. 低温离心机9. 低温冰箱三、实验设计及调试：（一）实验内容：1. 软骨细胞分离与培养2. 软骨细胞增殖实验3. 软骨细胞形态观察4. 软骨细胞功能实验（二）实验电路：无（三）实验设计及调试步骤：1. 对实验内容和实验电路进行分析，理出完成实验的设计思路。

2. 列出程序设计所需的特殊标志位、堆栈sp、内部ram、工作寄存器等资源的分配列表，分配列表时注意考虑资源在程序执行过程可能会出现冲突的问题。

3. 画出程序设计流程图，包括主程序和各子程序流程图。

4. 根据上述内容写出实验程序。

5. 调试程序，使用模拟仿真器进行模拟实验，观察结果，修改程序，继续调试，直至实验成功。

（四）实验调试过程中所遇到的问题、解决问题的思路和方法：1. 问题：软骨细胞在培养过程中出现污染。

解决方法：加强无菌操作，提高实验室空气质量，定期更换培养箱内的空气。

2. 问题：软骨细胞增殖缓慢。

解决方法：优化培养条件，调整细胞密度，增加生长因子。

3. 问题：软骨细胞功能表达不足。

解决方法：延长培养时间，提高细胞浓度，优化培养条件。

四、实验结果与分析：1. 软骨细胞在体外培养条件下，成功分离并建立了稳定的细胞系。

2. 软骨细胞增殖实验结果显示，细胞在体外培养条件下具有较好的增殖能力。

3. 软骨细胞形态观察表明，细胞呈典型的软骨细胞形态，细胞质丰富，细胞核清晰。

人骨关节炎软骨细胞的体外培养及细胞形态学分析唐新;郑果;黄强;李棋;付维力;李箭;陈刚;周宗科;裴福兴【摘要】目的：研究人骨关节炎关节软骨细胞的体外分离及培养方法，观察各代人关节软骨细胞的形态学特性，为临床基础研究提供参考依据。

方法取全膝置换术患者残存的无菌膝关节软骨，采用两步酶消化法（胰蛋白酶＋Ⅱ型胶原酶）分离培养人关节软骨细胞，并进行传代培养。

通过倒置相差显微镜下观察每代的细胞形态，甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色对细胞进行进一步鉴定后绘制生长曲线。

结果两步酶消化法消化出的软骨细胞呈接近圆形，培养2~3 d，细胞贴壁、变形，呈多角形或条状，2周左右细胞融合成层，4代后出现明显分化，软骨细胞增殖和生长缓慢。

形态学、免疫组织化学染色显示细胞培养4代以内可以保持表型的稳定。

结论体外培养骨关节炎软骨细胞4代以内生长良好，生物学特性明显，4代以后出现去分化现象，提示我们2或3代骨关节炎软骨细胞是用于实验研究的最佳选择。

%Objective To study the methods for isolation,culture and identification of articular chondrocytes as well as the biological characteristics from osteoarthritis patients in vitro. Methods Cartilage was harvested under sterile conditions from osteoarthritis knee joints in total knee arthroplasty. Human articular chondrocytes were isolated by using two-step enzymatic di-gestion,and the cells were cultured and subcultured respectively in vitro. Cell morphology were observed under phase-contrast microscope,toluidine blue staining,type Ⅱ collagen immunohistochemistry staining and growth curve was drawn. Results The morphology of osteoarthritis chondrocytes was similar to fibroblasts,and the growth rate was slowly. It could get a confluent layer after culture for about two weeksand appeared distinct differentiation in passage four. Toluidine blue staining and type Ⅱ colla-gen immunohistochemistry staining showed that the chondrocytes cultured in vitro maintained the specific chondrocytes pheno-type in the first 4 passages. Conclusion Within 4 passages,the osteoarthritis chondrocytes grew well with obviously biological characteristics and turned to dedifferentiation after 4 passages.【期刊名称】《实用骨科杂志》【年(卷),期】2015(000)007【总页数】5页(P614-617,618)【关键词】骨关节炎;人软骨细胞;细胞学【作者】唐新;郑果;黄强;李棋;付维力;李箭;陈刚;周宗科;裴福兴【作者单位】四川大学华西医院骨科，四川成都610041;四川大学华西医院骨科，四川成都 610041;四川大学华西医院骨科，四川成都 610041;四川大学华西医院骨科，四川成都 610041;四川大学华西医院骨科，四川成都 610041;四川大学华西医院骨科，四川成都 610041;四川大学华西医院骨科，四川成都 610041;四川大学华西医院骨科，四川成都 610041;四川大学华西医院骨科，四川成都610041【正文语种】中文【中图分类】R684.3骨关节炎(osteoarthritis，OA)是一种随年龄增长而发生率明显增加的退行性关节疾病，其发病是一个多因素参与的复杂过程[1]，至今其病因和发病机理仍不是十分清楚。

