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河北农业大学硕士学位论文拟南芥抗致病疫霉相关基因ACS9的功能验证及其启动子活性研究姓名：***申请学位级别：硕士专业：植物病理学指导教师：刘颖超;董金皋2009-06-11摘要乙烯作为一种植物激素，对植物种子萌发、生长发育、衰老、果实成熟、性别决定等都有着重要的影响，同时参与抵抗逆境胁迫如机械伤害、冷害、渍水、病原菌入侵等以及参与植物细胞的程序性死亡。
ACC合酶是乙烯合成途径中的限速酶，本实验室在前期研究中利用致病疫霉接种不同生态型拟南芥，初步确定ACC 合酶中的ACS9基因为抗致病疫霉相关基因。
为了深入研究ACC合酶参与抗致病疫霉的机制和信号传导途径，本试验利用反义RNA和RNAi技术对ACS9基因功能进行了初步研究。
克隆了ACS9基因上游不同长度的调控序列，并构建了GUS 表达载体，研究了该基因的表达特性。
结果如下：（1）构建了ACS9基因反义RNA和RNAi载体pCAMBIA1300-ACS9A和pCAMBIA1300-ACS9i。
将pCAMBIA1300-ACS9A和pCAMBIA1300-ACS9i载体经农杆菌介导转化拟南芥。
通过潮霉素筛选，得到了18株反义RNA转化子和13株RNAi转化子。
经PCR鉴定，外源基因已成功整合到了转基因植株的基因组中。
RT-PCR结果表明，转基因植株中ACS9基因的表达均受到不同程度的抑制，确定所得转基因植株均为ACS9基因的（反义RNA/RNAi）突变体。
（2）经RT-PCR分析发现，突变体病害防御反应中乙烯信号转导途径的下游基因PDF1.2的表达受到了抑制；对突变体进行暗培养，“三重反应”消失；突变体接种致病疫霉后表现感病症状，确定ACS9基因参与了调控拟南芥中乙烯介导的病害防御反应。
（3）用PLACE和PLANTCARE软件分析ACS9基因的启动子，发现该序列具有启动子的基本元件TATA-box和CAAT-box，此外还发现了光应答元件G-Box、GATA和刺激诱导元件MBS和LTR等多个顺式作用元件。
拟南芥细胞极性建立与维持机制的研究拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种模式植物，因其生长周期短、基因组序列完整、遗传学研究方便等优点而成为了植物学家们广泛使用的研究对象。
其中，细胞极性建立与维持机制的研究颇受关注。
细胞极性指的是细胞内某些物质在空间上的偏向性分布，即对称性破缺。
细胞极性的建立和维持对于植物发育、生长和繁殖等方面具有重要意义。
拟南芥作为模式植物，在细胞极性的研究中发挥了重要作用。
下面将介绍拟南芥细胞极性建立与维持机制的最新研究进展。
1.细胞极性建立与MATrxII蛋白Maternal effect Tripronuclear（MeT）蛋白和MATrxII蛋白是两种在拟南芥中发挥重要作用的细胞极性蛋白，在拟南芥的生殖细胞发育中起到了核心作用。
一项最近的研究发现，这两种蛋白之间存在相互作用和相互依赖的关系，共同作用于拟南芥的细胞极性建立和维持中。
具体来说，Maternal effect Tripronuclear蛋白（MeT）在拟南芥生殖细胞中表达，主要分布于胚胎细胞轴。
当它的表达量降低时，依赖于它的转录因子MEDEA的表达也会下降，因而影响了后代的发育。
而MATrxII蛋白则在花粉母细胞中表达，主要分布于花粉管生长极的细胞壁。
当它的表达量降低时，花粉管的生长极性和细胞极性也会受到影响。
这项研究提示了Maternal effect Tripronuclear和MATrxII两种蛋白在细胞极性建立过程中的重要作用。
2.细胞极性维持与植物荷尔蒙植物荷尔蒙是植物生长和发育过程中的重要调节因子。
最近的一项研究发现，拟南芥中的植物荷尔蒙赤霉素（gibberellins，GA）也参与了细胞极性维持过程中。
具体来说，这项研究观察到，在失去了细胞极性蛋白PIN1的拟南芥表型中，gibberellins的合成和信号通路存在异常。
进一步的实验证明，gibberellins的信号通路中的一个关键成员SPINDLY也参与了细胞极性的维持过程。
山西农业科学 2023，51（5）：469-477Journal of Shanxi Agricultural Sciences谷子TGA 转录因子家族全基因组鉴定与分析高倩 1，秦迎迎 2，杨致荣1（1.山西农业大学 基础部，山西 太谷 030801；2.山西农业大学 生命科学学院，山西 太谷 030801）摘要：TGA 转录因子在植物器官发育和抗病反应中发挥着重要作用。
