α-淀粉酶发酵条件的优化

元儡轻＂Ｉ－夫掌硕士掌位论文（题目。

导师：指导小组：研究生。

摘要固态发酵生产ａ．淀粉酶的研究章克昌教授张礼星讲师吴大治卜—√固态发酵是一项既传统又面临新挑战的生物技术。

它和液体深层发酵比较，具有生产效率高，工艺操作简单，投资小，能耗低，污染少，产物后处理容易等优点。

本论文以农产品副产物麸皮为主要原料，采用解淀粉芽孢杆菌ＢＦ７６５８变异菌株为生产菌株，进行固态发酵生产ａ．淀粉酶的研究。

ｆ通过菌株的筛选驯化获得一株固态发酵生产ａ．淀粉酶的高产菌株莳４，液体摇瓶酶活为３３６Ｕ／ｍＬ，三角瓶固态发酵酶活为１３９３Ｕ／ｇ。

单因子试验后选择固态发酵优化培养基组成为：以麸皮为基础发酵培养基，添加１ｏｄｏＣａＣｌ：和２ｏＡｏ吐温．８０，自然ｐＨ，控制培养基初始含水量为６０％左右。

采用１０ｈ菌龄的液体种子接种，按种量为０．５％（ｖ／ｗ），三角瓶固态发酵３７℃培养６０ｈ产酶水平可达１１４９Ｕ／ｇ。

放大到浅盘培养过程，在原有优化培养基组成的基础上，需要控制的培养条件为：保持曲房相对湿度９０％以上，添加填充剂稻壳：麸皮比例为ｌ：２０（ｗ／ｗ），培养３６ｈ补水使培养基含水量在５５～６０％左右。

采用接种量５％（ｖ／ｗ）、１２ｈ菌龄的液体种子接种，在３７～３９℃的品温下进行浅盘培养，４８～６０ｈ后酶活平均为１３６０Ｕ／ｇ，是一般液体发酵法的３～４倍。

在上述浅盘培养优化培养基条件下测得细菌在麸皮培养基上的最大比生长速率为０．１ｌｈ一。

麸曲ａ．淀粉酶一般酶学性质为：最适作用温度为７０℃左右ｉ最适作用ｐＨ在６．０～７．０之间，≤５．０失活严重；６０℃以下酶活性稳定；ｐＨ稳定范围为ｐＨ５～９；Ｃａ２＋能显著提高酶的热稳定性和ｐ１４稳定范围。

ａ．淀粉酶麸曲粉室温保存半年后残余活力平均为８５％。

酒精生产应用试验和玉米淀粉液化试验结果也表明，麸曲ａ．淀粉酶和商业ａ．淀粉酶在使用效果上相似，但是固态发酵生产的Ⅱ－淀粉酶成本较低，在酒精发酵等行业中可以替代商业ｎ．淀粉酶使用，具有较高的经济效益和环境效益，值得进一步研究推广：ｈ。

发酵过程及优化实验——产淀粉酶细菌的优化实验淀粉酶是一类能催化淀粉糖苷键水解的酶类，作用于淀粉分子产生糊精、低聚糖及葡萄糖等多种产物。

而淀粉酶是应用最广的酶制剂之一，占全球酶工业市场份额的25%-33%。

淀粉酶广泛分布于动物、植物和微生物有机体中。

目前，已报道的能够产生淀粉酶的微生物种属包括不动杆菌属、微球菌属、黄隐球酵母、盐单胞菌属、青霉菌属、类芽孢杆菌属、链霉素属、假单胞菌属和杆菌菌属等。

实验一培养基的配置、灭菌一、实验目的1. 温故配制微生物培养基的原理及配制的一般方法、操作步骤。

2. 了解鉴别性培养基的原理，并掌握配制鉴别性培养基的放到和步骤。

二、实验原理鉴别性培养基是一类在成分中加有能与目的菌的无色代谢产物发生显色反应的指示剂，从而达到只需用肉眼辨别颜色就能方便地从近似菌落中找出目的菌菌落的培养基。

如对于淀粉酶产生菌的筛选，选用的是在含有淀粉的培养基中培养微生物，滴加碘液进行染色，若出现透明圈，则表明该菌能产生胞外淀粉酶。

三、材料和器材（1）培养基：普通培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，自来水1000mL，pH7.2~7.4。

