乳酸细菌淀粉酶分子生物学研究进展林谦【摘要】The research progress of amylases from lactic acid bacteria, including microbial sources, molecular biology and applications was reviewed. Besides, their prospects were also discussed in this paper.%综述了乳酸细菌淀粉酶的研究概况，包括微生物来源、分子生物学研究与应用三个方面，并对其研究前景进行了展望，以期对学界的研究结果有所补充和发展。
【期刊名称】《玉林师范学院学报》【年(卷),期】2013(000)005【总页数】6页(P80-85)【关键词】乳酸细菌;淀粉酶;分子生物学【作者】林谦【作者单位】玉林师范学院生命科学与技术学院，广西玉林 537000【正文语种】中文【中图分类】Q939乳酸是三大有机酸之一，在食品、医药、化工行业用途广泛.乳酸的聚合物聚乳酸(Polyactic acid,PLA)是近年来备受重视的环保材料，可用来生产生物降解塑料、医用材料、生物降解纤维等.由于L-乳酸聚合的聚L-乳酸熔点较低，若与D-乳酸掺和，可提高聚乳酸的熔点，大大改善热稳定性[1].无论是L-乳酸还是D-乳酸，都有重要的应用价值.乳酸细菌是一类能利用可发酵糖产生大量乳酸的细菌的通称.现已发现某些乳酸细菌可产生淀粉酶，统称为解淀粉乳酸细菌(amylolytic lactic acid bacteria, ALAB).使用这类乳酸细菌可直接利用淀粉发酵生产乳酸，简化了工艺，具有成本优势，是乳酸发酵的研究热点.1 解淀粉乳酸细菌的来源解淀粉乳酸细菌大多分离自淀粉发酵食品或富含淀粉的有机废弃物，也有部分是从动物体内分离.分离出的解淀粉乳酸细菌包括乳杆菌、链球菌、乳球菌，表1列出了一些研究较详细的解淀粉乳酸细菌.传统的细菌分类学并不认为乳酸细菌可产生淀粉酶，由于各种解淀粉乳酸细菌的发现，人们加深了对乳酸细菌特征的认识，也确定了一些新的物种，它们的种名均与淀粉有关，如Lactobacillus amylophilus (嗜淀粉乳杆菌), Lactobacillus amylovorus(降解淀粉乳杆菌)，Lactobacillus amylolyticus (溶淀粉乳杆菌)，Lactobacillus manihotivorans(吞食木薯乳杆菌，国内有人翻译为木薯象牙海岸乳杆菌，实际上该种名的意思是cassava-devouring，因此翻译为吞食木薯乳杆菌似更为确切).2 乳酸细菌淀粉酶的种类与特性虽然已分离出多株产淀粉酶的乳酸细菌，但是只有部分菌株的淀粉酶有详细的研究报道.有少数几个乳酸细菌淀粉酶的基因被克隆并鉴定，随着微生物基因组学的发展，已经发现多种乳酸细菌基因组中存在淀粉酶的同源序列，在GenBank/EMBL/DDBJ数据库中它们被标记为假定的淀粉酶基因，这些基因的表达产物尚未有相关的实验报道.乳酸细菌淀粉酶大多是分泌到胞外，也有的是在细胞质内或结合在细胞壁上.产生的淀粉酶种类大多属于α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)，也有几个是淀粉普鲁兰酶(EC3.2.1.41)，还有个别是麦芽糖淀粉酶(EC 3.2.1.133).淀粉酶的最适反应温度介于35-65℃之间，比人的体温高.乳酸细菌由于会产生乳酸，造成pH的下降，所产生的淀粉酶的最适pH偏酸，大都在5-6之间，从文献报道来看，Lactobacillus plantarum L137胞外淀粉普鲁兰酶最适pH最低(pH3.8～4.0)[24].乳酸细菌淀粉酶的分子量差异非常大，小的22 kDa，大的则有215 kDa.表1 产淀粉酶的乳酸细菌Table 1 Amylase-producing lactic acid bacterium乳酸细菌分离来源参考文献Lactobacillus amylophilus NRRL B-4437 猪粪玉米发酵物 [2]Lactobacillus amylovorus NRRL B-4540 牛粪玉米发酵物[3]Lactobacillus LEM 220, 207, 202 鸡嗉囊 [4]Leuconostoc 10137 酸贮液体鱼蛋白饲料 [5]Streptococcus bovis JB1 动物瘤胃 [6]Lactobacillus cellobiosusD-39 废弃蔬菜 [7]Lactobacillus plantarum L137 菲律宾食品Burong Bangus[8]Lactobacillus manihotivorans LMG 18010, LMG 1801哥伦比亚木薯酸淀粉[9]Lactobacillus plantarum A6 