为了探究C 4模式植物谷子TGA 基因家族成员的结构和功能，为进一步探索TGA 转录因子的生物学功能提供理论基础，以拟南芥TGA 基因家族的氨基酸序列为参考序列，从xiaomi 基因组中鉴定出16个TGA 基因，命名为SiTGA1~SiTGA16，并利用生物信息学软件对其结构和表达模式进行分析。
结果表明，SiTGAs 在9条染色体上均有分布，其中在2号和5号染色体上均含有3个基因；在3、4号和6号染色体分别分布有2个基因；在1、7、8号和9号染色体上分别仅有1个基因。
理化性质分析结果显示，SiTGAs 的二级结构主要为α-螺旋，无规卷曲次之；SiTGAs 亚细胞主要定位在细胞核。
进化关系结果显示，16个SiTGAs 分属6个亚类，这些亚家族分别含有4、4、1、5、1、1个基因，与高粱的亲缘关系最近，其中亲缘关系近的SiTGAs 的基因结构、保守基序、保守结构域具有保守性。
TGA 基因家族成员的进化关系及SiTGAs 在谷子中的表达模式结果显示，谷子TGA 基因家族在谷子的抗逆反应、抗病反应、花器官发育以及茎尖、芽尖分生组织调控和根尖干细胞群维持中起着重要作用。
关键词：谷子；xiaomi ；TGA 转录因子；基因家族；生物信息学中图分类号：S515 文献标识码：A 文章编号：1002‒2481（2023）05‒0469‒09Genome-wide Identification and Analysis of the TGA Family ofTranscription Factors in Setaria italicaGAO Qian 1，QIN Yingying 2，YANG Zhirong 1（1.Department of Basic Sciences ，Shanxi Agricultural University ，Taigu 030801，China ；2.College of Life Sciences ，Shanxi Agricultural University ，Taigu 030801，China ）Abstract ：TGA transcription factors play an important role in plant organ development and disease resistant response. In order to explore the structure and function of members of the TGA gene family of Setaria italica of C4 model plants and provide a theoretical foundation for further exploring the biological functions of TGA transcription factors, in this study, 16 TGA genes were identified from the xiaomi genome and named SiTGA1-16 using the amino acid sequence of the Arabidopsis TGA gene family as the reference sequence, and their structure and expression patterns were analyzed by bioinformatics software. The results showed that SiTGAs were distributed on all 9 chromosomes, including 3 genes on chromosomes 2 and 5. Chromosomes 3, 4, and 6 were distributed with 2 genes. There was only 1 gene on chromosomes 1, 7, 8, and 9. The results of physical and chemical property analysis showed that the secondary