植物细胞工程总结

绪论1, 细胞工程：是应用细胞生物学和分子生物学方法，借助工程学的实验方法或技术，在细胞水平上研究改造生物遗传特性和生物学特性，以获得特定的细胞、细胞产品或新生物体的有关理论和技术方法的学科。

广义的细胞工程包括所有的生物组织、器官及细胞离体操作和培养技术。

狭义的细胞工程是指细胞融合和细胞培养技术。

根据研究对象的不同，高等生物的细胞工程分为动物细胞工程和植物细胞工程。

动物细胞工程包括细胞培养技术（包括组织培养、器官培养），细胞融合技术，胚胎工程技术（核移植、胚胎分割等），克隆技术（单细胞系克隆、器官克隆和个体克隆）。

植物细胞工程包括植物组织、器官培养技术，细胞培养技术，原生质体融合与培养技术，亚细胞水平的操作技术等。

2, 植物细胞工程：以植物组织细胞为基本单位，在离体条件下进行培养、繁殖或人为的精细操作，使细胞得某些生物学特性按人们的意愿发生改变，从而改良品种或创造新物种，或加速繁殖植物个体，或获得有用物质的过程称…植物细胞工程的应用：1，利用细胞融合技术，克服远缘杂交不亲和性。

2，利用培养变异，筛选优良的突变体。

3，倍性育种，缩短育种年限。

4, 离体种质保存。

5, 细胞培养生产有用的物质。

第二章一，实验室设置及内部设备实验室建设应考虑的问题： 1、实验的性质 2、实验室的规模细胞工程实验室: 基本实验室:准备室、无菌操作室、培养室贮藏室辅助实验室：细胞学实验室、生化分析实验室温室1、准备室完成所使用的各种药品的贮备、称量、溶解、配制、培养基分装及高压灭菌；器皿、材料的洗涤等工作。

主要设备纯水器工作台药品厨天平电磁炉冰箱玻璃器皿酸度计高压灭菌锅干燥箱等2、无菌操作室（接种室）用于植物材料的消毒、接种、培养物的转移、原生质体的制备以及一切需要进行无菌操作的技术程序。

接种室应用推拉门，设有缓冲间，面积2m2为宜。

进入接种室前更衣换鞋，减少带入接种室杂菌。

接种室主要设备超净工作台：每次实验前要用紫外灯灭菌20min，关掉紫外灯开始工作，工作过程中注意一直开着吹风机。

无菌操作用具：离心机细胞融合仪3、培养室用于接种材料的培养。

培养室的大小可根据需要培养架的大小、数目、及其他附属设备而定。

其设计以充分利用空间和节省能源为原则。

控制：温度、光照、湿度。

培养室主要设备：培养架空调时控器自动开灯、关灯温度自动记录仪摇床二，培养基1，培养基的种类培养基根据其态相不同分为固体培养基与液体培养基。

根据培养物的培养过程，培养基分为初代培养基和继代培养基。

根据作用不同，培养基为诱导培养基、增殖培养基和生根培养基。

根据营养水平不同，培养基分为许多种,常用如下：（1） MS培养基：富盐平衡培养基（还有LS、BL、ER）特点: ①无机盐浓度较高，元素比例合适，是较稳定的平衡溶液；②微量元素种类齐全；③营养丰富。

（2）B5培养基：高硝态氮培养基（还有N6和SH培养基）特点: ①硝酸钾含量高；②氨态氮含量低；③ VB1含量较高。

（3）N6培养基：高硝态氮培养基特点：硝态氮含量高，氨态氮含量较低。

（4）White培养基：低盐培养基（还有WS、HE、改良Nitsch等特点：无机盐含量低，有机成分也很低，适于生根培养。

（5）KM-8P培养基：特点:有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素，广泛用于原生质融合的培养。