鉴别型培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，可溶性淀粉10g，NaCl 5g，琼脂20g，自来水1000mL，pH7.2~7.4。

另一个鉴别性培养基加可溶性淀粉15g每1000ml。

（2）器皿：电子天平，烧杯，锥形瓶，量筒，培养皿，玻棒，涂布棒，移液管等。

（3）其他：药匙，记号笔，报纸等。

（4）碘原液：称取碘化钾22g，加少量蒸馏水溶解，加入碘11g，溶解后定容至500mL，贮于棕色瓶中。

稀碘液：取碘原液2mL，加碘化钾20g，用蒸馏水定容至500mL，贮于棕色瓶中。

四、方法和步骤1．配制基本培养基，分装50mL至250mL锥形瓶，供实验菌株扩增。

2．配制鉴别培养基，检测实验菌株是否能产胞外淀粉酶。

3．配制稀释用的生理盐水，分装4.5mL至每个试管（11管）。

α-淀粉酶的生产工艺设计α-淀粉酶的发酵生产工艺摘要：α-淀粉酶广泛分布于动物、植物和微生物中，能水解淀粉产生糊精、麦芽糖、低聚糖和葡萄糖等，是工业生产中应用最为广泛的酶制剂之一。

目前，α-淀粉酶已广泛应用于变性淀粉及淀粉糖、焙烤工业、啤酒酿造、酒精工业、发酵以及纺织等许多行业。

1.菌种的选育1. 1 细菌的分离与初步鉴定：将土壤系列稀释，把10-3 、10-4、10-5分别涂布到淀粉培养基上，27℃倒置培养2天，将长出的菌落接入斜面。

将细菌从斜面接种到淀粉培养基培养2天，用碘液染色，记录透明圈大小和菌落直径，计算D/d值。

保菌供下次实验用。

1．2 紫外线诱变育种：取活化后的菌种配成菌悬液、稀释；倒淀粉培养基平板，将菌悬液涂布其表面；用紫外线处理平板0、2min、4min、6min、8min、10min，每个处理2次重复；放到黑暗中倒置培养，37℃培养48h，分别计数诱变组和对照组平板上的菌落数，并计算致死率；加入碘液，分别测量诱变组和对照组菌落的透明圈直径和菌落直径，计算D/d值；将D/d值最大的菌种保存到斜面培养基上。