structure of SiTGAs was mainly α-helix, followed by random curling. Subcellular localization of SiTGAs were primarily in the nucleus. Evolutionary relationship results showed that the 16 SiTGAs belonged to six subclasses, which contained 4, 4, 1, 5, 1, and 1 genes respectively, with the closest phylogenetic relationship to sorghum. The gene structure, conserved motif and domain of SiTGAs with close phylogenetic relationships were highly conserved. Evolutionary relationship of TGA gene family members and the expression pattern of SiTGAs in Setaria italica indicated that the TGA gene family in Setaria italica played a crucial role in stress resistant response, disease resistant response, floral organ development, stem tip and bud tip meristem regulation, and root tip stem cell maintenance.Key words ：Setaria italica ; xiaomi ; TGA transcriptional factor; gene family; bioinformatics谷子（Setaria italica ）起源于我国，是我国重要的杂粮作物之一，在漫长的中国北方旱地农耕文明doidoi:10.3969/j.issn.1002-2481.2023.05.01收稿日期：2022-08-24基金项目：山西省基础研究计划（自由探索类）项目（20210302124503）；山西省高等学校科技创新项目（2021L114）；山西省优秀博士来晋工作奖励资金科研项目（SXYBKY2020010）；山西农业大学科技创新基金项目（2020BQ58）作者简介：高 倩（1996-），女，山西方山人，在读硕士，研究方向：谷子分子遗传育种。
拟南芥P_(35S)：HA-IQM2表达载体的构建与鉴定程静之;张艺能;周玉萍;黄小玲;田长恩【期刊名称】《科技视界》【年(卷),期】2016(0)18【摘要】拟南芥AT3G13600编码的IQM2含有1个IQ基序,是一个钙调素结合蛋白;其突变体表现为迟花表型,是研究钙调素信号参与成花调控的新材料;其C-端与天花粉素同源,可能具有RNA结合活性。
为了进一步获得IQM2参与成花调控的证据、研究植物体中与之结合的蛋白及其RNA结合活性,拟构建P35S:HA-IQM2植物表达载体。
克隆获得IQM2cds,利用Sal I和Sac I过渡到p MD19-Sma I-P35S-HA-Sal I-Sac I载体上,再利用Sma I和Sac I将获得的p MD19-Sma I-P35S-HA-IQM2-Sac I载体定向克隆至表达载体p BIH1上,通过PCR和酶切鉴定,证明P35SHA-IQM2表达载体已构建成功。
【总页数】2页(P67-67)【关键词】IQM2拟南芥;P35S:HA-IQM2;表达载体【作者】程静之;张艺能;周玉萍;黄小玲;田长恩【作者单位】广州大学生命科学学院植物抗逆基因功能研究广州市重点实验室【正文语种】中文【中图分类】Q943.2【相关文献】1.含35S启动子的粟酒裂殖酵母表达载体的构建及功能鉴定 [J], 王贺;王丕武;洪洋;宋冰2.拟南芥HGO基因启动子与GUS融合表达载体的构建及转化鉴定 [J], 蔡薇;支添添;任春梅3.拟南芥 CWINV1启动子 GUS 表达载体构建及转基因植株的鉴定 [J], 程姣;黄弈;任春梅4.拟南芥PJAZ1:JAZ1-GUS表达载体的构建与鉴定 [J], 黄潇;吕天晓;范甜;谢楚萍;周玉萍;田长恩5.拟南芥P35S:HA-IQM2表达载体的构建与鉴定 [J], 程静之;张艺能;周玉萍;黄小玲;田长恩因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