雨水浸泡的木薯根 [10]Lactobacillus fermentum Ogi E1，Mw2 贝宁玉米发酵面团 [11]Lactobacillus amylolyticus DSM 11664 啤酒麦芽 [12]Lactobacillus amylophilus GV6 玉米淀粉工业废水[13]Lactobacillus fermentum K9 尼日利亚传统发酵食品 [14]Lactobacillus plantarum C5, OB8 尼日利亚传统发酵食品 [14]Lactobacillus gasseri ATCC 33323 未知 [15]Streptococcus sp.FH164 厨余垃圾 [16]Enterococcus faecium No.78 菲律宾发酵米糕 [17]Lactococcus lactis ctis B84 保加利亚发酵食品黑麦酸面团 [18]Lactobacillus paracasei B41 保加利亚传统发酵饮料boza [19,20]Lactobacillus plantarum Bom 816 保加利亚传统发酵饮料boza [20,21]Lactobacillus pentosus N3 保加利亚传统发酵饮料boza [20,21]Lactococcus lactis IBB500 植物 [22, 23]2.1 α-淀粉酶解淀粉乳酸细菌大多可产生α-淀粉酶.其中研究得最透彻的是Lactobacillus plantarum A6、Lactobacillus amylovorus NRRL B-4540、Lactobacillus manihotivorans LMG 18010的α-淀粉酶，这三个酶极其相似，而它们的结构、分子量与一般淀粉酶有明显差异.Lactobacillus plantarum A6的α-淀粉酶可降解生淀粉，为内切酶，切割1，4-葡萄糖苷键[25].Lactobacillus amylovorus NRRL B-4540的α-淀粉酶可降解生淀粉，SDS-PAGE显示其分子量约为140±10 kDa.该淀粉酶最适温度为60-65℃，然而在60℃的热稳定性相当差[26]，似乎是一个矛盾.POMPEYO等人比较了Lactobacillus amylovorus ATCC 33620和Lactobacillus amylophilus NRRLB-4437二者的α-淀粉酶[27].ATCC 33620的淀粉酶活力大于NRRL B-4437的淀粉酶.NRRL B-4437的淀粉酶分子量约为100 kDa.两者的最适pH都在5.0-6.0之间.ATCC 33620的淀粉酶在50℃稳定，在60℃ 20分钟活力即明显下降.NRRL B-4437的淀粉酶在40℃稳定.乳杆菌Lactobacillus amylovorus NRRL B-4540、Lactobacillus plantarum A6、Lactobacillus manihotivorans LMG 18010的α-淀粉酶基因amyA有98%的部分相同.三个amyA基因均含有分解代谢物效应顺式作用元件(cre)，表明这三个淀粉酶基因的表达可能受到分解代谢物的调控[28].从氨基酸序列推断，这几个乳杆菌α-淀粉酶分子量分别为105 kDa、99.5 kDa、98 kDa，比实验得到的结果要小.每个淀粉酶基因可分成5'、3'端两半部分：5'部分包含大约480个氨基酸，具有明显的α-淀粉酶家族特征；3'部分由串联的正向重复序列组成，每个重复序列以一个微卫星样结构开始，与真核生物的相似，而这种结构在原核生物中极罕见.在乳杆菌基因组中，这些重复序列仅存在于α-淀粉酶基因中，而在染色体其它区域并不存在.根据序列特征推断，L.plantarum和L.amylovorus的α-淀粉酶基因来源于一个共同的祖先，祖先基因中插入了一个321 bp的片段，然后这个片段在两个乳杆菌的各自演化中发生了复制，所以两个乳杆菌的α-淀粉酶基因既高度相似，又存在重复序列的差别[29].三个淀粉酶都包含两个功能域：催化功能域(第1-474氨基酸残基)和淀粉结合域(第475-953氨基酸残基).截掉了C-端部分生淀粉酶结合域的Lactobacillus amylovorus NRRL B-4540淀粉酶表现出完整的淀粉酶活力，但不能与生淀粉结合.催化域属于糖苷水解酶的第13家族(GH-13)，淀粉结合域(SBD)属于碳水化合物结合组件(carbohydrate-binding module)的第26家族(CBM-26).它们的催化域有99.2%的部分相同，与Bacillus subtilis、Streptococcus bovis的α-淀粉酶分别有65.5%、61.5%的部分相同.这三个淀粉酶的淀粉结合域与普通的淀粉结合域结构完全不同.