1.3 诱变方法以及变异菌株的筛选①诱变出发菌株在完全培养基中培养至对数生长期后期。

②以NTG为诱变剂，按一定处理剂量(μg/ml)，在一定pH值的缓冲液中30℃恒温振荡处理1~4 h。

③经高速离心分离，移植于液体完全培养基进行后培养。

④经稀释涂布在含有1%淀粉BY固体培养基上，经24 h培养形成小菌落。

⑤把单菌落分别移植于含2%淀粉BY液体培养基中，30℃培养36 h。

⑥用2#定性滤纸制成5 mm disc(小圆纸片)，并用2%琼脂BY培养基灭菌后加入较大剂量青霉素(抑菌)。

倒入200 mm×300mm长方形不锈钢玻璃培养皿中，冷却凝固。

然后把5 mm disc 纸顺序放在培养基表面。

⑦用微量注射器分别吸取培养液，移植到相应的disc上。

把disc 培养皿经37℃，24h分别培养。

α-淀粉酶水解魔芋飞粉最佳条件优化的研究
徐婷;孙天玮;周海燕;吴永尧
【期刊名称】《现代生物医学进展》
【年(卷),期】2008(008)006
【摘要】本研究采用单因素和正交试验的方法对α-淀粉酶水解魔芋飞粉的酶用量、pH值、温度、[Ca2+]和底物浓度等条件进行优化,结果表明当α-淀粉酶用量为
4u/g淀粉、pH为6.0、温度为60℃、[Ca2+]为0.01mol/L和底物浓度为8%时,水解度达20%,为最佳反应条件,研究为进一步利用α-淀粉酶水解魔芋飞粉生产燃
料乙醇奠定了基础.
【总页数】3页(P1090-1092)
【作者】徐婷;孙天玮;周海燕;吴永尧
【作者单位】湖南农业大学生化与发酵工程实验室,湖南,长沙,410128;湖南农业大
学生化与发酵工程实验室,湖南,长沙,410128;湖南农业大学生化与发酵工程实验室,湖南,长沙,410128;湖南农业大学生化与发酵工程实验室,湖南,长沙,410128
【正文语种】中文
【中图分类】S216.2;Q556+.2
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一,α-淀粉酶菌种的筛选枯草杆菌BF7658是我国应用广泛的液化型α-淀粉酶菌种，国内普遍采用深层发酵法生产工业粗酶。

我们从BF7658出发，用紫外光及化学药品反复交替诱变，选育适用于固体发酵的新菌体BF7658—1。

该菌为短杆状，革兰氏阳性，两端钝园，在肉汁表面可生成菌膜，在培养基上菌落呈乳白色，表面光滑、湿润、略有光泽，用碘液试之，菌落周围呈透明圈。

∙固体培养枯草杆菌BF7658—1生产α-淀粉酶将菌种接种于马铃薯琼脂斜面，37℃培养三天，然后转接到种子液体培养基上（豆饼粉、玉米粉、酵母膏、蛋白胨火碱、水等），摇瓶培养一定时间，当菌体进入对数生长期时，以0. 5%接种量接入固体培养基（麸皮、米糠、豆饼粉、火碱、水；ph=7左右，常压汽蒸一小时，冷却到38～40℃）在厚层通风制曲箱内，通风保持37～42℃，培养48小时出曲风干。

麸曲用1％食盐水3～4倍浸泡，3小时后过滤，调节滤液pH=8，加硫酸铵溶液沉淀酶，经离心，用浓酒精洗涤脱水，40℃烘干、磨粉即为成品。

∙深层发酵法生产α-淀粉酶斜面菌种制法同前。

将试管斜面菌种接种到马铃薯茄子饼斜面（培养基同前种子培养基），37℃培养三天，使之形成芽孢，以提高种子的稳定性。

然后接种到500升种子罐，37℃搅拌通风培养12～14小时。

当菌体进入对数生长期（镜检细胞密集、粗壮整齐、大多数细胞单独存在，少数呈链状，发酵液=6.3～6.8，酶活5～10单位∕毫升）时，乃转入10000升发酵罐，37℃，通风，搅拌，培养40～48小时。

中途三倍碳源的培养基补料，体积相当于基础料的1∕3，从培养12小时开始，每小时一次，分30余次添加完毕。

停止补料后6～8小时罐温不再上升，菌体衰老，80％形成空泡，每2～3小时取样分析一次，当酶活不再升高，可结束发酵。

而后向发酵液中添加2%CaCl2，0.8%Na2HPO4，50～55℃加热处理30分钟，以破坏共存的蛋白酶，促使胶体凝聚而易于过滤。

实验一酶的催化反应――最佳液化条件的研究一、实验目的：通过对耐高温а－淀粉酶的催化反应的温度、pH值、底物浓度、酶添加量等几个影响因素在不同水平上的实验，确定酶的最佳反应条件。

本次试验确定最佳pH 以及最佳底物浓度。

二、实验原理：液化型淀粉酶能将淀粉分子键的а－1，4－葡萄糖苷键任意切断成长短不一的短链糊精，以及少量麦芽糖和葡萄糖。

工业淀粉制糖时采用通常先液化后糖化的工艺，一般先将淀粉液液化至DE值16～18左右，再加入糖化酶进行糖化。

最佳液化条件的确定，对于节约生产成本，提高生产效率有重要的意义。

三、实验药品和器材：（一）实验药品：耐高温а－淀粉酶，淀粉（二）实验仪器：恒温水浴锅1台/组；100ml烧杯10只/组；玻璃棒4只/组；pH计4台（标准溶液），温度计1只/组，糖度计1只/组，1000ml烧杯1只/组；卫生纸1卷/2组；洗瓶1只/组；1ml移液管1只/组；吸耳球1只/组；电子天平称量纸药勺四、实验步骤：（一）最佳液化pH值的确定设计pH值5.0; 6.0; 7.0三个水平进行试验，淀粉浓度10g，加水40ml，酶添加量0.4ml，保温液化10min。