拟南芥基因的克隆与功能分析研究随着生命科学的不断发展和深入，基因在生物学中扮演着非常重要的角色。
基因的研究可以揭示生命的本质和演化历程，也有助于阐明疾病的发生机理、揭示人类的不同特性及其遗传规律。
而在基因研究中，拟南芥（Arabidopsis thaliana）是非常重要的模式植物，因为其基因组已经被完全解析，是目前为止研究最广泛的环境适应植物之一。
拟南芥基因的克隆是研究拟南芥基因功能的基础，也是了解拟南芥基因调控及表达的方式的重要方法。
克隆基因一般包含三步：筛选源，提取基因，插入载体。
其中，筛选源是根据已有的序列信息，设计特异性引物，将所需的基因片段扩增出来。
提取基因则需要一些特殊的技术和设备，高纯度的DNA是成功克隆的前提条件。
插入载体则是将扩增出来的目标基因插到载体上，形成所需的重组DNA，进一步研究基因功能。
在拟南芥基因的克隆中，应注意设计合理的启动子、选择正确的载体和检验克隆的准确性等问题。
在拟南芥基因的功能研究中，基因敲除或突变分析是常见的方法之一。
基因敲除即是通过RNA干扰技术或CRISPR/Cas9基因编辑技术将目标基因转录水平降低或消除，进而探究该基因在生命活动中的作用。
突变分析则是通过人工诱导或大规模筛选，寻找具有特定表型的突变体，以此推测该基因在复杂环境中的生物学功能。
这些方法的特点是操作简单、可重复性强，且能够直接揭示基因的生物学重要性。
另外，表达谱分析也是研究拟南芥基因功能的重要方法。
通过高通量测序技术和差异表达分析，可以分析不同组织、不同时期、不同生物地位下基因的表达情况及其调控机制，从而了解基因在整个生长发育过程中的调控关系。
表达谱分析还可以揭示各种生物学过程中参与的基因网络，从而为基因互作网络的构建、复杂环境下基因调控及基因功能的深入研究提供重要依据。
最近几年的研究表明，拟南芥基因在植物进化、环境适应以及生命体系发育等方面起着非常重要的作用。
例如，SLR1基因在拟南芥花器官的形态发育中扮演着重要角色。
３．实验结果与分析３．１ＡｔＲＩＮＧＦｌ基因的ｃＤＮＡ和其基因组的结构特点ＡＢＦｉｇｕｒｅ、．ＳｅｑｕｅｎｃｅａｎｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｔｈｅＡｔＲＩＮＧＦｉｇｅｎｅａｎｄｐｒｏｔｅｉｎ．ｔＡ、ＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅａｎｄａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＡ｜融ＮＧＦｉｇｅｎｅ．ＴｈｅｈｉｇｈｌｙｃｏｎｓｅｒｖｅｄｒｅｇｉｏｎｏｔＲＩＮＧＦｉｎｇｅｒｄｏｍａｉｎｉＳｂｏｘｅｄ（ＴＡＩＲｌＯＣＨＳＡｔ３９５５５３０）．饵１ＴｈｅＳｍａｒｔｄｉａｇｒａｍｄｉｓｐｌａｙｓｔｈｅｐｒｅｄｉｃｔｅｄｄｏｍａｉｎｗｉｔｈａＲＩＮＧｍｏｔｉｆａｎｄｔｗｏｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｍｏｔｉｆｓｒＣｌＡｓｃｈｅｍａｔｉｃｄｉａｇｒａｍｓｈｏｗｉｎｇｔｈｅｇｅｎｏｍｉｃｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｔｈｅＡｃＲｆＮＧＦＩｇｅｎｅｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｅｉ曲ｔｅｘｏｎｓａｎｄｓｅｖｅｎｉｎｔｒｏｎｓ．Ｂｌａｃｋｃｏｌｕｍｎｓｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｘｏｎｓ．我们实验室设计了包括Ｕ－ｂｏｘ７０个，Ｒｉｎｇｆｉｎｇｅｒ家族３５５个，共计４２８个约５０ｂｐ碱基的寡核苷酸片段，同时设计了２２个来自细菌同样长度的寡核苷酸片段作为对照，并制备了基因芯片，提取不同的胁迫处理（干旱、盐和冷）的ｍＲＮＡ并反转录成ｃＤＮＡ，与芯片进行杂交。