两种软骨终板细胞体外培养方法效果的比较研究汤小康;李敏;应航;卢敏【摘要】目的比较原代椎间盘软骨终板细胞实验室培养中Ⅰ型与Ⅱ型胶原酶消化效率的差异.方法提取新西兰大白兔椎间盘软骨终板组织,将其剪碎并随机分成2等份,标记为Ⅰ型胶原组和Ⅱ胶原型组;用0.25％的胰蛋白酶预消化后,分别用0.02％Ⅰ型胶原酶和0.02％Ⅱ型胶原酶在37 cc消化3次,每次lh;将3次消化所得的细胞悬液混匀后离心,获取细胞并进行培养与传代;对两组软骨终板细胞分别进行细胞计数、细胞形态学观察和细胞增殖情况检测等处理,比较两组软骨终板细胞数目、形态及增殖情况的差异.结果 1)细胞计数:Ⅰ型胶原组细胞3次细胞计数结果分别为5.75×104个/mL、5.50×104个/mL、6.25×104个/mL,获得软骨终板数目(5.83±0.31)×104个/mL;Ⅱ胶原型组细胞3次细胞计数结果分别为8.75×104个/mL、9.50×104个/mL、8.25×104个/mL,获得软骨终板数目(8.83±0.51)×104个/mL,Ⅰ型胶原组细胞总量明显少于Ⅱ胶原型组;2)细胞形态:两组软骨终板细胞多呈多角形,胞核大而圆,形态无明显差异.3)细胞增殖:Ⅰ型胶原组细胞MTT读数OD 值为(0.561±0.003),Ⅱ胶原型组细胞MTT读数OD值为(0.562±0.002),组间差异无统计学意义(P＞0.05).结论Ⅱ型胶原酶较Ⅰ型胶原酶更适用于原代椎间盘软骨终板细胞的分离培养.【期刊名称】《中国中医急症》【年(卷),期】2016(025)003【总页数】3页(P397-399)【关键词】软骨终板细胞;Ⅰ型胶原酶;Ⅱ型胶原酶;细胞培养【作者】汤小康;李敏;应航;卢敏【作者单位】湖南中医药大学第一附属医院,湖南长沙410007;浙江中医药大学医学技术学院,浙江杭州310053;浙江中医药大学医学技术学院,浙江杭州310053;湖南中医药大学第一附属医院,湖南长沙410007【正文语种】中文【中图分类】R274椎间盘源性腰痛临床患病率较高，病情典型者严重影响患者日常生活，其属于中医学“腰痛”范畴，益气补肾是中医治疗腰痛的基本方略之一［1］。

兔软骨终板细胞的分离培养及退变模型的建立张勇;徐永清;王非;陆华拓;朱崇涛;唐辉;游永刚【期刊名称】《西南国防医药》【年(卷),期】2009(019)008【摘要】目的:体外分离单层培养兔软骨终板细胞,并通过传代建立软骨终板退变模型.方法:利用酶联合消化法分离软骨终板细胞,比较不同消化时间后,细胞收获数量及存活率,通过传代观察细胞形态变化,并应用甲苯胺蓝染色鉴定软骨终板细胞的表型.结果:Ⅱ型胶原酶消化3 h后,收获细胞数量最多,且细胞存活率最高;随着传代,软骨终板细胞由三角形逐渐向长梭形转变,蛋白多糖分泌减少,出现反分化等退变现象.结论:体外可单层培养兔软骨终板细胞,通过传代能够建立退变模型.【总页数】4页(P761-763,封4)【作者】张勇;徐永清;王非;陆华拓;朱崇涛;唐辉;游永刚【作者单位】成都军区昆明总医院全军骨科中心〈昆明医学院教学医院〉,云南,昆明,650032;成都军区昆明总医院全军骨科中心〈昆明医学院教学医院〉,云南,昆明,650032;广州军区广州总医院骨科,广东,广州,510010;成都军区昆明总医院全军骨科中心〈昆明医学院教学医院〉,云南,昆明,650032;成都军区昆明总医院全军骨科中心〈昆明医学院教学医院〉,云南,昆明,650032;成都军区昆明总医院全军骨科中心〈昆明医学院教学医院〉,云南,昆明,650032;成都军区昆明总医院全军骨科中心〈昆明医学院教学医院〉,云南,昆明,650032【正文语种】中文【中图分类】R681.5【相关文献】1.退变兔椎间盘软骨终板细胞培养及其形态学和生物学特征 [J], 屈开钛;徐永清;王非2.补阳还五汤对兔腰椎间盘退变模型中软骨终板的影响 [J], 吕存贤;吴永琴3.IL-6对体外培养的兔软骨终板细胞生物学行为的影响 [J], 叶伟;马若凡;丁悦;黄东生;陈为坚;彭焰;刘尚礼4.大鼠椎间盘软骨终板软骨细胞体外自然退变模型的建立 [J], 石继祥;王拥军;施杞;周泉;孙鹏;卞琴;周重建5.兔膝关节骨性关节炎模型的建立及软骨细胞的分离、培养 [J], 赵强;王一洲因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