具体操作：称取淀粉10g，共4份，分别加入4只100ml的小烧杯中，再分别加入自来水40ml，用玻璃棒搅拌均匀后分别调整pH值至5.0; 6.0; 7.0三个水平，然后放到70℃下预热4～5min后（过程中要求搅拌），加入酶0.4ml，立即计时，保温液化10min（过程要求搅拌）后，立刻用糖度计测定糖度，记录实验结果。

（以下操作雷同）（二）最佳底物浓度的确定：设计淀粉浓度10％（100ml水＋10g淀粉），20％（40ml水＋10g淀粉），30％(23ml水+10g淀粉)，酶添加量0.4ml，自然pH值，70℃，保温10min。

用糖度计测定糖度，记录实验结果；具体操作：配制好以上几种溶液，放到70℃恒温水浴锅中预热5min（过程中要求搅拌），加入0.4ml酶，立即计时，保温液化10min（过程要求搅拌）后，立刻用糖度计测定糖度，记录实验结果。

基因工程菌生产耐高温α-淀粉酶发酵条件的优化α-淀粉酶是一种能够水解淀粉的酶，被广泛应用于食品、制浆造纸、医药等领域。

由于生产条件的限制，传统的α-淀粉酶生产工艺存在很大的局限性，因此需要探索新的生产技术和生产菌株。

方法：
本实验选用经过基因工程改造的高温耐受性菌株，利用筛选得到的最优菌株进行发酵生产α-淀粉酶。

通过单因素实验和正交实验优化发酵条件，包括发酵时间、发酵温度、pH值、转速等指标，寻找最佳发酵条件。

结果：
确定最佳生产菌株后，发酵条件的单因素实验结果表明，最佳发酵时间为72小时，发酵温度为60℃，pH值为7.0，转速为180转/分。

进一步经过正交实验优化，确定了最佳的发酵条件为：发酵时间72小时，发酵温度60℃，pH值7.0，转速180转/分。

结论：
通过基因工程改造的耐高温菌株生产α-淀粉酶的发酵条件已经成功优化，这为更高效、环境友好的α-淀粉酶生产提供了技术支持和理论基础，同时也为高效生产其他工业酶类开辟了新的途径。

万方数据万方数据万方数据工业生产中耐高温α-淀粉酶发酵培养基的优化研究作者：石飞虹， 周友超， 郭翠， 张灿， SHI Fei-hong， ZHOU You-chao， GUO Cui， ZHANG Can作者单位：安徽丰原生物化学股份有限公司,安徽,蚌埠,233010刊名：食品与机械英文刊名：FOOD & MACHINERY年，卷(期)：2009，25(5)被引用次数：0次1.潘风光地衣芽抱杆菌耐高温α-淀粉酶基因工程菌的研究进展 2005(02)2.郭少春.刘凯.谢林酒精专用淀粉酶的应用研讨 1999(06)3.余诗庆一种耐高温α-淀粉酶高产菌株的选育方法 2005(05)4.Aiba S.Imanska T Cloning and exprssion of the thermostable amylase gene from bacillus stearothermop hilus,in bacillus stearothermop hilus sand bacillus subtilis 1983(46)5.Rothstein D M.Cate R L Expression of a-amylase in bacillus lichemformis 1986(168)6.Sen S Hy per Expression of bacillus stearot hermophilus a-amyl-ase gene in bacillus subtilis1989(11)7.潘风光.任洪林.刘海学地衣芽抱杆菌α-耐高温淀粉酶基因的克隆及原核表达 2004(01)8.宋照军.张军合.张浩发酵型山药酸奶的生产工艺 2002(03)9.蔡奕文酵母抽提物生产工艺的优化 2003(03)10.韩春然应用回归正交法确定豆酪生产条件 2006(03)1.期刊论文郭肖红.高文远.李克峰.GUO Xiao-hong.GAO Wen-yuan.LI Ke-feng丹参不定根组织培养的研究(Ⅱ)碳源、氮源和磷源对丹参不定根培养的影响-中草药2007,38(6)目的 研究碳源、氮源和磷源对丹参Salvia miltiorrhiza不定根生长及其有效成分丹参酮ⅡA和原儿茶醛量的影响.方法 利用组织培养技术结合HPLC分析手段,通过改变培养基碳源种类和浓度、氮源和磷源浓度,研究其对丹参不定根生长和丹参酮ⅡA、原儿茶醛量的影响.结果 碳源、氮源、磷源对于不定根培养是必需的.以蔗糖为碳源,添加30 g/L蔗糖,培养20 d,不定根增殖倍数最高,60 g/L蔗糖最适合丹参酮ⅡA合成,低质量浓度蔗糖更利于原儿茶醛合成.间歇添加蔗糖至培养25 d,不定根增殖率是对照的2.3倍,丹参酮ⅡA量是对照的2.4倍.培养基NH4+和NO3-总浓度保持60 mmol/L,NH4+/NO3-为1∶4、1∶4、1∶1时分别得到最大的不定根增殖倍数、丹参酮ⅡA和原儿茶醛的量.改变培养基KH2PO4浓度时,丹参不定根生长均比对照组旺盛,但高浓度KH2PO4抑制了丹参酮ⅡA合成.结论 本实验确定了丹参不定根悬浮培养的最佳碳源种类和浓度、氮源比例和磷源浓度,表明不同碳源、氮源和磷源对丹参不定根生长和次生代谢物合成有显著影响.2.学位论文薛春梅碳源和氮源对平菇PH06菌丝生长的影响2009平菇在国际市场上产量很大，营养价值高，市场需求大，如果能不断提高平菇的产量和质量，缩短生长周期，将会有很大的理论价值，产生一定的社会效应。