培养基成分：水无机盐有机成分植物激素培养物支持材料辅助性物质2，植物激素的应用规律①先Aux后CKs处理,有利于细胞分裂但不利于细胞分化。

容易产生多倍体细胞（核分裂和胞壁形成不同步所至）， cks有利于胞壁形成。

②先CKs 后Aux处理，细胞分裂也分化(可能是内源生长素起作用)③ Aux 和CKs 同时处理，分化率提高。

Aux与CKs的比值改变形态建成的方向。

高有利根分化，抑制芽形成；Aux / CKs 适中促进愈伤组织生长；低有利芽分化，抑制根形成；在组织培养中生长调节物质的使用浓度，因植物的种类、部位、时期、内源激素等的不同而异, 培养基配制：1、确定配方 2、移母液 3、定容 4、称蔗糖 5、调PH值（用0.1MNaOH 或HCl调PH值为5.8） 6、培养基熬制（加琼脂） 7、分装（100ml的三角瓶约装入30－40ml, 30瓶/L）8、扎口 9、灭菌 10、接种三，植物材料灭菌灭菌方法①.培养基灭菌：高压湿热灭菌，某些激素采用过滤灭菌②.玻璃器皿灭菌：干热灭菌：150℃ 40min;120℃ 2h，湿热灭菌：121℃, 30min接种前用酒精棉球擦试，并在酒精灯火焰上灼烧灭菌。

③.接种工具灭菌：用前干热灭菌，用前湿热灭菌，接种前用酒精棉球擦试，浸入95%酒精液中，并在酒精灯火焰上灼烧灭菌。

电热石英砂灭菌器④.实验服、口罩灭菌：湿热灭菌⑤.接种室灭菌：紫外灯照射(接种室、超净台)：波长260nm，距离小于1.2m，15-20min。

臭氧灭菌机：1-2h,熏蒸灭菌：(5-8ml甲醛+5g高锰酸钾)/ m3 ,接种台喷雾消毒：75%酒精。

⑥.培养室灭菌 :新建培养室用前要彻底熏蒸1次。

隔1周用洗衣粉水或来苏水拖地1次，用高锰酸钾擦架1次。

⑦.物体表面灭菌:灭菌方式：喷雾、涂抹杀菌 ,范围：超净台的台面和四壁、双手消毒剂：70%酒精；1-2%来苏水；1%新洁尔灭等。

⑧.接种材料消毒: A,取材营养器官：根、茎尖、茎段、叶片等生殖器官：胚胎（胚、胚珠、胚乳等）和花药等外植体〔explant〕：从植物体上分离下来的用于离体培养的材料外植体灭菌用化学灭菌剂灭菌消毒步骤：①流水冲洗或洗衣粉漂洗②用化学灭菌剂浸润消毒通常：70%酒精30S，0.1%升汞4-10min。

表面有较厚蜡质层的的可加吐温-20或吐温-80等浸润剂(灭菌液的0.5%)。

③无菌水冲洗3-5次。

注：灭菌液要浸没材料第三章植物细胞全能性与形态发生一、植物细胞全能性(totipotency)：植物体每个正常细胞都含有该植物的全部遗传信息，在适宜的条件下如同受精卵一样, 具有发育成完整植株的潜在能力。

细胞分化〔cell differentiation〕指由于细胞分工而导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在发育方式改变的过程。

细胞脱分化〔cell dedifferentiation〕培养条件下使一个已分化的细胞失去已分化细胞的典型特征，或消除了细胞分工，使之回复到分生细胞状态或胚性细胞状态的过程。

或具有特异结构和功能的细胞转化成没有特异结构和功能的细胞的过程。

愈伤组织〔callus〕植物离体培养过程中脱分化后的细胞，经过细胞分裂，产生的无组织结构、无明显极性、松散的细胞团称为愈伤组织。

多在外植体切面上产生。

愈伤组织的特征：细胞分裂快，结构疏散，缺少有组织的结构，颜色浅而透明。

成功地脱分化将导致细胞分裂，形成愈伤组织或胚性细胞团。

植物胚胎干细胞：植物连续的器官分化是由顶端分生组织细胞发育而成，因此，植物顶端分生组织细胞具有较强的表达全能性的能力，被称为植物胚胎干细胞。

生理脱离效应;当细胞或组织脱离母体以后，在适宜的条件下将进行一些特殊的发育方式，如再生、复壮等，child将其称为生理脱离效应（细胞）或（组织）与母体分离和激素的调控是细胞全能性表达的前提。