34第13卷 第5期 2011 年 5 月辽宁中医药大学学报JOURNAL OF LIAONING UNIVERSITY OF TCMVol. 13 No. 5 May，2011骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymalstem cell，BMSCs）是中胚层来源的具有多方向分化潜能的干细胞，在不同的诱导条件下能分化为成骨细胞、肌细胞、脂肪细胞、神经细胞等，其在细胞治疗、组织工程和基因治疗等方面的应用前景较为广阔。

本实验采用贴壁筛选法对新生兔BMSCs 进行分离和纯化，并向成骨及成脂肪细胞方向诱导，初步了解BMSCs 的生物学特性，为BMSCs 符合载体的体内移植奠定了基础。

1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验动物出生2~3天的新西兰大白兔，雌雄不限，由广西医科大学医学科学实验中心提供。

1.1.2 仪器CO 2培养箱（日本三洋公司），高速离心机（上海飞鸽牌），细胞培养瓶（美国Corning 公司）；超净工作台（苏净集团安泰公司）、倒置相差显微镜（OLYMPUS）等系列实验器材及实验器皿。

1.1.3 试剂L-DMEM 培养液（Gibco 公司）、胎牛血清（Hyelone 公司）、β-甘油磷酸钠、地塞米松、维生素c、胰岛素、吲哚美辛、1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤、Red oil、素木精、Von Kossa 试剂盒、DAB 试剂盒等。

1.2 方法1.2.1 BMSCs 的分离与培养抓取一只新生兔，脱颈处死后置75％乙醇中浸泡3min，无菌条件下取出双侧股骨，剔除股骨附属软组织、无血清L-DMEM 冲洗2次，移至超净工作台内将股骨从中间用直剪剪断后，用1mL 注射器抽取骨髓同时尽量抽取髓腔血窦内细胞，移至离心管内，添加适量的含血清培养液用注射器反复冲打制成单细胞悬液。

将其离心（1000r/min，5min）弃上清液，加入细胞培养液（含胎牛血清10%，青霉素100U/mL，链霉素100U/mL）重悬，以105个/cm 2的密度将细胞悬液移入培养瓶，置入37℃、5％CO 2，PH7.5，饱和湿度的培养箱内培养。

BMSCs的分离培养、纯化与鉴定作者：马民吕志刚杜以宽张桂娟马义【摘要】目的建立一种持续、稳定的可多向分化的骨髓间充质干细胞（BMSCs）体外分离培养体系。

方法运用密度梯度离心法从1月龄新西兰兔骨髓中分离培养BMSCs，利用相差显微镜观察其形态及生长情况，扫描电镜观察其细胞结构，运用流式细胞术分析分离细胞群所处细胞周期和细胞活力，用MTT比色法绘制细胞生长曲线，并用特定诱导液将分离的BMSCs向成骨细胞和成脂肪细胞定向诱导分化，利用ALP和油红O进行染色鉴定。

结果所分离的BMSCs细胞在形态学观察与生长动力学上均符合BMSCs特征，分离培养的BMSCs细胞在第3天进入对数生长期，第10天进入平台期；在成骨、成脂肪的诱导培养条件下，分别出现成骨、成脂肪表型特征，可进一步定向分化，结论所收获的细胞具有BMSCs的特异性。

【关键词】骨髓间充质干细胞；分离；成骨分化；成脂分化【Abstract】 Objective To establish a sustained and stable bone marrow derived mesenchymal stem cells (BMSCs) isolation and culture system which could be pluripotential in vitro. Methods BMSCs were isolated and cultured from the 1month old New Zealand white rabbits through density gradientcentrifugation. Growth and ultromicrostructure of the BMSCs were observed by light microscope and scan electron microscope. The cell activities and cell cycle were observed by flow cytometry. The grow curve of the BMSCs was described through MTT assay. BMSCs were induced and differentiate into osteoblasts and adipocytes by specific induction culture medium. Then the cells were stained with alkaline phosphatase (ALP) and Oil red O , and analyzed the result of all staining. Results The isolated BMSCs cells were in line with the characteristics of BMSCs in morphology and growth kinetics, and the isolated BMSCs cells would be into the logarithmic growth phase in the third day and into the platform phase in the tenth day. Conclusions In the osteogenic and adipogenic induced culture conditions, BMSCs have appeared the phenotypic characteristics of osteogenic and adipogenic respectively, and could be further directed differentiation. These indicated the harvested cells possessed BMSCs specificity.【Key words】 Bone marrow derived mesenchymal stem cells(BMSCs); Isolation; Osteogenic differentiation; Adipogenic differentiation软骨组织工程技术〔自体软骨细胞的移植、生长因子对软骨细胞的作用、骨髓间充质干细胞（又称骨髓基质干细胞，BMSCs）在软骨组织工程中的作用、转基因技术〕是当今的研究热点〔1，2〕。