乳杆菌α-淀粉酶的淀粉结合域由将近500个氨基酸残基组成，排列成串联重复结构，每个重复单位(RU)由91个氨基酸残基组成，在Lactobacillus plantarum A6和Lactobacillus manihotivorans LMG 18010中重复了4次，在Lactobacillus amylovorus NRRL B-4540中重复了5次(图1).此外，在这三个淀粉酶中，重复序列之间的侧翼序列(FR)也并不完全相同[30].在每个重复单位中，第18位的酪氨酸、第20位的酪氨酸、第32位的色氨酸对淀粉结合域与淀粉的结合具有关键的作用，其中第32位的色氨酸发生突变将导致整个淀粉结合域结合淀粉能力的丧失[31].淀粉酶的重复结构的差异导致了水解淀粉效率的差异，如Lactobacillus amylovorus NRRL B-4540的淀粉酶催化效率比Lactobacillus plantarum A6的高10倍，即使它们的催化域结构几乎完全一致.图1 乳杆菌α-淀粉酶的序列特征Fig.1 Chara cteristics of lactobacilli α-amylase sequences将Lactobacillus amylovorus α-淀粉酶基因中编码催化域(第1-474氨基酸残基)的序列导入Lactobacillus plantarum一个不产淀粉酶的菌株，重组菌株表达产物无法水解生淀粉，也不能结合生淀粉.若将淀粉结合域(SBD)中的一个或多个重复单位的编码序列导入大肠杆菌，则5个重复单位可结合不溶性淀粉，一个重复单位也可结合淀粉粒.可见，去掉催化域不影响淀粉结合域的功能，每个重复单位可作为独立的固定组件发挥作用[32].随着重复单位的数目增加，淀粉结合域(SBD)结合淀粉的能力也增加，两者之间形成一个函数关系.重复单位之间可能通过累加或协同的方式改善对生淀粉的结合性能.串联重复结构可能是乳杆菌进化过程产生的适应性，这个适应性使得乳杆菌淀粉酶提高了结合淀粉粒的能力，从而使菌株获得降解生淀粉的能力以及生存优势.与L.plantarum，L.manihotivorans的α-淀粉酶类似，Lactobacillus fermentum Ogi E1的α-淀粉酶可降解生淀粉.虽然Ogi E1的α-淀粉酶基因尚未有报道，但其氨基酸序列也有L.Plantarum、L.manihotivorans α-淀粉酶的特征，整个蛋白可分为两部分，靠近N-端的是催化活性区，靠近C-端的部分为生淀粉结合域[33].除了乳杆菌外，乳球菌、链球菌也有淀粉酶.Lactococcus lactis ctis IL 1403的基因组全序列已经测定，在基因组中存在与淀粉降解有关的基因(amyL, amyY, apu, glgP)，但是该菌株并没有淀粉酶活力.Lactococcus lactisctis B84也有这几个基因，而且编码胞内淀粉酶、胞外淀粉酶的基因amyL、amyY可检测出有表达，胞内淀粉酶的活力约为胞外淀粉酶的9.6倍，因此负责淀粉降解的主要是胞内酶[34].Lactococcus lactis IBB500有α-淀粉酶活力，其基因位于一个30 kb的质粒上.该酶的氨基酸序列与Ralstonia pickettii和Ralstonia solanacearum的高度相似，IBB500的淀粉酶基因很可能是通过水平基因转移从Ralstonia属细菌获得的[35].动物瘤胃中定居有大量的微生物，其中降解淀粉的细菌主要是Streptococcus bovis.来源于动物瘤胃的Streptococcus bovis 148有两个淀粉酶，一个是胞外的α-淀粉酶(AmyA)，可降解生淀粉和可溶性淀粉，对生淀粉的吸附与降解能力非常强.另一个是胞内的α-淀粉酶(AmyB)，不能降解生淀粉[36].Streptococcus bovis 148的两个淀粉酶基因amyA，amyB之间并无同源性[37].2.2 淀粉普鲁兰酶目前发现的产淀粉普鲁兰酶的乳酸细菌比产α-淀粉酶的菌株少. Lactobacillus plantarum L137含有15个质粒，其中一个33 kb的质粒pLTK13编码淀粉普鲁兰酶.该酶为单体蛋白，容易切割含有α-1，4-葡萄糖苷键和α-1，6-葡萄糖苷键的多糖，而对仅含α-1，4-葡萄糖苷键的直链淀粉切割作用较差[38].L137的淀粉酶基因apuA(AB369265)含6171个核苷酸，蛋白含2056个氨基酸，编码一个分子量为215，625 kDa的蛋白，在信号肽被切割后成熟的淀粉酶分子量为211537 kDa.该酶是淀粉普鲁兰酶，第316-438氨基酸区域含有高度保守的普鲁兰酶N-端催化域，第506-716氨基酸区域含有保守的淀粉酶催化域，在594-777氨基酸区域含有四个保守的α-淀粉酶功能域I、II、III、IV.