通过微阵列分析发现ＡｔＲＩＮＧＦｌ（Ａｔ３９５５５３０）是一个受盐和干旱诱导的基因，编码２７３ａａ的蛋白（见图ＩＡ）；用ＳＭＡＲＴ程序分析预测ＡｔＲＩＮＧＦＩ蛋白，其Ｃ一端（２１卜２５２位）具有一个保守ＲＩＮＧ指结构域（Ｃ３Ｈ２Ｃ３），其Ｎ一端具有两个跨膜区（３５—５２位，６２—８ｔ位）（见图１Ｂ）。
其ｃＤＮＡ同其基因组序列相比较，ＡｔＲＩＮＧＦｉ其基因包含８个外显子和７个内含子（见图ＩＣ）。
量：譬三譬恕忠麓”＃ｎｔ！３．２ＡｔＲＩＮＧＦｌ蛋白的体外表达及泛素反应分析ＡＢＦｉｇｕｒｅ２．Ｅ３ａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｗｉｌｄ—ｔｙｐｅａｎｄｍｕｔａｎｔＡｔＲＩＮＧＦｌ．Ａ，ＭＢＰ－ＡｔＲＩＮＧＦｌｗａｓａｓｓａｙｅｄｆｏｒＥ３ａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｔｈｅｐｒｅｓｅｎｃｅｏｆＥ１，Ｅ２ａｎｄ３２Ｐ－ｌａｂｅｌｌｅｄｕｂｉｑｕｉｔｉｎ（Ｕｂ）ａｓｉｎｄｉｃａｔｅｄ．Ｂ，ＭＢＰ－ＡｔＲＩＮＧＦｌＥ３ａｃｔｉｖｉｔｙｉｓｄｅｐｅｎｄｅｎｔｏｎｉｔｓＲＩＮＧｍｏｔｉｆ．近年来，研究发现包含环指结构域的蛋白可能具有Ｅ３泛素蛋白连接酶，能与其相适的Ｅ２结合酶的相互作用，促进其作用底物的泛素化（Ｊｏａｚｅｉｒｏ和Ｗｅｉｓｓｍａｎ，２０００）。
华大基因公司测序。
DNA marker;A,pMD19-KpnI-P JAZ1-BamHI-NcoI pMD19-KpnI-P JAZ1-BamHI-NcoI鉴定M,DNA marker;A,pMD19-BamHI-JAZ1-BamHIpMD19-BamHI-JAZ1-BamHI转化子的KpnI和NcoI对测序证实无突KpnI-P JAZ1-BamHI-NcoI和pCAMBIA1305.切,前者割胶回收约2.3kb的JAZ1具有相应酶切位点的线性化载体化大肠杆菌,经菌落PCR筛选获pCAMBIA1305.1-KpnI-PJAZ1-BamHI-NcoI 定(图3)。
注:M,DNA marker;A,P JAZ1;B,JAZ1cds;C,KpnI和NcoI双酶切;D,BamHI单酶切图3P JAZ1:JAZ1-GUS的PCR鉴定3讨论拟南芥IQM1是由AT4G33050编码的含有1个IQ 基序的钙调素结合蛋白[1]。
基因芯片分析表明,IQM1突变后,其成熟植株叶片中有4个JAZ家族基因(JAZ1、JAZ5、JAZ7与JAZ8)表达上调[3]。
前人已构建P35S:JAZ1-GUS,并构建双突变体iqm1-1×P35S:JAZ1-GUS,通过GUS染色实验得出IQM1突变使JAZ1蛋白水平降低。
为了排除35S启动子对表达模式的影响,有必要构建P JAZ1:JAZ1-GUS植物表达载体。
本研究成功了构建了该载体,在转化IQM1突变体植株,筛选获得转基因纯合子植株后,可进一步验证IQM1突变对JAZ 蛋白的影响,为IQM家族蛋白的研究提供更全面的科学证据。
【参考文献】[1]Zhou YP,Fujibe T,Wang XL,Cheng HZ,Yamamoto KT, Tian CE.Initial characterization of Arabidopsis T-DNA insertion mutants of the IQM1gene that encodes an IQ motif-containing。
拟南芥AtJ70的组织特异性表达及亚细胞定位贾宁;丁正洁;李冰【期刊名称】《河北师范大学学报：自然科学版》【年(卷),期】2011(35)3【摘要】以野生型和PAtJ70:GUS转基因拟南芥为材料,以定量PCR和GUS染色方法研究了拟南芥J-蛋白AtJ70的组织特异性表达.结果显示AtJ70基因在根、茎、叶、花和果实中都有表达,花和叶中表达最高,长角果和根中次之,茎中最低.此外,以AtJ70-mGFP4转基因拟南芥为材料,使用激光共聚焦显微镜研究了AtJ70的亚细胞定位.结果显示,AtJ70主要定位于细胞核中.【总页数】6页(P299-304)【关键词】拟南芥;AtJ70;组织特异性表达;亚细胞定位【作者】贾宁;丁正洁;李冰【作者单位】河北师范大学生命科学学院【正文语种】中文【中图分类】Q94【相关文献】1.拟南芥3个蛋白磷酸酶2C基因编码蛋白的亚细胞定位及组织表达分析 [J], 周苹;崔溢;邓克勤;郭新红;喻达时;张继红;刘选明2.拟南芥LRR-RLKs亚家族蛋白RLK6的亚细胞定位及RLK6的组织表达 [J], 阿依江·哈拜克;杨敏;韩玉珍3.