在离体培养条件下，细胞全能性的表达是通过细胞脱分化和再分化实现的。

脱分化是细胞全能性的表达前提，再分化是细胞全能性的表达最终体现。

静止细胞(G0细胞)启动分裂是分化细胞成功脱分化的重要标志。

细胞脱分化的三个阶段：1，启动阶段细胞质增生并开始向细胞中央伸出细胞质丝，液泡蛋白出现。

2，演变阶段细胞核向中央移动，质体转变为原质体 3，脱分化终结期，回复到分生组织。

细胞再分化〔redifferentiatio〕脱分化后无序生长的分生细胞在离体培养下，重新恢复细胞分化能力，经过细胞分化、组织分化和器官分化递进地进行，最后再生完整植株。

极性(polarity)：植物的器官、组织、甚至单个细胞在不同的轴向上存在的某种形态结构以及生理生化上的梯度差异。

细胞的不均等分裂是细胞极性建立的标志（即细胞分化的标志）。

激素在植物生长发育中具有重要的调控作用，也是离体培养条件下，调控细胞脱分化和再分化的主要因素。

其中生长素和细胞分裂素是两类主要的调控培养条件下细胞生长和分化的植物激素。

在离体培养条件下TEs则由愈伤组织薄壁细胞分化形成这是愈伤组织细胞分化器官的前提。

植物的离体器官发生：培养条件下的组织或细胞团（愈伤组织）分化形成不定根、不定芽等器官的过程。

离体培养中器官发生的方式通过器官发生形成再生植株大体上有3种方式：①先芽后根:是应该选择的方式.②先根后芽③根芽同长植物细胞经再分化形成植株有2条途径：（在离体培养条件下）器官发生体细胞胚胎发生体细胞胚（胚状体、体胚）：指离体培养下没有经过受精过程，但经过了胚胎发育过程所形成的胚的类似物。

胚状体有以下几方面的界定：①体细胞胚是离体培养的产物，只限于在离体培养范围使用，以区别于无融合生殖胚；②体细胞胚起源于非合子细胞，以区别于合子胚；③体细胞胚经过了胚胎发育过程，以区别与离体培中器官发生形成个体的途径。

经过愈伤组织的胚胎发生需要3个培养阶段：①诱导外植体形成愈伤组织；②诱导愈伤组织胚性化，③体细胞胚形成。

体细胞胚的结构与发育特点1、与器官发生途径相比，体细胞胚在组织学上有3个特征：①体细胞胚最根本的特征是具有双极性，即在发育的早期阶段从方向相反的两端分化出茎端和根端，而不定芽或不定根都是单极性的；②体细胞胚的维管组织与外植体现存组织无解剖结构上的联系，而不定根或不定芽与外植体或愈伤组织的维管组织有联系。

③体细胞胚胎的维管组织分布是独立的Y字形结构，不定芽维管组织无此结构。

人工种子：（狭义）植物离体培养中产生的体细胞胚，包裹在含有养分和具有保护功能的物质中，并在适宜条件下能够发芽出苗的颗粒体。

（广义）在体细胞胚、微型营养变态器官、不定芽等微繁体之外加上必要的营养成分后，用具有一定通透性而无毒的材料将其包裹起来，形成的与天然种子相似的颗粒体。

第四章离体培养下的遗传与变异离体培养中的遗传与变异特点：1、普遍性：变异可发生在各种培养类型中；变异发生在各种植物的培养中；变异发生与培养类型有关。

2、局限性：一些单基因控制的性状不仅发生隐形突变，也发生显性突变。

3、嵌合性：是指同一有机体中同时存在有遗传组成不同的细胞它是组织培养中常见的现象。

体细胞变异诱导材料的选择：其一，目标性状的可行性。

体细胞突变的频率虽然较高，但对于某一个体来讲，变异的性状是个别的，因此选择综合性状良好的植物品种材料，通过诱变改变个别不良性状，是体细胞突变系选择的目的。

其二，必需充分考虑试验植物的细胞培养技术水平，只有对起始材料有良好的培养技术，才有可能制定完满的诱变及选择方案。