其中结构域II中的Asp659、结构域III中的Glu688、结构域IV中的Asp777是执行催化功能的氨基酸残基.ApuA的氨基酸序列与其他细菌的普鲁兰酶(Thermoanaerobacter ethanolicus 39E, Clostridium thermohydrosulfuricum DSM 3783, Bacillus stearothermophilus TS-23)显示出高度的保守性，它们都有一个切割α-1,4-和α-1,4-糖苷键的双功能活性位点[39].Lactobacillus paracasei B41产生的淀粉普鲁兰酶最佳反应pH为5.0，最佳反应温度为45℃.L.casei BL23、L.casei Zhang、L.paracasei ATCC 25302虽未发现有淀粉普鲁兰酶活力，但基因组中可找到编码该酶的基因.从氨基酸序列来看，这三个菌株的一个序列“DSPYASWF”在L.paracasei B41中被替换成“YSPYDSWY”，这个区别可能是L.paracasei B41表现出酶活力的原因[40]. 2.3 麦芽糖淀粉酶Lactobacillus gasseri ATCC 33323的淀粉酶为胞内的麦芽糖淀粉酶(EC3.2.1.133)，这是乳酸细菌中发现的唯一一个麦芽糖淀粉酶.OH等根据Lactobacillus gasseri ATCC 33323的全基因组序列，分离出一个开放阅读框ORF，将其导入大肠杆菌后表达，可降解淀粉、普鲁兰、β-环糊精.该酶基因含1722个核苷酸，编码产物分子量推算为66 kDa，而酶在溶液中的分子量为211 kDa，因此可能以四聚体的形式存在.与其他细菌的麦芽糖淀粉酶不同，ATCC 33323的麦芽糖淀粉酶可水解普鲁兰的α-1,6-糖苷键，而且水解阿卡波糖的活力较低，容易受到阿卡波糖的抑制[41].值得注意的是，ATCC 33323在实验条件下并未产生淀粉酶活力，而其基因被导入大肠杆菌后表现出麦芽糖淀粉酶活力，可见按照传统筛选产淀粉酶菌株的方法并不一定能发现所需要的酶，而从基因组序列入手，克隆表达重组酶，是一个有效的手段，可以弥补这方面的不足.总的来说，与其他微生物的淀粉酶相比，现有的乳酸细菌淀粉酶研究还是较少.随着GenBank中有越来越多的乳酸细菌基因组序列公布，通过生物信息学分析，已经推测出多个可能编码淀粉酶的基因序列，因此可以肯定将会发现更多的乳酸细菌淀粉酶.3 前景展望乳酸细菌与人类的关系十分密切，可作为增进人体、动物健康的益生菌，用于发酵食品的制作.由于解淀粉乳酸细菌大多分离自发酵食品，食品中的淀粉被它们发酵后可改善食品的风味，因此它们广泛地用于木薯发酵食品(如gari、fufu、lafun、agbelima等非洲食品)、大米发酵食品的制作.乳酸细菌可产生大量乳酸，由于乳酸的聚合物聚乳酸可以被开发成环保材料，具有重要的经济价值，所以乳酸的工业生产成为乳酸细菌应用研究的主要方向.使以聚乳酸为原料制造的生物降解塑料成功取代石化塑料，关键在于进一步降低乳酸发酵的成本.乳酸细菌是乳酸发酵的主要生产菌，但一般工业所用的菌株不产淀粉酶，必须先将淀粉转变成葡萄糖才能进行发酵.解淀粉乳酸细菌可直接发酵淀粉进行乳酸发酵，实现糖化与发酵同步进行，简化了工艺，是很有前途的乳酸发酵新方法.值得一提的是，有部分乳酸细菌的淀粉酶可直接水解生淀粉，可省略掉淀粉的蒸煮工艺，降低能耗，如果提高其生产乳酸的效率，这些菌株在乳酸发酵中的应用前景将非常广阔.与利用葡萄糖进行乳酸发酵相比，目前利用淀粉转变为乳酸还存在着很大的限制，菌株生产乳酸的效率不高，乳酸发酵只能在淀粉浓度较低时进行，导致乳酸的产量较低.此外，乳酸细菌产生的乳酸会使pH有明显的下降，而乳酸细菌的淀粉酶耐酸能力普遍不强.要解决以上问题，可以通过经典的育种方法或者现代的分子生物学方法对乳酸细菌进行改造，提高其乳酸生产效率；另一方面，通过蛋白质工程手段实现淀粉酶的分子定向进化，提高其耐酸性；最后可以将其淀粉酶基因导入不产淀粉酶但乳酸产量高的菌株，构建新的工程菌，实现从淀粉到乳酸的高效转化.随着乳酸细菌淀粉酶研究的深入，必然会发现更多的新酶与基因，使研究人员从分子水平上达到透彻的了解，获得改良的高活力淀粉酶.【参考文献】[1]TSUJI H, FUKUI I.Enhanced thermal stability of poly(lactide)s in the melt by enantiomeric polymer blending[J].Polymer, 2003, 44: 2891-2896.[2]NAKAMURA L K, CROWELL C ctobacillus amylophilus, a new starch-hydrolyzing species from swine 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