拟南芥磷酸酶基因亚细胞定位与组织表达 [J], 邓克勤;郭新红;汪启明;刘选明4.细胞色素P450 CYP81A6基因在水稻中的表达：组织特异性、蛋白质亚细胞定位以及对除草剂的响应 [J], Hai-ping LU; Martin EDWARDS; Qi-zhao WANG; Hai-jun ZHAO; Hao-wei FU; Jian-zhong HUANG; Angharad GATEHOUSE; Qing-yao SHU5.海马齿Spmet基因表达产物的亚细胞定位及其组织表达特异性分析 [J], 申龙斌;李瑞梅;段瑞军;符少萍;郭建春因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
拟南芥在植物基因学中的作用植物基因学研究的开展，为我们理解植物生长和发育的分子机制提供了基础。
而拟南芥，作为植物基因学中的重要模式生物，在这方面发挥了重要的作用。
在本篇文章中，我们将详细探讨拟南芥在植物基因学中的作用。
一、拟南芥介绍拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种十字花科灌木草本植物，是目前最常用的模式植物之一。
它的生长周期短，易于培养，基因组大小适当，具有遗传多样性和组织学上的可编辑性，这些特点使得拟南芥成为植物基因学研究的优秀模式生物。
二、拟南芥在基因组学研究中的作用拟南芥的基因组大小适宜，基因数量相对较少，并且已经完成了基因组测序。
这为拟南芥的基因功能研究提供了可靠的基础。
通过对拟南芥的基因组序列进行分析和注释，我们可以很好地了解拟南芥的基因组结构和调控机制。
在此基础上，可以更深入地研究植物的发育特点和疾病防治。
例如，在拟南芥的基因组研究中，一个叫做AGAMOUS（AG）的基因被发现对于植物花器官的发育非常关键。
研究发现，在拟南芥中去除AG基因会导致雄蕊变成花瓣，从而改变花的发育。
这一实验为植物的发育研究提供了参考，也为基因工程提供了应用方向。
三、拟南芥在植物信号转导研究中的作用植物对环境的适应和应激响应是通过信号转导途径来完成的。
而拟南芥中的信号转导研究则为我们提供了研究植物内部信号传递机制的有益工具。
目前，对于拟南芥的许多信号转导途径已经被解析。
例如，在植物内源性小分子激素的研究中，IAA是一个重要的分子。
研究发现，拟南芥中的IAA调控基因家族在花芽分化等遗传过程中发挥了关键作用。
这些发现可以为其他植物信号途径的研究提供理论指导。
四、拟南芥在基因表达分析研究中的作用拟南芥中广泛应用的转录组学和蛋白质组学分析技术，则为我们提供了一种研究植物与环境相互作用的途径。
通过对拟南芥各器官和在不同环境条件下的组织的基因表达的监测，我们可以更加深入地了解植物生长和发育的调控机制。
Botanical Research 植物学研究, 2019, 8(3), 181-189Published Online May 2019 in Hans. /journal/brhttps:///10.12677/br.2019.83024Construction and Functional Assessment of a QC Specific Gene Expression System inArabidopsis thalianaYueqin Chen, Huanhuan Yan, Yujie Chen, Lihua Chen, Tian Wang, Hanma Zhang*Chongqing Key Laboratory of Molecular Adaptations of Plants, College of Life Science, Chongqing NormalUniversity, ChongqingReceived: Apr. 8th, 2019; accepted: Apr. 26th, 2019; published: May 5th, 2019AbstractQuiescent center (QC) is an important group of cells in root meristems of higher plants. It plays a key role in the regulation of root meristem function and stem cells. However, due to a lack of