一,α-淀粉酶菌种的筛选枯草杆菌BF7658是我国应用广泛的液化型α-淀粉酶菌种，国内普遍采用深层发酵法生产工业粗酶。

我们从BF7658出发，用紫外光及化学药品反复交替诱变，选育适用于固体发酵的新菌体BF7658—1。

该菌为短杆状，革兰氏阳性，两端钝园，在肉汁表面可生成菌膜，在培养基上菌落呈乳白色，表面光滑、湿润、略有光泽，用碘液试之，菌落周围呈透明圈。

•固体培养枯草杆菌BF7658—1生产α-淀粉酶将菌种接种于马铃薯琼脂斜面，37℃培养三天，然后转接到种子液体培养基上（豆饼粉、玉米粉、酵母膏、蛋白胨火碱、水等），摇瓶培养一定时间，当菌体进入对数生长期时，以0. 5%接种量接入固体培养基（麸皮、米糠、豆饼粉、火碱、水；ph=7左右，常压汽蒸一小时，冷却到38～40℃）在厚层通风制曲箱内，通风保持37～42℃，培养48小时出曲风干。

麸曲用1％食盐水3～4倍浸泡，3小时后过滤，调节滤液pH=8，加硫酸铵溶液沉淀酶，经离心，用浓酒精洗涤脱水，40℃烘干、磨粉即为成品。

•深层发酵法生产α-淀粉酶斜面菌种制法同前。

将试管斜面菌种接种到马铃薯茄子饼斜面（培养基同前种子培养基），37℃培养三天，使之形成芽孢，以提高种子的稳定性。

然后接种到500升种子罐，37℃搅拌通风培养12～14小时。

当菌体进入对数生长期（镜检细胞密集、粗壮整齐、大多数细胞单独存在，少数呈链状，发酵液=6.3～6.8，酶活5～10单位∕毫升）时，乃转入10000升发酵罐，37℃，通风，搅拌，培养40～48小时。

中途三倍碳源的培养基补料，体积相当于基础料的1∕3，从培养12小时开始，每小时一次，分30余次添加完毕。

停止补料后6～8小时罐温不再上升，菌体衰老，80％形成空泡，每2～3小时取样分析一次，当酶活不再升高，可结束发酵。

而后向发酵液中添加2%CaCl2，0.8%Na2HPO4，50～55℃加热处理30分钟，以破坏共存的蛋白酶，促使胶体凝聚而易于过滤。