cell-specific gene expression tool, there is very limited understanding about gene functions within this group of cells. In this study, we constructed a QC-specific gene expression system using the promoter of Arabidopsis WOX5 gene and the synthetic GAL4-VP16-UAS transcriptional activation system. We confirmed the QC-specificity of this system using GFP as the reporter gene, and also tested its utility and effectiveness for studying gene functions using two known root stem cell reg-ulatory genes, WOX5 and FEZ. Our results demonstrate that the expression system is QC-specific and can be used to study the functions of different genes in QC cells.KeywordsArabidopsis, QC, Cell Specific Expression, WOX5, Promoter拟南芥静止中心细胞特异性基因表达系统的构建及功能验证陈月琴，严欢欢，陈玉洁，陈丽华，王甜，张汉马*重庆师范大学，植物环境适应分子生物学重庆市重点实验室，重庆收稿日期：2019年4月8日；录用日期：2019年4月26日；发布日期：2019年5月5日*通讯作者。
陈月琴 等摘要静止中心是高等植物根尖分生组织中一群重要细胞，在根尖生长点功能和干细胞调控中起关键作用。
但由于缺少静止中心细胞特异性的基因表达工具，对该细胞群中基因功能的了解非常有限。
本研究利用拟南芥WOX 5基因的启动子片段和GAL4-VP16-UAS 人工合成基因转录激活系统构建了一个可在拟南芥根尖静止中心细胞中特异性地驱动目的基因表达的转基因系统。
通过绿色荧光蛋白基因证实了该表达系统的静止中心细胞特异性，并用两个已知根干细胞调控基因WOX 5和FEZ 检测了该表达系统用于研究静止中心基因功能的可行性及功效。
研究结果表明所构建的表达系统具静止中心细胞特异性，可用来研究不同调控基因在该细胞群中的功能。
关键词拟南芥，静止中心，细胞特异性表达，WOX 5，启动子Copyright © 2019 by author(s) and Hans Publishers Inc.This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY)./licenses/by/4.0/1. 引言静止中心是高等植物根尖分生组织的控制中心，位于细胞分裂区和根冠区之间，由一群分裂缓慢的细胞所构成。
在模式植物拟南芥中，静止中心通常含4个细胞，其外被一圈干细胞所包围[1]。
这些干细胞通过定期分裂进行自我更新，并同时为根中各组织提供生长发育所需的新细胞来源。
静止中心细胞在根尖干细胞的维持和调控中担负重要作用，它们一方面提供维持干细胞特性所需的调控信号，如果任何一个静止中心细胞死亡或功能丧失，会导致与其直接接触的干细胞分化和失去干细胞特性[2]。
另一方面，当干细胞受损时静止中心细胞通过分裂补充新的干细胞，行驶其干细胞修复功能[3]。
由于静止中心细胞在根干细胞及根尖分生组织调控中的重要作用，其自身的调控也是植物学研究，特别是植物发育学研究的一个重要对象。
经多年研究，目前已经发现了一大批参与根尖分生组织和根干细胞调控的基因，如WUSCHEL-RELATED HOMEOBOX 5 (WOX 5) [4]，SHORTROOT (SHR ) [5]，SCARECROW (SCR) [6]，PLETHORA s (PLT 1/2/3) [7]，FEZ [8]，RETINOBLASTOMA-RELATED (RBR ) [9]，ACR 4 [10]等。
但由于其中大多数基因在多种细胞类型中表达，它们在静止中心细胞中的具体功能目前并不十分清楚。
WOX 5是目前已知的参与根干细胞调控基因中唯一在静止中心细胞特异性表达的基因。
它编码一个同源异型域(homeobox)转录因子家族蛋白，该家族的成员在动植物中广泛分布。
WOX 5与茎尖分生组织中的干细胞调控基因WUSCHEL 同属于一个植物所特有的亚家族，且在功能上可相互替代。
WOX 5功能缺失导致柱干细胞分化和静止中心细胞分裂[4]，而其过量表达可在静止中心下方诱导产生多层未分化细胞。
现已查明WOX 5在静止中心细胞的特异性表达由其编码序列5’端上游的启动子决定[4]。
本研究旨在利用WOX 5启动子构建一个在拟南芥根尖静止中心细胞中驱动不同目标基因特异性表达的系统，为在该细胞群中开展基因功能研究奠定基础。
该表达系统包含两套独立的载体，即驱动载体和目标基因表达载体。
驱动载体含WOX 5启动子和人工合成转录激活因子GAL4-VP16的编码序列。
目标基因表达载体中包含有带多个GAL4结合位点的UAS 启动子和目标基因的编码序列。
该基因表达系统的陈月琴等特色是它可以用来驱动不同目标基因在静止中心细胞中表达。
2. 材料与方法2.1. 实验材料拟南芥(哥伦比亚)野生型和GAL4-GFP增强子诱捕转化株系(Enhaner trap lines)的种子从诺丁汉欧洲拟南芥种质资源中心()获得。
35SSGVG/UAS::WOX5转基因株系[4]的种子和pFP101载体分别由日本奈良科技大学(Nara Institute of Science and Technology) Keiji Nakajima教授和法国格勒诺布尔大学(Université Grenoble Alpe) François Parcy 教授赠与(rs-gif.fr/jg/alligator/vectors.html)。
大肠杆菌菌株DH5α，限制性内切酶及其它分子生物学试剂或试剂盒购自Takara 公司()。
根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株LBA4404购自天根生化科技有限公司()。
引物合成和测序服务由上海Invitrogen生物技术有限公司()或北京擎科新业生物技术有限公司()提供。
2.2. 种子消毒及植物的培养与生长条件拟南芥种子用10%体积的次氯酸+ 90%体积的纯酒精混合溶液消毒，浸泡10分钟后用酒精洗3~4遍，在无菌台吹干后用无菌牙签点种于用1% (w/v)琼脂固化的1/2 MS培养基上，置于22℃，16 h光照/8 h黑暗的培养箱中萌发。
用于显微观察的幼苗留在上述培养箱中直到观察期结束。
用于转化，杂交和种子扩繁或转基因位点纯化的幼苗，萌发或观察结束后移栽至营养土中(PINDSTRUOP)，置于22℃，16 h 光照/8 h黑暗的植物生长室中生长。
2.3. 载体构建pFP101载体改造：在构建本研究需要的表达载体前，我们先对pFP101进行了改造，具体细节如下：用Hind III + Xba I对pFP101质粒进行双酶切，经电泳和胶回收后，用T4连接酶插入一个人工合成的多克隆位点，改造后的载体命名为pFPL，其中(从5'开始依次)含Hind III，Bgl II，Apa I，Sac I，Sac II，Spe I，Xho I，Xba I，Bam HI，Sal I，Pst I单酶切克隆位点，同时失去了原来载体中的CaMV35S启动子(图1(A))。
驱动载体pFP-WOX5p::GAL4-VP16的构建：以拟南芥(哥伦比亚)野生型基因组DNA为模板，用表1中所列的相关引物通过PCR扩增获得一个4.6 kb的WOX5基因的启动子片段，用In-Fusion无缝克隆方法(In-Fusion HD Cloning Kit，Takara-Clontech)将其从Bgl II位点插入pFPL，形成的中间载体经测序验证后，再从Bam HI位点插入GAL4/VP16的编码序列，后者从GAL4-GFP增强子诱捕转化株系J1511的基因组DNA扩增获得，建成的载体命名为pFP-WOX5p::GAL4-VP16 (图1(B))。
目标基因表达载体构建：本研究构建了3个目标基因表达载体，即pFP-UAS::GFP, pFP-UAS::WOX5-GR和pFP-UAS::FEZ-GR (图1(B))。
其中的UAS启动子由J1511基因组DNA扩增而来，用In-Fusion克隆方法将其插入pFPL的Bgl II位点，形成中间载体pFP-UAS。
